《植物生理学研究法》
(课程实习)
论文题目：秋海棠和一串红对水分胁迫下的生理响应
目 录
一、实验设计方案 ---------------------------3 二、实验预习报告----------------------------------4
实验一 植物组织中过氧化氢含量的测定 实验二 蒽酮法法测定可溶性糖
实验三 植物细胞膜透性的测定（电导仪法） 实验四 植物叶片水势测定
实验五 植物组织游离脯氨酸含量的测定 实验六 叶绿体色素的定量测定 实验七 植物组织含水量的测定
三、测定数据记录及计算--------------------------12 四、课程论文 ------------------------------------14
一、《植物生理学研究法》实验设计方案（10分）
3. 预习报告
实验1 植物组织中过氧化氢含量的测定
（一）原理
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H 2O 2发生累积。H 2O 2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H 2O 2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H 2O 2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量。
H 2O 2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H ２SO 4溶解后，在415nm 波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H 2O 2浓度呈线性关系。
（二）植物材料：
一串红叶片和秋海棠叶片
（三）仪器设备
研钵；移液管0.2ml ×2支，5ml ×1支；10mL 试管30只；离心机；分光光度计。
（四）试剂配制
100μmol/L H 2O 2丙酮试剂：取30%分析纯H 2O 2 57μl ，溶于100ml ，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
（五）实验步骤及注意事项
1. 制作标准曲线：取10ml 离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml 容量瓶中，并用丙酮少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm 波长下比色。
2. 样品提取和测定：(1)秋海棠每个灌水梯度称取0.5g 叶片，一串红每个梯度称取0.3g 叶片。按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，置于冰箱冷藏室中浸提2h ，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液2ml ，按表35-1加入0.2mL5%硫酸钛和0.4mL 浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min ，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol/L硫酸5ml ，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
（六）结果计算公式：
C ⨯Vt
植物组织中H 2O 2含量(μmol/g Fw)=FW ⨯V 1
式中 C —标准曲线上查得样品中H 2O 2浓度（μmol ）； V t —样品提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用样品提取液体积（ml ）； FW —植物组织鲜重（g ）。
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),166-167
实验2 蒽酮法法测定可溶性糖
(一) 原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm ，可在此波长下进行比色，故可用于糖的定量。
(二) 植物材料
一串红叶片和秋海棠叶片
(三) 仪器设备
分光光度计、电炉、铝锅、20mL 刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
(四) 试剂配制
1、硫酸-蒽酮溶液：24ml 去离子水+76ml浓硫酸，冷却后，加入0.1g 蒽酮 2、浓硫酸（比重1.84）。
3、1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g 。加少量水溶解，移入100mL 容量瓶中，加入0.5mL 浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
4、100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1%蔗糖标准液1mL 加入100mL 容量瓶中，加水定容。
（五）实验步骤及注意事项
1．标准曲线的制作:取20mL 刻度试管6支，从0－5分别编号，按下表加入溶液、水和硫酸-蒽酮，沸水浴10min ，冷却后。然后以空白为参比，在630nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
各试管加溶液和水的量
2．可溶性糖的提取:取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.30g 秋海棠叶片、0.20g 一串红叶片，各3份，分别放入6支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min （提取2次），提取液过滤入20mL 试管中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
3．直接吸取样液1ml 到20ml 具刻度试管，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入4mL 蒽酮硫酸溶液，沸水浴10min 、显色并测定光密度（630nm ）。由标准线性方程求出糖的量。
（六）结果计算公式：
按下面式子计算测试样品中糖含量
可溶性糖含量（%）=（C ×V ／a ×n) ／(W×10) 式中 C---------标准方程求得糖量（ug ） a----------吸取样品液体积（ml ） V---------提取液量（ml ） n-----------稀释倍数 W----------组织重量（g ）
6
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),110-113.
实验3 植物细胞膜透性的测定（电导仪法）
（一）原理：
植物组织受到逆境伤害时，由于膜的功能受损或结构破坏，而使其透性增大，细胞内各种水溶性物质包括电解质将有不同程度的外渗，将组织浸入无离子水中，水的电导仪将因电解质的外渗而加大，伤害愈重，外渗愈多，电导度的增加也愈大。故可以用电导仪测定外液的电导度增加值而得知伤害程度。
（二）植物材料：
一串红和海棠叶片
（三）仪器设备：
1. 电导仪1台； 2.真空泵(附真空干燥器)1套； 3.恒温水浴箱1个； 4.30个三角瓶； 5.30张封口膜； 6.打孔器1把； 7.10ml 移液管(或定量加液器)2支； 8.镊子1把；
以及记号笔、去离子水、滤纸、保鲜膜、玻璃棒、吸球、洗瓶等。
（四）试剂配制：
无
（五）实验步骤及注意事项
1. 容器的洗涤:
2. 叶片处理: 将一串红叶和海棠叶片分别用自来水冲洗干净并用去离子水润洗，再用洁净滤 纸吸干表面水分。用 6～8mm 的打孔器避开主脉打取叶圆片(或切割成大小一致的叶块) ，每个对照组5盆植物共取90个叶圆片，在每个三角瓶中放入30个。
3．测定：在装有叶片的各三角瓶中加入100ml 的去离子水，用保鲜膜封口，并用解剖针将保鲜膜扎几孔（以防止叶圆片在抽气时翻出试管）以便抽气。然后将试管放入真空干燥箱中用真空泵抽气15min ，抽出细胞间隙的空气，当缓缓放入空气时，水即渗入细胞间隙，叶片变成半透明状，沉入水下。 将以上三角瓶在室温下保持 30min，其间要多次摇动三角瓶。 4) 30min 后将各试管充分摇匀，用电导仪测其初电导值(S1)。
5) 测毕，将各试管盖塞封口，置沸水浴中 10min，以杀死植物组织。取出试管后用自来水冷却至室温，
并在室温下平衡 10min，摇匀，测其终电导值(S2)。
注意事项：
1、所用的叶片叶龄要一致。
2、整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净, 也不要用手接触叶片，以免污染。 3、抽气要使叶片下沉才能与水分充分进行交换。
4、CO2 在水中的溶解度较高，测定电导时要防止高 CO2气源和口中呼出 CO2进入试管，以免影响结果的准确性。
5、温度对溶液的电导影响很大，故 S1 和 S2 必须在相同温度下测定。
（六）结果计算：
初电导值 － 空白电导率
相对电导度（％）＝ —————————————— × 100 终电导值 － 空白电导率
伤害度（％）=（Lt-Lck ）/（1-Lck ）×100 Lt:处理叶片的相对电导度 Lck:对照叶片的相对电导度
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),159-160.
实验四 植物组织水势测定
（一）原理：
植物组织的水分状况可用水势（代表水的级量水平）来表示。植物组织的水势愈低，则吸水能力愈强。反之，水势愈高，则吸水能力愈弱。不同植物，不同部位，不同年龄及不同时刻的组织，水势都有一定差异；土壤条件及大气条件等外界因毒对植物组织的水势也有很大影响。测定植物组织的水势可以了解植物组织的水分状况，也可作制订作物灌溉的生理指标。
（二）植物材料：
一串红和海棠叶片
（三）仪器设备：
1、水势仪；2、剪刀
（四）实验步骤
1. 叶片处理: 将一串红叶和海棠叶片分别用自来水冲洗干净并用去离子水润洗，再用洁净滤纸吸干表面水分。用剪刀将各组叶片剪成小碎片。
2．测定：将各组剪碎的叶片放进仪器圆形的盒子里，进行测量。
实验5 植物组织游离脯氨酸含量的测定
（一）原理
植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样) 限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm 处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度
成正比。
（二）植物材料
一串红叶片和秋海棠叶片
（三）仪器设备
分光光度计；水浴锅：漏斗：大试管(20m1)；具塞刻度试管(20m1) 注射器或滴管(5～l0ml) 。
（四）试剂配制
(1)3％磺基水杨酸溶液 (2)甲苯；
(3)2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mo1.L -l 磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效； ‘
(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg 脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml ，其浓度为100ug.mL -l 。再取此液10ml ，用蒸馏水稀释至lOOml ，即成10μg ．mL -1的脯氨酸标准液。 （五）实验步骤及注意事项 1．标准曲线制作
（1）取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min 。 (2)取出冷却后向各管加入5ml 甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm 下比色。
（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程
表9．2．1各试管中试剂加入量
试管编号
脯氨酸标准溶液(m1)
水(m1) 冰乙酸(m1) 茚三酮显色液(m1) 2. 样品测定
0 2 2 3
1
0.2 1.8 2 3
2
0.4 1.6 2 3
3
0.8 1.2 2 3
4
1.2 0.8 2 3
5
1.6 0.4 2 3
6
2.0 0 2 3
（1）脯氨酸提取：每个灌水梯度分别取0.3g 叶片，加5mL 磺基水杨酸于沸水中浸提。
（2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1茚三酮显色液，于沸水浴中加热40min ，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml 甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm 下比色）。
（六）结果计算公式：
从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸含量的百分数
脯氨酸[μg.g -1(干或鲜重)] = (C*V/a）/ W
式中：C 一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得： V － 提取液总体积（ml ）
A --- 测定时所吸取得体积（ml ） W----- 样品重（g ）
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),161-162
实验6 叶绿体色素的定量测定
（一）原理：
根据叶绿体色素提取液对可见光光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的消光度D 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即： D=klcD
（k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，k 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。）
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡罗卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a 、b 的80%丙酮提取液（注：丙酮有毒，可用下文阐述的酒精代替。）在红光区的最大吸收峰分别是663nmm 和645nm ，又知在波长663nm 下，叶绿素a 、b 在该溶液中的比吸收系数分别是82.04和9.27，在波长645nm 下分别16.75和45.6，可根据加和性原则列出以下关系式： D663=82.04Ca+9.27Cb D645=16.75 Ca +45.60 Cb
(上式中D663 、D645表示叶绿素溶液在波长663nm 和645nm 时的消光度；Ca 、Cb 叶绿素a 、b 浓度（mg/L）)
由上两式组成方程组解得： Ca=12.72 D663-2.59 D645 Cb=22.88D645-4.67D663
将Ca 、Cb 相加即得叶绿素总量CT CT= Ca+ Cb=20.29 D645+8.05 D663
另外，由于叶绿素a 、b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸光系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（D652）而求出叶绿素a 、b 总量： CT=（D532×1000）/34.5
在叶绿素存在的条件下，用分光光度计法可同时测定出溶液中的类胡罗卜素的含量。
Lichtenthaler 等对Arnon 法进行了修正，提出了80%的丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： Ca=12.21D663-2.81 D646 Cb=20.13D646-5.03D663
Cx·c=（1000D470-3.27Ca-104Cb ）/229
(式中Ca 、Cb 叶绿素a 、b 浓度mg/L；Cx·c 类胡萝卜素的总浓度；D663 、D646和D470表示叶绿素溶液在波长663nm 、646nm 和470nm 下的消光度)
由于叶绿素在不同溶剂中的吸光光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a 、b 在96%的乙醇中的最大吸收峰的波长分别是665nm 和649nm ，类胡罗卜素为470nm （95%乙醇：纯丙酮=1:1（v/v）的混合提取液中的最大吸收峰波长为663nm 、646nm 和470nm ），可据此列出以下关系式： Ca=13.95D663-6.88 D646 Cb=24.96D646-7.32D663
Cx·c=（1000D470-2.05Ca-114.8Cb ）/245
（二）植物材料：
一串红和秋海棠叶片
（三）仪器设备：
分光光度计，研钵，玻棒，25mL 棕色容量瓶，小漏斗，7cm 定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平
（四）试剂配制：
95%乙醇（配制500mL95%乙醇：475mL 无水乙醇和25mL 无菌水）；石英砂
（五）实验步骤及注意事项：
1．取一串红和秋海棠的叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2．每个梯度各称取0.5g 秋海棠、0.3g 一串红叶片，各3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2mL80％丙酮，研成匀浆，再加入丙酮定容到10mL 试管中。 3. 将这30支具刻度（10ml ）试管放置冰箱4℃，浸提2h 。
4．吸取1mL 叶绿体色素提取液，加4mL70%丙酮，倒入光径1cm 的比色杯内，以80％丙酮为空白，在波长663nm 、646nm 和470nm 下测定消光度。
注意事项：
1、研磨要在弱光下进行，且速度要快； 2、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素； 3、残渣中的色素要充分洗脱； 4、波长要调准； 5、比色液不能混浊。
（六）结果计算公式：
95%乙醇提取液中色素计算公式：
1.Ca=13.95D663-6.88 D646 Cb=24.96D646-7.32D663
Cx·c=（1000D470-2.05Ca-114.8Cb ）/245 以上是求出叶绿素总浓度，mg.L-1
按以下公式计算各色素含量(mg.g鲜重-1 ) ：
叶绿体色素含量 =（色素的浓度×提取液体积(L)×稀释倍数）/ 样品鲜重(g)
（七）参考文献：
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),72-74
实验7 植物组织含水量的测定
（一）原理
表示组织含水量的方法有两种：一是以干重为基数表示；二是以鲜重为基数表示。从而分为干重法和鲜重法：
W f －W d
组织含水量（占鲜重%）= ―――――― × 100 （3-1） W d
W f －W d
组织含水量（占干重%）= ―――――― × 100 （3-2） W d 式中 W f ----------组织鲜重； W d -------组织干重。
（二）植物材料
一串红叶片和秋海棠叶片
（三）仪器设备
天平（感量0.1mg ）；烘箱；剪刀；空铝盒30个；吸水纸。
（四）试剂配制：
无
（五）实验步骤及注意事项
1、将空铝盒洗净并烘干，迅速称量空铝盒的质量。
2、剪取植物组织，迅速放入已知重量的铝盒，称出鲜重和铝盒总重（W 1）。
3、将植物组织连同铝盒放入已升温至105℃的烘箱中，杀青15min ，然后于80℃下烘至恒重，称出干重和铝盒总重（W 2）。
4、重复前3步的操作，将剩余的29个铝盒的质量。 （六）结果计算公式 含水量=W2-W 1
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),11-12
三、生理指标测定数据处理
1、 植物组织中过氧化氢含量的测定
2、蒽酮法法测定可溶性糖
海棠叶片
5.004.003.002.001.000.00
2
可溶性糖含量（%）
46810
胁迫天数（d）
图2 水分胁迫对盆栽鲜花叶片可溶性糖含量的影响
3、 植物细胞膜透性的测定（电导仪法）
[**************]0
海棠叶片细胞相对透性(%)
2
46水分胁迫天数（d)
8
图3 水分胁迫对盆栽鲜花叶片细胞膜相对
透性的影响
4、植物叶片水势测定
0.0
-0.5
水势
-1.0-1.5-2.0
胁迫天数（d）
图4 水分胁迫对盆栽花叶片水势的影响
5、植物组织游离脯氨酸含量的测定
游离脯氨酸
含量（u g /g ）
海棠叶片
150100500
1
2
3
45胁迫天数（d）
6
7
8
9
图5 水分胁迫对盆栽花叶片游离脯氨酸含量的影响
6、叶绿体色素的定量测定
色素含量（m g /g ）
2.01.51.00.50.0
2
4
水分胁迫天数（d）
68
图6.2 水分胁迫对盆栽鲜花叶片色素含量影响
1.21.00.80.60.40.20.0
色素含量（m g /g ）
2
4
水分胁迫天数（d）
68
图6.1 水分胁迫对盆栽鲜花叶片色素含量影响
7、植物组织含水量的测定
海棠叶片一串红叶片
4.00003.00002.00001.00000.0000
含水量
246810
胁迫天数(d)
图7 水分胁迫对盆栽花叶片含水量的影响
四、撰写科技论文 成绩：________
21
22
《植物生理学研究法》
(课程实习)
论文题目：秋海棠和一串红对水分胁迫下的生理响应
目 录
一、实验设计方案 ---------------------------3 二、实验预习报告----------------------------------4
实验一 植物组织中过氧化氢含量的测定 实验二 蒽酮法法测定可溶性糖
实验三 植物细胞膜透性的测定（电导仪法） 实验四 植物叶片水势测定
实验五 植物组织游离脯氨酸含量的测定 实验六 叶绿体色素的定量测定 实验七 植物组织含水量的测定
三、测定数据记录及计算--------------------------12 四、课程论文 ------------------------------------14
一、《植物生理学研究法》实验设计方案（10分）
3. 预习报告
实验1 植物组织中过氧化氢含量的测定
（一）原理
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H 2O 2发生累积。H 2O 2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H 2O 2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H 2O 2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量。
H 2O 2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H ２SO 4溶解后，在415nm 波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H 2O 2浓度呈线性关系。
（二）植物材料：
一串红叶片和秋海棠叶片
（三）仪器设备
研钵；移液管0.2ml ×2支，5ml ×1支；10mL 试管30只；离心机；分光光度计。
（四）试剂配制
100μmol/L H 2O 2丙酮试剂：取30%分析纯H 2O 2 57μl ，溶于100ml ，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
（五）实验步骤及注意事项
1. 制作标准曲线：取10ml 离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml 容量瓶中，并用丙酮少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm 波长下比色。
2. 样品提取和测定：(1)秋海棠每个灌水梯度称取0.5g 叶片，一串红每个梯度称取0.3g 叶片。按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，置于冰箱冷藏室中浸提2h ，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液2ml ，按表35-1加入0.2mL5%硫酸钛和0.4mL 浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min ，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol/L硫酸5ml ，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
（六）结果计算公式：
C ⨯Vt
植物组织中H 2O 2含量(μmol/g Fw)=FW ⨯V 1
式中 C —标准曲线上查得样品中H 2O 2浓度（μmol ）； V t —样品提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用样品提取液体积（ml ）； FW —植物组织鲜重（g ）。
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),166-167
实验2 蒽酮法法测定可溶性糖
(一) 原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm ，可在此波长下进行比色，故可用于糖的定量。
(二) 植物材料
一串红叶片和秋海棠叶片
(三) 仪器设备
分光光度计、电炉、铝锅、20mL 刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
(四) 试剂配制
1、硫酸-蒽酮溶液：24ml 去离子水+76ml浓硫酸，冷却后，加入0.1g 蒽酮 2、浓硫酸（比重1.84）。
3、1%蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g 。加少量水溶解，移入100mL 容量瓶中，加入0.5mL 浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
4、100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1%蔗糖标准液1mL 加入100mL 容量瓶中，加水定容。
（五）实验步骤及注意事项
1．标准曲线的制作:取20mL 刻度试管6支，从0－5分别编号，按下表加入溶液、水和硫酸-蒽酮，沸水浴10min ，冷却后。然后以空白为参比，在630nm 波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
各试管加溶液和水的量
2．可溶性糖的提取:取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.30g 秋海棠叶片、0.20g 一串红叶片，各3份，分别放入6支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min （提取2次），提取液过滤入20mL 试管中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
3．直接吸取样液1ml 到20ml 具刻度试管，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入4mL 蒽酮硫酸溶液，沸水浴10min 、显色并测定光密度（630nm ）。由标准线性方程求出糖的量。
（六）结果计算公式：
按下面式子计算测试样品中糖含量
可溶性糖含量（%）=（C ×V ／a ×n) ／(W×10) 式中 C---------标准方程求得糖量（ug ） a----------吸取样品液体积（ml ） V---------提取液量（ml ） n-----------稀释倍数 W----------组织重量（g ）
6
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),110-113.
实验3 植物细胞膜透性的测定（电导仪法）
（一）原理：
植物组织受到逆境伤害时，由于膜的功能受损或结构破坏，而使其透性增大，细胞内各种水溶性物质包括电解质将有不同程度的外渗，将组织浸入无离子水中，水的电导仪将因电解质的外渗而加大，伤害愈重，外渗愈多，电导度的增加也愈大。故可以用电导仪测定外液的电导度增加值而得知伤害程度。
（二）植物材料：
一串红和海棠叶片
（三）仪器设备：
1. 电导仪1台； 2.真空泵(附真空干燥器)1套； 3.恒温水浴箱1个； 4.30个三角瓶； 5.30张封口膜； 6.打孔器1把； 7.10ml 移液管(或定量加液器)2支； 8.镊子1把；
以及记号笔、去离子水、滤纸、保鲜膜、玻璃棒、吸球、洗瓶等。
（四）试剂配制：
无
（五）实验步骤及注意事项
1. 容器的洗涤:
2. 叶片处理: 将一串红叶和海棠叶片分别用自来水冲洗干净并用去离子水润洗，再用洁净滤 纸吸干表面水分。用 6～8mm 的打孔器避开主脉打取叶圆片(或切割成大小一致的叶块) ，每个对照组5盆植物共取90个叶圆片，在每个三角瓶中放入30个。
3．测定：在装有叶片的各三角瓶中加入100ml 的去离子水，用保鲜膜封口，并用解剖针将保鲜膜扎几孔（以防止叶圆片在抽气时翻出试管）以便抽气。然后将试管放入真空干燥箱中用真空泵抽气15min ，抽出细胞间隙的空气，当缓缓放入空气时，水即渗入细胞间隙，叶片变成半透明状，沉入水下。 将以上三角瓶在室温下保持 30min，其间要多次摇动三角瓶。 4) 30min 后将各试管充分摇匀，用电导仪测其初电导值(S1)。
5) 测毕，将各试管盖塞封口，置沸水浴中 10min，以杀死植物组织。取出试管后用自来水冷却至室温，
并在室温下平衡 10min，摇匀，测其终电导值(S2)。
注意事项：
1、所用的叶片叶龄要一致。
2、整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净, 也不要用手接触叶片，以免污染。 3、抽气要使叶片下沉才能与水分充分进行交换。
4、CO2 在水中的溶解度较高，测定电导时要防止高 CO2气源和口中呼出 CO2进入试管，以免影响结果的准确性。
5、温度对溶液的电导影响很大，故 S1 和 S2 必须在相同温度下测定。
（六）结果计算：
初电导值 － 空白电导率
相对电导度（％）＝ —————————————— × 100 终电导值 － 空白电导率
伤害度（％）=（Lt-Lck ）/（1-Lck ）×100 Lt:处理叶片的相对电导度 Lck:对照叶片的相对电导度
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),159-160.
实验四 植物组织水势测定
（一）原理：
植物组织的水分状况可用水势（代表水的级量水平）来表示。植物组织的水势愈低，则吸水能力愈强。反之，水势愈高，则吸水能力愈弱。不同植物，不同部位，不同年龄及不同时刻的组织，水势都有一定差异；土壤条件及大气条件等外界因毒对植物组织的水势也有很大影响。测定植物组织的水势可以了解植物组织的水分状况，也可作制订作物灌溉的生理指标。
（二）植物材料：
一串红和海棠叶片
（三）仪器设备：
1、水势仪；2、剪刀
（四）实验步骤
1. 叶片处理: 将一串红叶和海棠叶片分别用自来水冲洗干净并用去离子水润洗，再用洁净滤纸吸干表面水分。用剪刀将各组叶片剪成小碎片。
2．测定：将各组剪碎的叶片放进仪器圆形的盒子里，进行测量。
实验5 植物组织游离脯氨酸含量的测定
（一）原理
植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样) 限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm 处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度
成正比。
（二）植物材料
一串红叶片和秋海棠叶片
（三）仪器设备
分光光度计；水浴锅：漏斗：大试管(20m1)；具塞刻度试管(20m1) 注射器或滴管(5～l0ml) 。
（四）试剂配制
(1)3％磺基水杨酸溶液 (2)甲苯；
(3)2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mo1.L -l 磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效； ‘
(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25mg 脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml ，其浓度为100ug.mL -l 。再取此液10ml ，用蒸馏水稀释至lOOml ，即成10μg ．mL -1的脯氨酸标准液。 （五）实验步骤及注意事项 1．标准曲线制作
（1）取7支具塞刻度试管按表9.2-1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min 。 (2)取出冷却后向各管加入5ml 甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm 下比色。
（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程
表9．2．1各试管中试剂加入量
试管编号
脯氨酸标准溶液(m1)
水(m1) 冰乙酸(m1) 茚三酮显色液(m1) 2. 样品测定
0 2 2 3
1
0.2 1.8 2 3
2
0.4 1.6 2 3
3
0.8 1.2 2 3
4
1.2 0.8 2 3
5
1.6 0.4 2 3
6
2.0 0 2 3
（1）脯氨酸提取：每个灌水梯度分别取0.3g 叶片，加5mL 磺基水杨酸于沸水中浸提。
（2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3m1茚三酮显色液，于沸水浴中加热40min ，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml 甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管匀对照在波长520nm 下比色）。
（六）结果计算公式：
从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸含量的百分数
脯氨酸[μg.g -1(干或鲜重)] = (C*V/a）/ W
式中：C 一提取液中脯氨酸浓度(PS)，由标准曲线求得： V － 提取液总体积（ml ）
A --- 测定时所吸取得体积（ml ） W----- 样品重（g ）
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),161-162
实验6 叶绿体色素的定量测定
（一）原理：
根据叶绿体色素提取液对可见光光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的消光度D 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即： D=klcD
（k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，k 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。）
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡罗卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a 、b 的80%丙酮提取液（注：丙酮有毒，可用下文阐述的酒精代替。）在红光区的最大吸收峰分别是663nmm 和645nm ，又知在波长663nm 下，叶绿素a 、b 在该溶液中的比吸收系数分别是82.04和9.27，在波长645nm 下分别16.75和45.6，可根据加和性原则列出以下关系式： D663=82.04Ca+9.27Cb D645=16.75 Ca +45.60 Cb
(上式中D663 、D645表示叶绿素溶液在波长663nm 和645nm 时的消光度；Ca 、Cb 叶绿素a 、b 浓度（mg/L）)
由上两式组成方程组解得： Ca=12.72 D663-2.59 D645 Cb=22.88D645-4.67D663
将Ca 、Cb 相加即得叶绿素总量CT CT= Ca+ Cb=20.29 D645+8.05 D663
另外，由于叶绿素a 、b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸光系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次消光度（D652）而求出叶绿素a 、b 总量： CT=（D532×1000）/34.5
在叶绿素存在的条件下，用分光光度计法可同时测定出溶液中的类胡罗卜素的含量。
Lichtenthaler 等对Arnon 法进行了修正，提出了80%的丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： Ca=12.21D663-2.81 D646 Cb=20.13D646-5.03D663
Cx·c=（1000D470-3.27Ca-104Cb ）/229
(式中Ca 、Cb 叶绿素a 、b 浓度mg/L；Cx·c 类胡萝卜素的总浓度；D663 、D646和D470表示叶绿素溶液在波长663nm 、646nm 和470nm 下的消光度)
由于叶绿素在不同溶剂中的吸光光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a 、b 在96%的乙醇中的最大吸收峰的波长分别是665nm 和649nm ，类胡罗卜素为470nm （95%乙醇：纯丙酮=1:1（v/v）的混合提取液中的最大吸收峰波长为663nm 、646nm 和470nm ），可据此列出以下关系式： Ca=13.95D663-6.88 D646 Cb=24.96D646-7.32D663
Cx·c=（1000D470-2.05Ca-114.8Cb ）/245
（二）植物材料：
一串红和秋海棠叶片
（三）仪器设备：
分光光度计，研钵，玻棒，25mL 棕色容量瓶，小漏斗，7cm 定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平
（四）试剂配制：
95%乙醇（配制500mL95%乙醇：475mL 无水乙醇和25mL 无菌水）；石英砂
（五）实验步骤及注意事项：
1．取一串红和秋海棠的叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2．每个梯度各称取0.5g 秋海棠、0.3g 一串红叶片，各3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2mL80％丙酮，研成匀浆，再加入丙酮定容到10mL 试管中。 3. 将这30支具刻度（10ml ）试管放置冰箱4℃，浸提2h 。
4．吸取1mL 叶绿体色素提取液，加4mL70%丙酮，倒入光径1cm 的比色杯内，以80％丙酮为空白，在波长663nm 、646nm 和470nm 下测定消光度。
注意事项：
1、研磨要在弱光下进行，且速度要快； 2、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素； 3、残渣中的色素要充分洗脱； 4、波长要调准； 5、比色液不能混浊。
（六）结果计算公式：
95%乙醇提取液中色素计算公式：
1.Ca=13.95D663-6.88 D646 Cb=24.96D646-7.32D663
Cx·c=（1000D470-2.05Ca-114.8Cb ）/245 以上是求出叶绿素总浓度，mg.L-1
按以下公式计算各色素含量(mg.g鲜重-1 ) ：
叶绿体色素含量 =（色素的浓度×提取液体积(L)×稀释倍数）/ 样品鲜重(g)
（七）参考文献：
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),72-74
实验7 植物组织含水量的测定
（一）原理
表示组织含水量的方法有两种：一是以干重为基数表示；二是以鲜重为基数表示。从而分为干重法和鲜重法：
W f －W d
组织含水量（占鲜重%）= ―――――― × 100 （3-1） W d
W f －W d
组织含水量（占干重%）= ―――――― × 100 （3-2） W d 式中 W f ----------组织鲜重； W d -------组织干重。
（二）植物材料
一串红叶片和秋海棠叶片
（三）仪器设备
天平（感量0.1mg ）；烘箱；剪刀；空铝盒30个；吸水纸。
（四）试剂配制：
无
（五）实验步骤及注意事项
1、将空铝盒洗净并烘干，迅速称量空铝盒的质量。
2、剪取植物组织，迅速放入已知重量的铝盒，称出鲜重和铝盒总重（W 1）。
3、将植物组织连同铝盒放入已升温至105℃的烘箱中，杀青15min ，然后于80℃下烘至恒重，称出干重和铝盒总重（W 2）。
4、重复前3步的操作，将剩余的29个铝盒的质量。 （六）结果计算公式 含水量=W2-W 1
（七）参考文献
【1】邹琦. 植物生理学实验指导. 中国农业出版社，2010-1，(7),11-12
三、生理指标测定数据处理
1、 植物组织中过氧化氢含量的测定
2、蒽酮法法测定可溶性糖
海棠叶片
5.004.003.002.001.000.00
2
可溶性糖含量（%）
46810
胁迫天数（d）
图2 水分胁迫对盆栽鲜花叶片可溶性糖含量的影响
3、 植物细胞膜透性的测定（电导仪法）
[**************]0
海棠叶片细胞相对透性(%)
2
46水分胁迫天数（d)
8
图3 水分胁迫对盆栽鲜花叶片细胞膜相对
透性的影响
4、植物叶片水势测定
0.0
-0.5
水势
-1.0-1.5-2.0
胁迫天数（d）
图4 水分胁迫对盆栽花叶片水势的影响
5、植物组织游离脯氨酸含量的测定
游离脯氨酸
含量（u g /g ）
海棠叶片
150100500
1
2
3
45胁迫天数（d）
6
7
8
9
图5 水分胁迫对盆栽花叶片游离脯氨酸含量的影响
6、叶绿体色素的定量测定
色素含量（m g /g ）
2.01.51.00.50.0
2
4
水分胁迫天数（d）
68
图6.2 水分胁迫对盆栽鲜花叶片色素含量影响
1.21.00.80.60.40.20.0
色素含量（m g /g ）
2
4
水分胁迫天数（d）
68
图6.1 水分胁迫对盆栽鲜花叶片色素含量影响
7、植物组织含水量的测定
海棠叶片一串红叶片
4.00003.00002.00001.00000.0000
含水量
246810
胁迫天数(d)
图7 水分胁迫对盆栽花叶片含水量的影响
四、撰写科技论文 成绩：________
21
22