84中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2005年第26卷第2期
重组人白细胞介素215包涵体离子交换柱复性与稀释复性的比较
刘金生,王郡甫,许晓群,游 力,张 彩,高春义
(山东省医学科学院基础医学研究所,山东济南250062)
摘 要:目的比较重组人白细胞介素215(rhIL215)包涵体蛋白稀释复性法与离子交换柱复性法的效果。方法采用离子交换柱吸附变性包涵体蛋白,用含有复性剂的洗脱液洗脱复性,所得蛋白质比活和稀释复性法所得比活比较。结果两种方法所得目的蛋白质比活相近,但离子交换柱复性法目的蛋白质回收率高,试剂消耗少。结论对于rhIL215包涵体,离子交换柱复性法用于生产,可大幅降低生产成本。 关键词:重组人白细胞介素215;离子交换柱;复性;稀释;比活
中图分类号:R973 文献标识码:A 文章编号:100521678(2005)0220084202
Comparisonofproteinrefoldingbymethod
LIUJin2sheng,WANGJun2fu,XULi,,Chun2yi
(InstituteofBasic,,Jinan250062,China)
Abstracttheproteinrefoldingeffectbychromatographicmethodandbydi2
lutionmethod.MethodsInclusionbodiesproteinwasabsorbedwithionexchangecolumn,andthene2lutingwithelutionsolutioncontainingrefoldingagents.Thespecificactivityofrefoldingproteinsob2tainedfromthetwomethodswasjudged.ResultsAlthoughthespecificactivityofrefoldingproteinswasalike,thetargetproteinrecoveryratebychromatographicmethodwashigherthanthatofdilutionmethodandconsumptionwaslower.ConclusionTherecoveryrateofchromatographicmethodforrhIL215inclusionbodiesaimproteinwashigherthanthatofdilutionmethod,andreagentsconsump2tiondecreased.Thistechniquecouldmarkedlyreducethecostofproduction.
Keywords:rhIL215;chromatographiccolumn;renaturation;dilution;specificactivity
目前表达的重组蛋白质已达三、四千种,其中用E.coli表达的占90%以上,而这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以不溶解的包涵体形式存在,需用高浓度变性剂溶解后再加以复性。目前常用的复性方法为稀释法和透析法,存在的问题是目的蛋白质回收率不高,一般仅为5%～20%,试剂消耗量大,操作时间长。因此包涵体蛋白质的复性越来越引起有关人员的关注[123]。本实验利用阴离子交换柱对重组人白细胞介素215(rhIL215)包涵体蛋白进行复性,并与稀释法结果进行比较,取得较好的结果。1 材 料
表达rhIL215的工程菌株,本室自行构建;IL215敏感细胞株CTLL2,本室保存;氧化型谷胱甘肽
收稿日期:2004205212;修回日期:2004208206
作者简介:刘金生(19562),男,山东济南人,研究员,主要从事基因工程产品的发酵、复性和纯化工作。
(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)、精氨酸、三羟甲基
氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT),均为国产分析纯;LB培养基,Sigma公司。
Source30Q离子交换介质、AKTAexplorer100
蛋白工作站,瑞典Pharmacia公司;BIOFLOⅡc发酵罐(5L),美国NBS公司;J2221高速离心机,Beckman公司;Mini2PROTEANⅡcell电泳仪;美国BIORAD公司。2 方 法2.1 工程菌发酵
挑取单菌落转入LB培养基100ml内,30℃300r/min培养过夜,转入5L发酵罐内,始体积为3500ml,自动补加营养液、酸液和碱液,发酵液最终体积为5L。搅拌速度为400r/min。待培养液吸收度(A600nm)达0.6～0.7时,升温至42℃诱导表达4h。2.2 包涵体收集及洗涤
发酵液5000r/min离心30min,弃上清。用
中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2005年第26卷第2期85
溶液A(50mmol/LTris2HCl,1mmol/LEDTA,1mmol/LDTT,pH8)洗涤菌体,5000r/min离心30min,重复2次。适量溶液A混悬,冰浴条件下超声破碎细菌,超声功率300W,工作10s,间隔10s,共30次。5000r/min4℃离心30min,收集包涵体并重复洗涤3次,聚丙烯酰胺电泳检测包涵体的纯度。2.3 包涵体的稀释法复性
用8mol/L尿素溶液溶解包涵体。用复性液(50mmol/LTris2HCl,1mmol/LEDTA,0.1mmol/LGSSG,1mmol/LGSH,pH8.0)将包涵体溶液稀释至蛋白质浓度为0.15mg/ml,放置24h,测定比活。2.4 包涵体的离子交换柱复性
离子交换介质为Source30Q阴离子交换介质,色谱柱内径1cm,介质体积3ml。色谱柱事先用mmol/LTris2HCl(含30mmol/L(pH8.0)L后,按包涵体蛋白0.2ml,上样结束后用8mol/L尿素溶液和50mmol/LTris2HCl(含30mmol/LNaCl)缓冲溶液(pH8.0)梯度流洗,尿素浓度为1mol/L时停止洗脱。再用GSSG2GSH和精氨酸溶液洗脱。最后以0.5mol/LNaCl溶液洗脱蛋白质,收集目的蛋白质峰检测活性。2.5 复性供试品的活性检测
采用CTLL2细胞增殖法,以IL22标准品作对照。将依赖细胞株用D2Hanks液离心洗涤3次,用含10%FCS的RPMI1640培养液调细胞浓度为5×105/ml,将该细胞悬液加入含不同浓度待测rhIL215的96孔板,每孔100μl(5×104细胞/孔),同时设阴性对照。已知系列浓度的rhIL22标准品作阳性对照。细胞培养48～72h后加入MTT继续培养4h,离心去各孔上清液,加入0.04mol/L盐酸异丙醇溶液,充分混匀后测定A630nm和A570nm的值。计算得出供试品的比活。3 结 果稀释复性法和离子交换柱复性法各项指标的比较见表1。蛋白质电泳结果见图1。
表1 稀释复性法和离子交换柱复性法各项指标的比较 项 目
目的蛋白质回收率/%比活/(U/mg)复性时间/h
试剂消耗量(相对量)蛋白质纯度/%
稀释复性法
21
5×107242555
M.标准Mr蛋白质;1.包涵体蛋白质供试品;2.稀释复性的蛋白质
供试品;3.色谱复性的蛋白质供试品
图1 rhIL215包涵体、稀释复性和色谱复性蛋白质纯度的
SDS2PAGE
4 讨 论
在8mol/L尿素溶液中,蛋白质处于变性状态,
,IL2,这是由于尿素,,疏水,聚集沉淀。因此目的蛋白质的回收率偏低,仅有21%。我们曾试验极缓慢地降低尿素的浓度,仍然未能提高目的蛋白质的回收率。借鉴前人经验[5],利用离子交换柱复性法,蛋白质分子吸附在介质上,减少了相互之间的碰撞,降低蛋白质分子聚集沉淀的数量,明显提高目的蛋白质的回收率。从稀释法的21%提高到53%。
离子交换柱复性法的试剂消耗远小于稀释法。在稀释法中,一般包涵体蛋白质浓度为150～200mg/L,复性2g包涵体蛋白质时,复性液体积已达10L。而离子交换柱复性法处理等量的蛋白质,复性液至多用0.5L,大大降低了成本。离子交换柱复性法的时间很短,一般为1h,稀释法多为24h。
从我们的试验结果来看,离子交换柱复性法在达到相同比活的要求下,可节约试剂95%以上,节约时间95%以上。目的蛋白质回收率高1倍以上,具有很高的生产应用价值。参考文献:
[1] 冯小黎.重组包涵体蛋白质的折叠复性[J].生物化学和生物
物理进展,2001,28(4):4822485.
[2] 方敏,黄华 .包涵体蛋白体外复性的研究进展[J].生物工程
学报,2001,17(6):6082612.
[3] 董晓燕,杨晖,甘一如,等.固定化分子伴侣GroE促进变性溶
色谱复性法
53
5×107
1185
菌酶复性的研究[J].生物工程学报,2000,16(2):1692172.
[4] 郭立安,耿信笃.蛋白的色谱复性及同时纯化[J].生物工程学
报,2000,16(6):6612666.
[5] 焦建伟,俞梅敏,茹炳根.凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原
突变体(DscuPA32K)中的应用[J].生物工程学报,2001,17
(3):3002303.
84中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2005年第26卷第2期
重组人白细胞介素215包涵体离子交换柱复性与稀释复性的比较
刘金生,王郡甫,许晓群,游 力,张 彩,高春义
(山东省医学科学院基础医学研究所,山东济南250062)
摘 要:目的比较重组人白细胞介素215(rhIL215)包涵体蛋白稀释复性法与离子交换柱复性法的效果。方法采用离子交换柱吸附变性包涵体蛋白,用含有复性剂的洗脱液洗脱复性,所得蛋白质比活和稀释复性法所得比活比较。结果两种方法所得目的蛋白质比活相近,但离子交换柱复性法目的蛋白质回收率高,试剂消耗少。结论对于rhIL215包涵体,离子交换柱复性法用于生产,可大幅降低生产成本。 关键词:重组人白细胞介素215;离子交换柱;复性;稀释;比活
中图分类号:R973 文献标识码:A 文章编号:100521678(2005)0220084202
Comparisonofproteinrefoldingbymethod
LIUJin2sheng,WANGJun2fu,XULi,,Chun2yi
(InstituteofBasic,,Jinan250062,China)
Abstracttheproteinrefoldingeffectbychromatographicmethodandbydi2
lutionmethod.MethodsInclusionbodiesproteinwasabsorbedwithionexchangecolumn,andthene2lutingwithelutionsolutioncontainingrefoldingagents.Thespecificactivityofrefoldingproteinsob2tainedfromthetwomethodswasjudged.ResultsAlthoughthespecificactivityofrefoldingproteinswasalike,thetargetproteinrecoveryratebychromatographicmethodwashigherthanthatofdilutionmethodandconsumptionwaslower.ConclusionTherecoveryrateofchromatographicmethodforrhIL215inclusionbodiesaimproteinwashigherthanthatofdilutionmethod,andreagentsconsump2tiondecreased.Thistechniquecouldmarkedlyreducethecostofproduction.
Keywords:rhIL215;chromatographiccolumn;renaturation;dilution;specificactivity
目前表达的重组蛋白质已达三、四千种,其中用E.coli表达的占90%以上,而这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以不溶解的包涵体形式存在,需用高浓度变性剂溶解后再加以复性。目前常用的复性方法为稀释法和透析法,存在的问题是目的蛋白质回收率不高,一般仅为5%～20%,试剂消耗量大,操作时间长。因此包涵体蛋白质的复性越来越引起有关人员的关注[123]。本实验利用阴离子交换柱对重组人白细胞介素215(rhIL215)包涵体蛋白进行复性,并与稀释法结果进行比较,取得较好的结果。1 材 料
表达rhIL215的工程菌株,本室自行构建;IL215敏感细胞株CTLL2,本室保存;氧化型谷胱甘肽
收稿日期:2004205212;修回日期:2004208206
作者简介:刘金生(19562),男,山东济南人,研究员,主要从事基因工程产品的发酵、复性和纯化工作。
(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)、精氨酸、三羟甲基
氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT),均为国产分析纯;LB培养基,Sigma公司。
Source30Q离子交换介质、AKTAexplorer100
蛋白工作站,瑞典Pharmacia公司;BIOFLOⅡc发酵罐(5L),美国NBS公司;J2221高速离心机,Beckman公司;Mini2PROTEANⅡcell电泳仪;美国BIORAD公司。2 方 法2.1 工程菌发酵
挑取单菌落转入LB培养基100ml内,30℃300r/min培养过夜,转入5L发酵罐内,始体积为3500ml,自动补加营养液、酸液和碱液,发酵液最终体积为5L。搅拌速度为400r/min。待培养液吸收度(A600nm)达0.6～0.7时,升温至42℃诱导表达4h。2.2 包涵体收集及洗涤
发酵液5000r/min离心30min,弃上清。用
中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2005年第26卷第2期85
溶液A(50mmol/LTris2HCl,1mmol/LEDTA,1mmol/LDTT,pH8)洗涤菌体,5000r/min离心30min,重复2次。适量溶液A混悬,冰浴条件下超声破碎细菌,超声功率300W,工作10s,间隔10s,共30次。5000r/min4℃离心30min,收集包涵体并重复洗涤3次,聚丙烯酰胺电泳检测包涵体的纯度。2.3 包涵体的稀释法复性
用8mol/L尿素溶液溶解包涵体。用复性液(50mmol/LTris2HCl,1mmol/LEDTA,0.1mmol/LGSSG,1mmol/LGSH,pH8.0)将包涵体溶液稀释至蛋白质浓度为0.15mg/ml,放置24h,测定比活。2.4 包涵体的离子交换柱复性
离子交换介质为Source30Q阴离子交换介质,色谱柱内径1cm,介质体积3ml。色谱柱事先用mmol/LTris2HCl(含30mmol/L(pH8.0)L后,按包涵体蛋白0.2ml,上样结束后用8mol/L尿素溶液和50mmol/LTris2HCl(含30mmol/LNaCl)缓冲溶液(pH8.0)梯度流洗,尿素浓度为1mol/L时停止洗脱。再用GSSG2GSH和精氨酸溶液洗脱。最后以0.5mol/LNaCl溶液洗脱蛋白质,收集目的蛋白质峰检测活性。2.5 复性供试品的活性检测
采用CTLL2细胞增殖法,以IL22标准品作对照。将依赖细胞株用D2Hanks液离心洗涤3次,用含10%FCS的RPMI1640培养液调细胞浓度为5×105/ml,将该细胞悬液加入含不同浓度待测rhIL215的96孔板,每孔100μl(5×104细胞/孔),同时设阴性对照。已知系列浓度的rhIL22标准品作阳性对照。细胞培养48～72h后加入MTT继续培养4h,离心去各孔上清液,加入0.04mol/L盐酸异丙醇溶液,充分混匀后测定A630nm和A570nm的值。计算得出供试品的比活。3 结 果稀释复性法和离子交换柱复性法各项指标的比较见表1。蛋白质电泳结果见图1。
表1 稀释复性法和离子交换柱复性法各项指标的比较 项 目
目的蛋白质回收率/%比活/(U/mg)复性时间/h
试剂消耗量(相对量)蛋白质纯度/%
稀释复性法
21
5×107242555
M.标准Mr蛋白质;1.包涵体蛋白质供试品;2.稀释复性的蛋白质
供试品;3.色谱复性的蛋白质供试品
图1 rhIL215包涵体、稀释复性和色谱复性蛋白质纯度的
SDS2PAGE
4 讨 论
在8mol/L尿素溶液中,蛋白质处于变性状态,
,IL2,这是由于尿素,,疏水,聚集沉淀。因此目的蛋白质的回收率偏低,仅有21%。我们曾试验极缓慢地降低尿素的浓度,仍然未能提高目的蛋白质的回收率。借鉴前人经验[5],利用离子交换柱复性法,蛋白质分子吸附在介质上,减少了相互之间的碰撞,降低蛋白质分子聚集沉淀的数量,明显提高目的蛋白质的回收率。从稀释法的21%提高到53%。
离子交换柱复性法的试剂消耗远小于稀释法。在稀释法中,一般包涵体蛋白质浓度为150～200mg/L,复性2g包涵体蛋白质时,复性液体积已达10L。而离子交换柱复性法处理等量的蛋白质,复性液至多用0.5L,大大降低了成本。离子交换柱复性法的时间很短,一般为1h,稀释法多为24h。
从我们的试验结果来看,离子交换柱复性法在达到相同比活的要求下,可节约试剂95%以上,节约时间95%以上。目的蛋白质回收率高1倍以上,具有很高的生产应用价值。参考文献:
[1] 冯小黎.重组包涵体蛋白质的折叠复性[J].生物化学和生物
物理进展,2001,28(4):4822485.
[2] 方敏,黄华 .包涵体蛋白体外复性的研究进展[J].生物工程
学报,2001,17(6):6082612.
[3] 董晓燕,杨晖,甘一如,等.固定化分子伴侣GroE促进变性溶
色谱复性法
53
5×107
1185
菌酶复性的研究[J].生物工程学报,2000,16(2):1692172.
[4] 郭立安,耿信笃.蛋白的色谱复性及同时纯化[J].生物工程学
报,2000,16(6):6612666.
[5] 焦建伟,俞梅敏,茹炳根.凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原
突变体(DscuPA32K)中的应用[J].生物工程学报,2001,17
(3):3002303.