实验七、 鸡马立克氏病的琼脂扩散试验
王晓泉 刘慧谋
一． MD诊断依据 二． MD琼脂扩散试验检测
技术
三． 目的和原理
四、材料 五、 方法与步骤
一、MD诊断依据
• MD是高度接触传染性的，在商业鸡群中几 乎是无所不在，但在感染鸡中仅有一小部 分发生MD，此外，接种疫苗的鸡虽然能得 到保护不发生MD，但仍能感染MD强毒， 因此是否感染MDV不能作为诊断MD的标准。 主要依据临诊症状和病理变化。血清学和 病毒学方法可用于鸡群感染情况的监测， 可以作为MD的诊断参考依据。
二、 MD琼脂扩散试验检测技术
鸡马立克氏病琼脂扩散试验既可以用于马 立克氏病病毒抗原的检出，也可以用于马 立克氏病病毒抗体的检出。该方法一般在 马立克氏病病毒感染14d～24d后检出病毒 抗原；抗体的检出一般在病毒感染3周后。
三、目的和原理
目的： 熟悉鸡马立克氏病的诊断方法 原理： 可溶性抗原与相应抗体结合（在固体琼脂 中）后,在适量电解质存在下，经过一定时 间形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应。
四、材料
琼脂平板、打孔器、针头、移液器、枪头、 MD标准阳性血清、MD标准琼扩抗原、待 检羽髓 • 家禽免疫球蛋白在8%NaCl凝胶中试验效果 好
五、 方法与步骤
血清学试验 琼脂扩散试验
马立克氏病病毒抗原检测 马立克氏病抗体检测
马立克氏病病毒抗原检测
(1)浇1%琼脂板：称1g琼脂粉、8 gNaCl，加适量蒸馏水融 化后定容至100ml蒸馏水，加热煮沸维持3min ，每直径 90mm培养皿注入20ml，平放凝固即可。 (2)打孔：用打孔器在琼脂平板上对照标准打孔图纸打孔，中 央打1个孔,周围再打6个孔（孔径4mm，孔距3mm），形 成梅花形图案。用针头挑出孔内琼脂,注意不要挑破孔缘。 (3)封底：用平底针头在火焰上烧烫使孔周围的琼脂少许熔化 以封底，以免加样后液体从孔底渗漏 (4)加样：在中央孔加MD阳性血清，向周边1孔加标准MD琼 扩抗原，2、3、4 、5、6孔加待检羽髓浸液（待检羽髓10 余根加数滴生理盐水在EP管内挤压，浸泡），每孔约加 20μl，以加满为度。 2、3、4 、5、6孔也可不打孔直接 插待检羽髓 (5)加完后，盖上平皿盖，置湿盘中，在37℃下自由扩散24 小时。。
马立克氏病抗体检测
• 操作方法同上，加样如下：用微量移液器 吸取标准抗原液(按产品使用说明书的要求 稀释)滴入中央孔，标准阳性血清分别加入 外周的第1孔中，待检血清按顺序分别加入 外周的第2、3、4、5、6孔中。加样时不要 产生气泡，每孔均以加满不溢出为度，每 加一个样品应换一个吸头。
1.双扩散用于疾病诊断： 以MD诊断为例，中心 孔加MD标准阳性血 清，
周围孔分别加MD 标准抗原、生理盐水、 待检抗原。 2.双扩散用于抗体检测： 以免疫鸡MD抗体检测 为例，中心孔加MD标 准抗原，周围孔分别加 MD标准阳性血清.、 MD阴性血清、待检血 清 M。
结果判定
• 被检样品孔（血清或抗原）与中心孔之间 形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原或 血清的沉淀线互相融合者，判为阳性（每 只鸡待检羽髓只要有1根为阳性即判为阳性 鸡）；不出现沉淀线的判为阴性。
1. 1～6孔为待检MD抗原；2. 7孔为MD标准抗体
注意事项
1） 在平皿上贴好标签做好标记,在记录本 上做详细记录，防止弄混。 2） 挑琼脂时注意不要挑破琼脂边缘。 3） 封底要充分。 4） 加样时,注意不要产生气泡,以加满为度, 否则影响反应结果。每孔约加20μl，以加 满为度。插待检羽髓时周边2、3、4 、5、 6不打孔，但要对照标准图纸中间插入。 5） 每加完不同的样后要更换枪头，以免造 成污染。
实验七、 鸡马立克氏病的琼脂扩散试验
王晓泉 刘慧谋
一． MD诊断依据 二． MD琼脂扩散试验检测
技术
三． 目的和原理
四、材料 五、 方法与步骤
一、MD诊断依据
• MD是高度接触传染性的，在商业鸡群中几 乎是无所不在，但在感染鸡中仅有一小部 分发生MD，此外，接种疫苗的鸡虽然能得 到保护不发生MD，但仍能感染MD强毒， 因此是否感染MDV不能作为诊断MD的标准。 主要依据临诊症状和病理变化。血清学和 病毒学方法可用于鸡群感染情况的监测， 可以作为MD的诊断参考依据。
二、 MD琼脂扩散试验检测技术
鸡马立克氏病琼脂扩散试验既可以用于马 立克氏病病毒抗原的检出，也可以用于马 立克氏病病毒抗体的检出。该方法一般在 马立克氏病病毒感染14d～24d后检出病毒 抗原；抗体的检出一般在病毒感染3周后。
三、目的和原理
目的： 熟悉鸡马立克氏病的诊断方法 原理： 可溶性抗原与相应抗体结合（在固体琼脂 中）后,在适量电解质存在下，经过一定时 间形成肉眼可见的沉淀物,称为沉淀反应。
四、材料
琼脂平板、打孔器、针头、移液器、枪头、 MD标准阳性血清、MD标准琼扩抗原、待 检羽髓 • 家禽免疫球蛋白在8%NaCl凝胶中试验效果 好
五、 方法与步骤
血清学试验 琼脂扩散试验
马立克氏病病毒抗原检测 马立克氏病抗体检测
马立克氏病病毒抗原检测
(1)浇1%琼脂板：称1g琼脂粉、8 gNaCl，加适量蒸馏水融 化后定容至100ml蒸馏水，加热煮沸维持3min ，每直径 90mm培养皿注入20ml，平放凝固即可。 (2)打孔：用打孔器在琼脂平板上对照标准打孔图纸打孔，中 央打1个孔,周围再打6个孔（孔径4mm，孔距3mm），形 成梅花形图案。用针头挑出孔内琼脂,注意不要挑破孔缘。 (3)封底：用平底针头在火焰上烧烫使孔周围的琼脂少许熔化 以封底，以免加样后液体从孔底渗漏 (4)加样：在中央孔加MD阳性血清，向周边1孔加标准MD琼 扩抗原，2、3、4 、5、6孔加待检羽髓浸液（待检羽髓10 余根加数滴生理盐水在EP管内挤压，浸泡），每孔约加 20μl，以加满为度。 2、3、4 、5、6孔也可不打孔直接 插待检羽髓 (5)加完后，盖上平皿盖，置湿盘中，在37℃下自由扩散24 小时。。
马立克氏病抗体检测
• 操作方法同上，加样如下：用微量移液器 吸取标准抗原液(按产品使用说明书的要求 稀释)滴入中央孔，标准阳性血清分别加入 外周的第1孔中，待检血清按顺序分别加入 外周的第2、3、4、5、6孔中。加样时不要 产生气泡，每孔均以加满不溢出为度，每 加一个样品应换一个吸头。
1.双扩散用于疾病诊断： 以MD诊断为例，中心 孔加MD标准阳性血 清，
周围孔分别加MD 标准抗原、生理盐水、 待检抗原。 2.双扩散用于抗体检测： 以免疫鸡MD抗体检测 为例，中心孔加MD标 准抗原，周围孔分别加 MD标准阳性血清.、 MD阴性血清、待检血 清 M。
结果判定
• 被检样品孔（血清或抗原）与中心孔之间 形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原或 血清的沉淀线互相融合者，判为阳性（每 只鸡待检羽髓只要有1根为阳性即判为阳性 鸡）；不出现沉淀线的判为阴性。
1. 1～6孔为待检MD抗原；2. 7孔为MD标准抗体
注意事项
1） 在平皿上贴好标签做好标记,在记录本 上做详细记录，防止弄混。 2） 挑琼脂时注意不要挑破琼脂边缘。 3） 封底要充分。 4） 加样时,注意不要产生气泡,以加满为度, 否则影响反应结果。每孔约加20μl，以加 满为度。插待检羽髓时周边2、3、4 、5、 6不打孔，但要对照标准图纸中间插入。 5） 每加完不同的样后要更换枪头，以免造 成污染。