【摘要】 50多年前sorrentino 第一次用机械的 方法 把新鲜肝组织制成匀浆，并在体外进行药物实验，开创了肝脏功能的体外人工支持 时代 。berry 和friend 等在1969年用自己配置成的消化液进行大鼠肝灌注第一次完整分离肝细胞。几十年来，肝细胞的分离培养及保存技术不断优化并为相关的肝脏 研究 和肝脏疾病的 治疗 提供了极为宝贵的途径。尤其是近年来肝细胞移植的实验和临床 应用 不断取得进展，为肝脏疾病的治疗展现了诱人的前景。优化和完善肝细胞的分离，培养和保存，仍然是关系到肝细胞移植效果的前提。近年来，不少的研究者正致力于临床的应用研究。根据所收集到的 文献 报道，世界各大医学中心 目前 已有近80例肝细胞移植的临床应用，其结果令人鼓舞。可以预测，肝细胞移植作为整体器官移植的“桥梁”或替代治疗，将给众多肝病患者带来福音。本文就近年来肝细胞移植的临床应用研究进展作一综述。
【关键词】 肝细胞 分离 细胞培养 移植 临床应用
肝脏是机体最重要的器官之一，在生理和病理状态下，它是能量代谢、解毒以及血浆蛋白合成的中心。当发生急性肝功能衰竭时，只有15%～25%的病人得以生存［1］。许多慢性肝脏疾病如肝硬化、肝癌等也最终导致肝脏功能的衰竭。长期以来，国内外学者注重于肝器官移植的研究, 因为肝移植疗效显著，1年存活率可达70%以上。但肝移植对技术条件、适应证及组织相容性等要求较高, 加之肝供体的短缺，使肝移植的临床应用严重受限。因此，临床上急需其他方法，作为“桥梁”来缓解和改善肝功能，延长患者的生存时间，而等待肝移植，甚至取代肝移植。由此，肝细胞移植及生物人工肝的研究成为热点［2,3］。不管是肝细胞移植或生物人工肝，肝细胞的分离、培养和保存是肝细胞临床应用的基石。就肝细胞分离培养和保存尤其是肝细胞移植的临床应用研究进展现综述如下。
1 肝细胞分离培养与保存
1.1 肝细胞的来源
1．1.1 人肝细胞 人类肝脏细胞是最好的供体，因为肝脏细胞分化较高，有较好的合成和代谢功能［4］ ，因此肝细胞移植首选人肝细胞。但由于供体的严重短缺，目前用于肝细胞移植的供体多为不适于肝移植供体（untransplantable liver ），如脂肪肝、纤维化肝、受外伤肝等，这些细胞体外培养增殖困难，肝细胞功能效果不理想。胎肝细胞（fetal liver cell ，flc ）在体外可以扩增，在刺激下可分化，免疫原性弱。取自妊娠26周和34周引产的胎肝细胞, 检测其活性为95%, 代谢能力为成人的75%［5］ 。但其来源也很受限，且存在伦理 问题 。
1．1.2 动物肝细胞 为解决供体缺乏的问题，多年来研究者正致力于异种肝细胞移植的研究。动物肝细胞来源广泛，分离简便，效果可靠，donato 等［6］测定了人肝细胞、猪肝细胞、犬肝细胞、兔肝细胞、鼠肝细胞等钆细胞中细胞色素p450的含量及代谢能力，猪肝细胞和人肝细胞的代谢功能最接近。然而异种移植用于临床仍有许多问题待解决。其一，猪肝细胞的内源性逆转录病毒感染受体，其安全性须进一步研究。其二，动物肝细胞不可能替代人类血浆蛋白合成酶活性，并存在有种间的特异性差异, 并且异基因蛋白和酶进入到血循环中也能产生副作用［7］；为避免这种差异反应，病人血液和动物肝细胞之间必须有安全屏障, 即半透膜的存在。故目前动物肝细胞多作为生物人工肝的生物成分而起作用［8］。
动物实验证实, 肝干细胞在急性肝损伤时参与了肝脏肝细胞的再生和修复，并发挥了至关重要的作用，这样使肝干细胞移植用于临床治疗急性肝衰竭及肝代谢性疾病成为可能［11］。但肝干细胞用于临床还有许多问题待解决，诸如肝干细胞在体外的鉴别、分离、培养及筛选，干细胞的多向分化潜能及可塑性这一生物学现象的发生和调控机制仍不清楚，干细胞移植的数量，移植后在体内的归巢及定位等。相信随着研究的深入，肝干细胞希望能代替肝细胞的作用并应用于临床治疗。
1.2 肝细胞的分离和培养
1.2.1 肝细胞的分离 1969年，berry 和friend 等人用无钙的平衡盐、胶原酶和透明质酸酶配置成的消化液进行大鼠肝灌注，获得到肝细胞。之后，seglen 创立了两步灌流法，即首先灌注预热的无钙的平衡盐溶液去除肝血窦内的血细胞及部分非实质细胞，然后再灌注含有胶原酶的平衡盐溶液，进行体外消化后，分离提纯而获得肝细胞。目前，国内外动物和人类肝细胞的分离方法都是在此基础上改良的。
1.2.2 肝细胞的培养 肝细胞属高度分化类上皮细胞，对生存环境有着极高的要求，如培养液的温度、ph 值、渗透压、co2含量、促肝细胞生长物质及血清浓度等，是 影响 肝细胞活性的重要因素；肝细胞与基质、肝细胞与非实质细胞的接触对肝细胞的生长和活性也起着极为重要的作用［13］。肝细胞的培养须考虑到这些方面的问题。
2 肝细胞移植的临床应用
2.1 肝细胞移植途径 与肝移植相比，肝细胞移植简单易行，可通过微创手术或介入置管完成。目前主要的移植部位有：（1）门脉或肝内移植：从生理环境到细胞环境，肝脏是肝细胞的最佳生活空间。肝脏的组织结构，门脉血供的营养物质和生长因子以及激素，使得移植的肝细胞在不改变微结构的情况下与受体肝组织融合，肝功能能得到代偿。使用本途径较为安全，是较为常用的方法［21］，但偶会出现门脉高压及肺栓塞的风险。（2）脾内移植：脾内网状组织有俘获和保护移植肝细胞不被吞噬细胞吞噬的作用，有利于细胞着床。同时脾内丰富的血供也为肝细胞的长期存活、增殖提供了有利条件。进一步的研究还发现, 肝细胞脾内移植可诱导特异性异体蛋白耐受。 在肝硬化成年患者，其脾脏较大约800～1200g, 而急性肝衰患者脾脏约100～150g 。故对于慢性肝衰患者，脾内植入6亿～60亿肝细胞途径相对安全和容易操作［22］。但脾脏移植细胞也有引起门静脉高压症及右心房压力升高并发症的可能性。
（3）其他途径：如腹腔、肠细膜、皮下等。通过微创腹腔内肝细胞移植，肝细胞可存活10天以上。但腹腔移植可引起炎症反应及腹腔感染，且移植细胞的血管化需较长时间。总之，几种移植途径各有优缺点，目前的临床试验主要采用门脉肝内移植及脾内移植途径。
2.2 肝细胞移植的临床效果 肝细胞移植目前主要应用于爆发型肝功能衰竭以及肝相关性代谢性疾病，能有效地提供近期或者远期肝功能支持［23,24］。研究表明［25］，移植后，肝细胞仍能维持正常的光镜和电镜结构，并能表达多种肝细胞功能，如白蛋白合成分泌、氨代谢、糖原储存和酵解、胆红素结合及细胞色素p450酶基因表达等。soriano 等［35］用real-time pcr 的方法检测了供肝肝细胞的数量，同时通过对急性肝衰病人移植后的肝活检，证实移植肝细胞在肝板及胆小管的浸润，这说明门脉内移植的肝细胞不仅可增殖分化，而且利用缝隙连接同受体肝细胞相连，通过毛细胆管分泌胆汁。
作为整体器官移植的桥梁或替代治疗，肝细胞移植显示出很大价值和应用前景。结合文献报道，现将收集到的临床人肝细胞移植效果作一 总结 。
2.2.1 治疗遗传性肝脏代谢性疾病 临床研究证明，肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病具有较好的效果。grossman 等对21例遗传性肝脏代谢性疾病患者行肝细胞移植治疗［26～32］，见表1。5 例接受治疗的家族性高胆固醇血症患者行肝左外叶切除后，体外分离肝细胞，利用反转录技术导入ldl 蛋白受体基因，再由门脉移植入肝脏，移植5～6 天后发现移植肝细胞增殖，2周时达到峰值。随访2年，平均血清胆固醇下降20%，移植肝细胞及转基因的功能存在，无1例肿瘤和感染发生。表1 肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病hughes 等对4例crgler-najjar 综合征患儿按整肝细胞量的5%输入新鲜和深低温保存的肝细胞，移植后高胆红素平均下降了30%～50%，降低了核黄疸的发生，随访显示结合胆红素水平保持稳定水平达3年以上。
患有凝血因子ⅶ缺乏症的两兄弟，在接受整肝细胞量5%新鲜肝细胞及冻肝细胞移植（10亿新鲜肝细胞，22 亿冻肝细胞），结果显示凝血功能明显改善，对外源性因子ⅶ的依赖性减少了80%, 由于静脉通路产生的并发症（两位患者均发生了导管相关性败学症）以及肝细胞移
植长期疗效的不确定性稳定性，半年后所需外源性因子ⅶ的量增加，提示移植肝细胞功能丧失，接受了肝脏移植。2例1a 型糖原储存障碍儿童患者，经肝细胞移植治疗后（第1周输入30亿，1个月后再次输入30亿肝细胞）开始正常饮食而血糖水平稳定。其中1例患儿葡萄糖6-磷酸激酶活性在移植后3周恢复到正常水平，并一直保持到7个月。
【摘要】 50多年前sorrentino 第一次用机械的 方法 把新鲜肝组织制成匀浆，并在体外进行药物实验，开创了肝脏功能的体外人工支持 时代 。berry 和friend 等在1969年用自己配置成的消化液进行大鼠肝灌注第一次完整分离肝细胞。几十年来，肝细胞的分离培养及保存技术不断优化并为相关的肝脏 研究 和肝脏疾病的 治疗 提供了极为宝贵的途径。尤其是近年来肝细胞移植的实验和临床 应用 不断取得进展，为肝脏疾病的治疗展现了诱人的前景。优化和完善肝细胞的分离，培养和保存，仍然是关系到肝细胞移植效果的前提。近年来，不少的研究者正致力于临床的应用研究。根据所收集到的 文献 报道，世界各大医学中心 目前 已有近80例肝细胞移植的临床应用，其结果令人鼓舞。可以预测，肝细胞移植作为整体器官移植的“桥梁”或替代治疗，将给众多肝病患者带来福音。本文就近年来肝细胞移植的临床应用研究进展作一综述。
【关键词】 肝细胞 分离 细胞培养 移植 临床应用
肝脏是机体最重要的器官之一，在生理和病理状态下，它是能量代谢、解毒以及血浆蛋白合成的中心。当发生急性肝功能衰竭时，只有15%～25%的病人得以生存［1］。许多慢性肝脏疾病如肝硬化、肝癌等也最终导致肝脏功能的衰竭。长期以来，国内外学者注重于肝器官移植的研究, 因为肝移植疗效显著，1年存活率可达70%以上。但肝移植对技术条件、适应证及组织相容性等要求较高, 加之肝供体的短缺，使肝移植的临床应用严重受限。因此，临床上急需其他方法，作为“桥梁”来缓解和改善肝功能，延长患者的生存时间，而等待肝移植，甚至取代肝移植。由此，肝细胞移植及生物人工肝的研究成为热点［2,3］。不管是肝细胞移植或生物人工肝，肝细胞的分离、培养和保存是肝细胞临床应用的基石。就肝细胞分离培养和保存尤其是肝细胞移植的临床应用研究进展现综述如下。
1 肝细胞分离培养与保存
1.1 肝细胞的来源
1．1.1 人肝细胞 人类肝脏细胞是最好的供体，因为肝脏细胞分化较高，有较好的合成和代谢功能［4］ ，因此肝细胞移植首选人肝细胞。但由于供体的严重短缺，目前用于肝细胞移植的供体多为不适于肝移植供体（untransplantable liver ），如脂肪肝、纤维化肝、受外伤肝等，这些细胞体外培养增殖困难，肝细胞功能效果不理想。胎肝细胞（fetal liver cell ，flc ）在体外可以扩增，在刺激下可分化，免疫原性弱。取自妊娠26周和34周引产的胎肝细胞, 检测其活性为95%, 代谢能力为成人的75%［5］ 。但其来源也很受限，且存在伦理 问题 。
1．1.2 动物肝细胞 为解决供体缺乏的问题，多年来研究者正致力于异种肝细胞移植的研究。动物肝细胞来源广泛，分离简便，效果可靠，donato 等［6］测定了人肝细胞、猪肝细胞、犬肝细胞、兔肝细胞、鼠肝细胞等钆细胞中细胞色素p450的含量及代谢能力，猪肝细胞和人肝细胞的代谢功能最接近。然而异种移植用于临床仍有许多问题待解决。其一，猪肝细胞的内源性逆转录病毒感染受体，其安全性须进一步研究。其二，动物肝细胞不可能替代人类血浆蛋白合成酶活性，并存在有种间的特异性差异, 并且异基因蛋白和酶进入到血循环中也能产生副作用［7］；为避免这种差异反应，病人血液和动物肝细胞之间必须有安全屏障, 即半透膜的存在。故目前动物肝细胞多作为生物人工肝的生物成分而起作用［8］。
动物实验证实, 肝干细胞在急性肝损伤时参与了肝脏肝细胞的再生和修复，并发挥了至关重要的作用，这样使肝干细胞移植用于临床治疗急性肝衰竭及肝代谢性疾病成为可能［11］。但肝干细胞用于临床还有许多问题待解决，诸如肝干细胞在体外的鉴别、分离、培养及筛选，干细胞的多向分化潜能及可塑性这一生物学现象的发生和调控机制仍不清楚，干细胞移植的数量，移植后在体内的归巢及定位等。相信随着研究的深入，肝干细胞希望能代替肝细胞的作用并应用于临床治疗。
1.2 肝细胞的分离和培养
1.2.1 肝细胞的分离 1969年，berry 和friend 等人用无钙的平衡盐、胶原酶和透明质酸酶配置成的消化液进行大鼠肝灌注，获得到肝细胞。之后，seglen 创立了两步灌流法，即首先灌注预热的无钙的平衡盐溶液去除肝血窦内的血细胞及部分非实质细胞，然后再灌注含有胶原酶的平衡盐溶液，进行体外消化后，分离提纯而获得肝细胞。目前，国内外动物和人类肝细胞的分离方法都是在此基础上改良的。
1.2.2 肝细胞的培养 肝细胞属高度分化类上皮细胞，对生存环境有着极高的要求，如培养液的温度、ph 值、渗透压、co2含量、促肝细胞生长物质及血清浓度等，是 影响 肝细胞活性的重要因素；肝细胞与基质、肝细胞与非实质细胞的接触对肝细胞的生长和活性也起着极为重要的作用［13］。肝细胞的培养须考虑到这些方面的问题。
2 肝细胞移植的临床应用
2.1 肝细胞移植途径 与肝移植相比，肝细胞移植简单易行，可通过微创手术或介入置管完成。目前主要的移植部位有：（1）门脉或肝内移植：从生理环境到细胞环境，肝脏是肝细胞的最佳生活空间。肝脏的组织结构，门脉血供的营养物质和生长因子以及激素，使得移植的肝细胞在不改变微结构的情况下与受体肝组织融合，肝功能能得到代偿。使用本途径较为安全，是较为常用的方法［21］，但偶会出现门脉高压及肺栓塞的风险。（2）脾内移植：脾内网状组织有俘获和保护移植肝细胞不被吞噬细胞吞噬的作用，有利于细胞着床。同时脾内丰富的血供也为肝细胞的长期存活、增殖提供了有利条件。进一步的研究还发现, 肝细胞脾内移植可诱导特异性异体蛋白耐受。 在肝硬化成年患者，其脾脏较大约800～1200g, 而急性肝衰患者脾脏约100～150g 。故对于慢性肝衰患者，脾内植入6亿～60亿肝细胞途径相对安全和容易操作［22］。但脾脏移植细胞也有引起门静脉高压症及右心房压力升高并发症的可能性。
（3）其他途径：如腹腔、肠细膜、皮下等。通过微创腹腔内肝细胞移植，肝细胞可存活10天以上。但腹腔移植可引起炎症反应及腹腔感染，且移植细胞的血管化需较长时间。总之，几种移植途径各有优缺点，目前的临床试验主要采用门脉肝内移植及脾内移植途径。
2.2 肝细胞移植的临床效果 肝细胞移植目前主要应用于爆发型肝功能衰竭以及肝相关性代谢性疾病，能有效地提供近期或者远期肝功能支持［23,24］。研究表明［25］，移植后，肝细胞仍能维持正常的光镜和电镜结构，并能表达多种肝细胞功能，如白蛋白合成分泌、氨代谢、糖原储存和酵解、胆红素结合及细胞色素p450酶基因表达等。soriano 等［35］用real-time pcr 的方法检测了供肝肝细胞的数量，同时通过对急性肝衰病人移植后的肝活检，证实移植肝细胞在肝板及胆小管的浸润，这说明门脉内移植的肝细胞不仅可增殖分化，而且利用缝隙连接同受体肝细胞相连，通过毛细胆管分泌胆汁。
作为整体器官移植的桥梁或替代治疗，肝细胞移植显示出很大价值和应用前景。结合文献报道，现将收集到的临床人肝细胞移植效果作一 总结 。
2.2.1 治疗遗传性肝脏代谢性疾病 临床研究证明，肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病具有较好的效果。grossman 等对21例遗传性肝脏代谢性疾病患者行肝细胞移植治疗［26～32］，见表1。5 例接受治疗的家族性高胆固醇血症患者行肝左外叶切除后，体外分离肝细胞，利用反转录技术导入ldl 蛋白受体基因，再由门脉移植入肝脏，移植5～6 天后发现移植肝细胞增殖，2周时达到峰值。随访2年，平均血清胆固醇下降20%，移植肝细胞及转基因的功能存在，无1例肿瘤和感染发生。表1 肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病hughes 等对4例crgler-najjar 综合征患儿按整肝细胞量的5%输入新鲜和深低温保存的肝细胞，移植后高胆红素平均下降了30%～50%，降低了核黄疸的发生，随访显示结合胆红素水平保持稳定水平达3年以上。
患有凝血因子ⅶ缺乏症的两兄弟，在接受整肝细胞量5%新鲜肝细胞及冻肝细胞移植（10亿新鲜肝细胞，22 亿冻肝细胞），结果显示凝血功能明显改善，对外源性因子ⅶ的依赖性减少了80%, 由于静脉通路产生的并发症（两位患者均发生了导管相关性败学症）以及肝细胞移
植长期疗效的不确定性稳定性，半年后所需外源性因子ⅶ的量增加，提示移植肝细胞功能丧失，接受了肝脏移植。2例1a 型糖原储存障碍儿童患者，经肝细胞移植治疗后（第1周输入30亿，1个月后再次输入30亿肝细胞）开始正常饮食而血糖水平稳定。其中1例患儿葡萄糖6-磷酸激酶活性在移植后3周恢复到正常水平，并一直保持到7个月。