2012年《细胞工程学》复习
一、名词解释（20分，10题，每题2分）（2个左右英文）
二、填空（20分，40空，每空0.5分）
三、选择题（10分，10题，每题1分）
四、简答题（30分，6题）
五、问答题（20分，2-3题）
一、名词解释。
（植物：）
方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得新的有用性状的细胞系或生物体的有关理论和技术方法的学科。【它是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。】
宜的条件下，细胞具有发育成完整个体的潜在能力。
或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。（或：当继代培养时，将原培养物切割或不切割转移至新的培养基中的材料称为外植体。）
【从植物体上分离下来的，用于初代离体培养的材料。】
（愈伤组织(callus)：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团，称为愈伤组织。或：在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，
这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。）
管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚
或胚状体（不定胚、无性胚）
（见胚状体）
体细胞无性系（somaclones）。这些植株所表现出来的变异称之为
体细胞无性系变异。
（直接筛选：是指利用在选择条件下细胞突变体可优先生长的特点进行的筛选。）
，即原生质体融合（protoplast fusion），指在人工控制条件下，
不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。
（四种融合形式：异核体或异核细胞，杂种原生质体或合子细胞，同核体，非对称杂种过细胞质杂种。）
【附词：细胞融合类型：
（1）同核体（homokaryon）：同源原生质体的融合体。自体融合。
（2）异核体（heterokaryon）：非同源原生质体的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育成个体的也是可能的。如烟草属种间的细胞杂种。
（3）多核体（polykaryon）：含有双亲不同比例核物质的融合体。一般是亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质。
例：胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。
（4）异胞质体（heterocybrid）：胞质体×有核的原生质体→异胞质体细胞杂种（含本种的细胞核，及异种的细胞质）。
矮牵牛×爬山虎。核：爬山虎，质：双亲（即有爬山虎、又有矮牵牛）。
（5）嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体、发生膜融合和胞质融合后，尚未发生核融合，双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物。】
（自发融合（spontaneous fusion）：当细胞壁被溶解后，胞间连丝发生膨大，相邻细胞原生质和细胞器通过膨大的胞间连丝融合形成同核体，实现原生质体的自发融合，这种融合仅限于同一物种内。）
行融合。
（对称融合（asymmetric fusion）：即两个完整的细胞原生质体融合。（自体融合、异体融合））
液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。（或：生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基。）
（条件培养基即预先培养过合适花药的培养基。条件培养实质上是一种花粉细胞悬浮培养方法，与普通细胞悬浮培养方法的不同之处在于，在液体培养基中加入了一定浓度的条件培养基，条件培养基一般是花药提取液。）
织上放一个小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上，当培养细胞长出微小细胞团后，将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。（是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂增殖的方法。）
养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，又称微室悬滴培养。它是为进行单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术，运用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂的全过程、胞质环流的规律等进行活体连续观察。这一方法同样也可用于原生质体培养，用于观察细胞壁的再生与细胞分裂过程。微室培养是细胞学研究的优良实验体系。
【植板率：是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例，或：长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分比。
】
件下使之生长发育的技术。
（是指使胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。广义胚胎培养研究还包括胚珠培养和试管受精等技术。）
胚发育阶段，在未达到生理和形态成熟时迅速萌发长成幼苗，这一现象称早熟萌发。（或：幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。
）
花粉萌发进入胚珠，完成受精作用。因全过程，即从花粉萌发到精卵细胞融合受精形成种子，直到种子萌发产生幼苗，均在试管内完成，也称为离体受精或植物生殖工程。
分和保护功能的人工胚乳和人工中皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。
人工种子亦称体细胞种子。早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮包被后而形成的体细胞种子。任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。
in vitro
propagation）、微型繁殖（micropropagation）或快速繁殖（rapid clone propagation），是指利用组织培养方法进行植物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致个体的方法。
（离体无性繁殖是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。）
超净无菌的条件下培养不带病菌的植株，进行营养繁殖，快速繁育和生产出无病毒的种苗、种薯、应运于大田生产。
【由人工用物理、化学和生物方法将植物体组织器官病原体消除，以使这些组织器官生成完整植株。】
（动物：）
【附词：细胞系(cell line)：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。
有限细胞系(finite cell line)：如果细胞系不能继续传代或传代数有限，它由原代培养中的许多细胞系列组成。
连续细胞系(continuous cell line)：如细胞系可连续传代，即已建成的细胞系(establisted cell line)。
细胞系的转化：细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其它特性的可遗传的变化。
体外恶性转化(in vitro malignant transformation)：细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物，可以产生肿瘤。
】
体取得材料开始，在培养瓶内培养至第一代传代前的这一过程。
释，将细胞从一个容器转移到另一个容器中的培养称为传代培养，简称传代。
经过30~50次传代，只有少数细胞系发生了转化，获得永久性，可以度过这一死亡“危机”，从而在体外永久存活下来，成为连续性细胞系（continuous cell line），或称已建立的细胞系（established cell line），或称永生性细胞系（immortal cell line）。
【大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，在体外永久存活下来发育成永久细胞系或称连续细胞系。】
经传代培养后即成为有限细胞系。有限细胞系：多数二倍体细胞系，最多在体外生存一年左右，传代30~50次，就衰老死亡了，这种传代次数有限的细胞系称为有限细胞系。
【经继代培养后细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，经过运动世代后细胞将逐渐死亡。】。
转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化。
是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。玻璃态固体分子之间的空间排列和液态相比无明显变化。玻璃化研究的核心是：1.寻找容易实现玻璃化并且对细胞损害较少的溶液。2.设法提高冷冻速度。
（加快降温速度，使细胞内水冻结冰晶体积非常小，出现玻璃状的冻结现象，从而也可使细胞免受伤害，达到细胞冻存的目的。）
（非玻璃化冻存：采用缓慢降温和快速复苏的方法以及在冻存液中加入冷冻保存剂，尽可能减少细胞的冰晶损伤和溶质损伤，提高复苏后细胞的活力。）
于适当基质上进行增殖培养的方法，它适用于一切贴壁依赖性细胞以及兼性贴壁细胞。 适用于非贴壁依赖性细胞，也可用于兼性贴壁细胞。其操作方法与植物细胞悬浮培养相似。
【是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。】
某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。
选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1／S期交界处；一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于M期。
stem cell）是一类具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。胚胎干细胞又称为多能干细胞（pluripotent stem cell，
PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后，筛选出的具有发育全能性的细胞，是已知的分化潜能最广的一类干细胞。
一个细胞的技术。所得到的融合细胞叫杂交细胞。
（细胞融合（cell fusion
）：通过培养和诱导，将两个或两个以上细胞合并成一个双核或多细胞的技术。）
（细胞重组（cell reconstruction）：将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介质诱导下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。包括核移植和染色体转移等。）
在离心过程中，细胞核及其外面包围的少量细胞质和细胞膜由细胞中央部位向外突出，直至脱离细胞而成为核体。剩下的无核部分称为胞质体。
无核细胞（anucleate cell），由完整细胞的绝大部分细胞质组成，外面包有细胞膜。（胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。）
小型细胞（minicell），含有完整细胞核，外面包围着少量细胞质和细胞膜。（核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微
小原生质体(miniprotoplast)。）
秋水仙素（colchicine）处理后，细胞核可分裂成若干个分别含有几条甚至一条染色体的微核（micronucleus），再经CB（细胞松弛素B）处理和离心作用，微核便从细胞质中分离出来，形成外面包有细胞膜和少量细胞质的微细胞。
单克隆抗体技术（monoclonal antibody technology）。
（百度：即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。）
（单克隆抗体：一种浆细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子。从一个单克隆细胞产生的抗体分子，即称为单克隆抗体，其具有独特的均一结构。）
（杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：
（1）抗原制备；
（2）免疫动物；
（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；
（4）细胞融合；
（5）杂交瘤细胞的选择培养；
（6）杂交瘤细胞的筛选；
（7）杂交瘤细胞的克隆化；
（8）单克隆抗体的检定；
（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；
（10）单克隆抗体的大量制备。）
（杂交瘤细胞(hybridoma cell)：既具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又能象骨髓瘤细胞那样在体外长期快速无限增殖的细胞。（或：杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和
B细胞融合而成的细胞。））
补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。
分裂而停止增殖，这种现象叫接触抑制。（或：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片形成连续性细胞单层后，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞扩展运动停止，细胞就不再分裂而停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制。）
（密度抑制（density inhibition）：当细胞的数量达到一定量后，细胞的增殖受到抑制，生长速度减缓，出现细胞生长的密度抑制现象。（或：当细胞在基质上分裂增殖，达到一定密度时，营养液中营养成份下降，有毒代谢产物积累，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为密度抑制现象。））
次地分割，然后分别移植给受体，妊娠产生多个遗传性状相同的后代的克隆方法。
（胚胎分割（多细胞复制）：将未着床的早期胚胎经显微手术后，分割成多等份，给每个受体内植入一块分割物而妊娠产仔的方法，一个胚胎克隆多个遗传性能完全一样的后代个体。）
群的过程。
经过人为选择，获得在遗传上纯一的后代的技术或过程。专指一般DNA在与载体DNA分子重组后，重组DNA分子由载体导入寄主细胞内，依赖载体的复制能力在寄主细胞中进行扩增，形成一个无性繁殖系的过程。）
二、问答题。
答：基本实验室：
准备室：进行一切与实验有关的准备工作，进行药品的保存、配置、消毒、分装等。器具的洗涤、干燥、消毒，生理生化指标的测定等。要求宽敞明亮，通风条件好。分为洗涤区、灭菌区、贮藏区和培养基配制区。
接种室：进行无菌操作，材料的接种。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。外设缓冲间—放置拖鞋，工作服，工作帽等。分为缓冲准备区、接种区。
培养室：对离体植物材料进行控制无菌培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。可根据培养规模，分为若干个培养室。
细胞学实验室：进行培养材料的组织学.细胞学.观察照相等。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。
生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化基本设备配置验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。
答：培养基基本成分：
水：水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95％。 原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水。如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净水以降低生产成本，提高生产效益。
无机盐类大量元素：培养基的使用量一般在每升几十至几千毫克。包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
微量元素：微量元素的用量一般低于10-5～10-7g分子浓度。有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co。
糖：是碳源和能源，多利用蔗糖。
维生素：B1是必需的，B6、烟酸等，原生质培养含有大多数基本维生素。
氨基酸：细胞原生质培养特别需要，水解酪蛋白。
激素：细胞分裂素--BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（异戊烯酰嘌呤，生长素--2.4-D，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯抑制。 琼脂、卡拉胶：固体培养。
活性炭：防止外植体变褐。
附加复合成分：椰子汁、酵母提取液。
答：光照：组织培养通常在散射光线下进行。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能
形成芽和根（光照时间影响植株再生状态）。
温度：在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合。 渗透压：渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。
通气：悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。
PH：通常使用的pH值范围是5.5～6.5。PH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。
答：激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的数量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。
在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样。如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高。
生长素/细胞分裂素高，有利于根分化；
生长素/细胞分裂素低，有利于芽分化。
生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体。
答：植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根(adventitious roots)、不定芽(adventitious shoots)等器官的过程。
器官发生方式：先芽后根，先根后芽，根芽同步发生。
器官发生过程：
经过愈伤组织的器官发生：愈伤组织形成→生长中心形成→器官原基及器官形成。
不经过愈伤组织的器官发生：在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种情况：
一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。
（1）起始材料对器官分化的影响：
总体上说，被子植物比裸子植物容易培养。在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。草本植物比木本植物容易培养。通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力。同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异已是不争的事实。基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。外植体对诱导反应及其再生能力的影响还体现在生理状态上。来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体更易成。外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。
（2）激素对器官发生的影响：
离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。
GA3，Eth，ABA在器官分化中也具有一定调控作用。
生长素/细胞分裂素高，有利于根分化；
生长素/细胞分裂素低，有利于芽分化。
生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体。
（3）光照对器官分化的影响：
光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、光照强度以及光质对器官分化均有影响。连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。 培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。
（4）基因调控对器官分化的影响：
Banno等(2001)从拟南芥根培养再生芽的体系中克隆了一个增强芽再生能力的基因ESR1，将该基因与35S启动子连接转化拟南芥，在有细胞分裂素存在的情况下转基因外植体可以显著提高不定芽的分化率。生长素不能诱导该基因表达，也不能提高不定芽分化频率。
答：体细胞胚从外植体上直接发生；经过愈伤组织的体细胞胚形成；经过悬浮细胞的体细胞胚形成。
（1）激素的调控作用：2,4-D是应用最为广泛的生长素。2,4-D的应用有规律性的变化，首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素有利于体细胞胚的继续发育。
细胞分裂素对体细胞胚发育的影响研究报道较少，但几乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均有细胞分裂素的配合使用。细胞分裂素在促进细胞分裂，维持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚胎发育细胞分裂是基本前体，当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作用。
（2）培养基及培养条件的影响：培培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，一些氨基酸可以代替还原态氮的作用。
一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。 一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。
（3）基因型的影响。
答：体细胞变异的细胞遗传学基础：
DNA核内重复复制：DNA重复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生，细胞内DNA含量就会不断上升。
染色体断裂与重组：染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现
染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。产生染色体结构变异的再生植株一般生长不正常，生活力低下，很难长期生存，因此以保存种质资源为目的的离体培养应尽可能避免这种变异发生，以免造成基因资源流失。
非正常有丝分裂：离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖遗传稳定差。纺锤体形成异常使得有丝分裂不正常是其原因之一。核裂经常导致双核与多核细胞的出现。 体细胞变异的分子遗传学基础：
基因水平上的变异从根本上讲就是DNA水平上的碱基突变或修饰状态的改变。
碱基突变：碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。突变碱基的DNA序列处于结构基因的位置或调控序列的位置时，即可导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之
一。对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。
DNA序列的选择性扩增与丢失——DNA序列的扩增与丢失也是体细胞无性系变异的原因之一。
转座子活化：上个世纪80年代，Larkin和Scowcroft首先提出，转座因子的活化可能是体细胞无性系变异的原因之一。
DNA甲基化：DNA甲基化在基因表达调控中具有重要作用。DNA甲基化和去甲基化，不仅能通过调控基因的表达与关闭来控制生物的发育，同时也可以通过DNA甲基化途径来适应环境对生物体的压力。
答：（1）诱变起始材料的选择：
选择起始材料需考虑以下几方面的问题:
其一，目标性状的可行性。体细胞突变性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状是体细胞突变系选择的目的。
其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平。
其三，适当的细胞类型亦是体细胞突变系筛选效率的重要条件。 如原生质体、单细胞、小孢子等有较高的诱变频率。
（2）诱变方法：
物理诱变：X射线、γ射线、快中子、紫外线等。
以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的γ射线、快中子等进行辐射。
以细胞或原生质体，则可以选择X射线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料时，可以使用紫外线照射，因为常用紫外线的波长为270nm，与DNA吸收波长260nm相近，而原生质体因为没有细胞壁的屏障，对紫外线的敏感性较强，从而可以达到较好的诱变效果。 化学诱变：常用的化学诱变剂主要有：
烷化剂（硫酸二乙酯 DES、乙基磺酸乙酯 EES、甲基黄酸乙酯 EMS、环氧乙烷 EO、乙烯亚胺 EI），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与DNA分子中的碱基或磷酸基结合，改变DNA的结构而引起突变；
碱基类似物（5－溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物、2－氨基嘌呤是腺嘌呤类似物），在细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺入到新合成的DNA分子中引起错配；
移码诱变剂，如ICR化合物和吖啶类似物等。
此外亚硝酸、羟胺等某些抗菌素等亦可引起突变产生。
转座子插入：诱变转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发展起来的新的体细胞变异
诱导方法。转座子既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。
（3）突变体的选择：
直接选择：其方法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。
间接选择：间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。
答：a.物理消毒灭菌：干热、湿热、过滤、射线等；化学消毒灭菌：消毒剂、抗生素等。
（1）干热消毒灭菌法；（2）湿热消毒灭菌法；（3）过滤除菌法；（4）射线消毒灭菌法；（5）酒精灯消毒灭菌法；（6）消毒剂消毒法；（7）抗生素抑菌法。
b.培养材料的消毒灭菌：采用自然界的实验材料，携带微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。采来的实验材料先用流水冲洗10～20min或更长时间，然后在一定浓度药剂中浸泡处理（须在超净工作台上操作），进行表面消毒灭菌。所用的药剂种类、浓度、处处理时间随植物种类和取用的器官部位的不同而异，常用消毒剂的灭菌效果见表3-2。消毒剂对植物组织是有毒的，应正确选择其浓度和处理时间，减少它对组织的伤害。经过灭菌的培养材料，需用无菌水洗4～
5次，沥去水分待用。
答：a.（1）提供对维持细胞指数生长的激素和氮源；
（2）提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其它激素等，能结合或调节它们所结合的物质活力；
（3）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热原结合，起到解毒作用；
（4）起促进细胞在培养基质上附着和铺开的作用；是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子的来源；
（5）起酸碱度缓冲剂的作用；
（6）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用的胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。
b.判断无血清培养基是否适合动物细胞的生长和增殖，主要看其中有没有替代血清成分的明确的补充成分，可以有四类：激素和生长因子，结合蛋白，贴壁和扩展因子，微量因素和低分子质量的营养成分。（通过观察细胞的大小，检验培养基里的产物，可以判断。）
答：意义：（1）繁殖速度快，经济效益高；（2）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗；（3）有利于繁殖各种珍稀、濒危苗木和突变体，为育种服务。（能够有效地保持优良品种的特性；快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；生产无病毒种苗，防止品种退化；节约耕地，提高农产品的商品率；便于运输。）
类型（方式）：不定芽型，器官型，器官发生型，胚状体发生型，原球茎型。
答：a.物理方法：高温处理（即热处理或温热疗法），低温处理（冷疗法）。化学方法；生物
方法：茎尖培养，微体嫁接法，珠心组织培养法，愈伤组织脱毒。
b.茎尖几乎不含病毒，采用旺盛分裂的茎尖组织培养，就有可能去除病毒。此法能与快速离体繁殖相结合，周期短，效率高。
c.直接测定法，指示植物法，抗血清鉴定法，电镜检查法，分子检测法。
答：（1）次生物质的生产是在可控条件下进行的，因此可以通过改变培养条件和筛选新细胞系得到超过整株植物产量的代谢产物。不仅可以节约资源，而且可以减少所占用的耕地面积；
（2）培养细胞是在无菌条件下生长的，因此可以排除病菌和虫害的侵扰；（3）可以进行特定的生物转化反应；（4）可以探索新的合成路线和获得新的有用物质。
答： a.分离方法：（1）机械分离法：借助于利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放；（2）酶解分离法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，使细胞壁被降解，获得有活力的原生质体。原生质体的分离步骤见课本P99，P97。
b.原生质体培养
包括：原生质体分离、纯化、培养体细胞壁再生、细胞团形成、器官形成、植株再生等步骤。原生质体在适宜培养基和适宜培养条件下经培养2～4d可再生细胞壁，并很快进行细胞分裂，30～60d出现肉眼可见的细胞团，以后再继续分裂增殖，几个月后形成愈伤组织或胚状体，最后形成完整小植株。培养方法：固体薄层培养法，液体浅层培养法，双层培养法。
答：a.（1）化学融合：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。
（2）电融合：利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间脉冲使质膜发生可逆性电击穿，促使原生质体融合的方法。
b.理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，
为远源物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA也可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
（分为自发融合和诱发融合。自发融合是无意义的。）
答：形态学鉴定，细胞学鉴定，同功酶鉴定，DNA分子标记鉴定。（举例见课本P112）
答：培养材料的选取与制备，植株再生，单倍体植株鉴定和染色体加倍。
（花药培养基本程序：外植体选择→外植体（花蕾）预处理→外植体消毒→剥取花药→接种→诱导培养→分化培养。）
答：花药和花粉培养与其他植物组织培养工作相比，对供试材料的要求更加严格，选取适宜材料，做适当的处理，制备出适宜的初代外植体是取得成功的第一个重要环节。基因型、小孢子发育时期及生理状态等对花药和花粉培养效果具有极大影响，因而是材料选择所要考虑的主要因素。
基因型选择、花粉发育时期的选择、生理状态的选择。（见课本P119）
答：a.花药和花粉植株的倍性与植物的种类、接种材料的类型、接种花粉的发育时期、培养基中的激素种类和浓度、花粉植株的发生方式及愈伤组织继代培养时间的长短等因素有关。 b.花药植株倍性混杂的原因是体细胞组织的干扰和生殖细胞的自发加倍。
（1）体细胞组织的干扰。花药构造包括药壁、药隔、药囊、花粉，花粉又与花丝相连。药壁、药隔、花丝都是体细胞组织，在离体培养条件下也能再生出植株，而且在很多情况下比花粉更易诱导生成再生植株，由这些体细胞再生出的植株一般都是二倍体；
（2）生殖细胞的的自发加倍，即核内有丝分裂不正常，形成不完全的细胞壁，造成核分裂与细胞壁形成不同步而发生核融合现象，这种再生植株便是二倍体或多倍体。
答：方法：形态鉴定，结实性鉴定，染色体数目鉴定，遗传标记鉴定（生化标记鉴定，分子标记鉴定）。（见课本P129）
答：a.植物胚胎培养包括：幼胚培养，成熟胚培养，胚珠培养，子房培养，胚乳培养，试管受精等内容。
b.（1）克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物；（2）打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限；（3）使生活力低下或无生活力的种子萌发；（4）
使柑橘类植物合子胚正常发育；（5）测定种子生活力；（6）获三倍体或单倍体植株；（7）快速繁殖特殊植物；（8）用于理论研究。
答：a.离体授粉指在无菌条件下，培养未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠，完成受精作用。因全过程，即从花粉萌发到精卵细胞融合受精形成种子，直到种子萌发产生幼苗，均在试管内完成，也称为离体受精或植物生殖工程。
b.该技术在育种实践上可克服自交不亲和性和远缘杂交障碍。此外，
采用远缘花粉授粉可诱导单性生殖产生单倍体植物。试管受精技术也为外源特异基因的有性转移，诱导遗传变异开辟了一条新途径。
c.（1）收集花粉；（2）剥取子房和胚珠；（3）离体受精方法（子房试管授粉：直接引入法，注射法；胚珠试管授粉：哺育法，接近法）。
答：a.人工种子指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工中皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。
b.优越性：人工种子的意义：（1）人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；（2）不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产；（3）有利于繁殖生长周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁
殖无病毒材料；（4）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质；
（5）体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。
局限性：人工种子存在种皮的缺陷，有菌条件下发芽率低，贮藏难，生产成本高，制作流程复杂等问题。
答：低温保存，超低温保存，生长抑制剂保存。（见课本P157）
答：见P151超低温保存原理。（在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存的目的。）
a.低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境后正常进行细胞分裂和分化就是在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存目的。植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料投放到液氮中，细胞和组织由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡。可见，超低温保存的植物材必须借助于冷冻防护剂。冷冻防护剂属于分子质量低的中性物质，
如甘油、脯氨酸、二甲基亚砜（DMSO）等，在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，水固化程度减弱，对降低培养基、植物组织、细胞的冰点起重要作用。特别是DMSO的发现，使植物种质在超低温环境中得以保存，因为它极易渗入细胞内部，防止细胞冰冻或融冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。另外，冷冻保护剂的使用可以提高培养基渗透压，导致细胞轻微质壁分离，提高组织和细胞的抗寒力。
b.超低温保存的基本程序：预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻和再培养。
答：a.影响因素：预处理方法、冷冻方法、解冻方法对植物材料冷冻保存效果产生重要影响，还有一些其他因素，如：植物材料的性质，冷冻防护剂。
b.综合考虑实验要求、经济条件等各种因素选择合适的实验方法，尤其要注意的是不同性质的保存材料应选择相应的保存措施，如胚状体材料以幼龄球形胚为佳、幼苗和成长植株以茎尖组织为佳；冷冻防护剂在一段时间内逐渐加入。
答：a.原代培养方法：（1）组织块接种培养法：无菌条件下，从有机体内取出组织，用平衡
3盐溶液漂洗数次，洗去血污，并剔除多余成分；剪成1mm大小的组织小块；均匀接种于培养
瓶底部，采用薄层培养法或翻转干涸法使组织小块贴壁。（2）酶解培养法：无菌条件下，从
3有机体内取出组织，用平衡盐溶液漂洗数次，洗去血污，并剔除多余成分；剪成1mm大小的
组织小块；用胰蛋白酶或胶原酶溶液消化；将制备成的单细胞悬液，接种到培养基中培养；数天后，细胞贴壁生长，并铺满培养瓶底部，形成细胞单层。（3）鱼类细胞组织块原代培养。
（4）哺乳动物和鸟类的原代培养。
【原代培养：（1）组织块接种培养：直接切割分离的组织块，在一定程度上保持了原有的组织结构，对于初期体外培养的环境适应性比直接分离成单细胞要强，因此，短期组织块培养
成为动物细胞培养的材料来源之一。（2）单层细胞培养：更换培养基容易，便于观察不同条件对细胞生长的影响，从而灵活调节培养条件；培养后期容易使用灌注技术改善营养条件；细胞贴附于基底质上，更容易表达产物。（3）悬浮细胞培养：适用细胞具有非贴壁特性的细胞，如血细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。】 b.传代培养方法：（1）贴壁培养：原代培养物或传代细胞形成细胞单层后，倒掉旧培养液；用PBS或PE洗细胞单层1～2次，以洗去死细胞和残存的培养液；加入适量的0.25%的胰蛋白酶溶液消化细胞单层，制备单细胞悬液；取1/2悬液接种于另一培养瓶，分别补加培养液后，于培养箱中静置培养。（2）悬浮培养：非贴壁依赖性细胞，如血细胞、淋巴细胞等，可用此法进行培养。但动物细胞无细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气，因此动物细胞的悬浮培养与微生物发酵又大不相同。实验室悬浮培养可在配有磁力搅拌的三角烧瓶内进行，或将三角瓶烧放在摇床上进行。传代时，只需离心去掉旧培养液，换上新培养液即可。
答：a.生长曲线一般分为潜伏期、指数生长期、平台期和衰退期四个时期。
（1）潜伏期：细胞有生长活动而无细胞分裂，是细胞分裂前的准备时期。一方面细胞逐渐适应新的环境，另一方面，细胞不断积累分裂增殖所需要的某些物质，使之达到一定的浓度，以便使细胞能够跨入分裂期。（2）指数生长期：细胞数目成倍增长，细胞活力最佳，进行实验研究一般选择此期细胞。（3）平台期：接触抑制即当细胞长满瓶底，形成连续性细胞单层后，细胞就不再分裂而停止增殖。在平台期，虽然细胞仍能存活一段时间，但如果不及时传代，就会影响细胞活力。（4）衰退期：平台期后，由于没有及时传代，培养液中得营养物质耗尽，代谢废物累积，pH降低，使细胞发生中毒性改变，甚至脱落死亡。
b.细胞系的演化是指细胞系从原代培养开始直至衰老死亡的整个生命历程。可分为三个阶段：原代培养阶段，有限细胞系阶段和连续培养系或衰老死亡阶段。
c.终末分化细胞失去分裂增殖能力，获得特异分化性质，执行特定分化功能，如肌肉细胞、肝脏细胞、表皮细胞等。在体内生长环境下，这些分化细胞的分化状态是稳定的、不可逆的。但是这些终末分化细胞在体外人工环境下，往往可以获得分裂增殖的能力，有些细胞还会失去其特异分化性质，如肝细胞失去精氨酸酶活性，不能贮存糖原，不能分泌血清蛋白，甚至通过诱导也不能再现，这种现象称为体外培养细胞的去分化。去分化的原因可能是由于缺少适当的诱导环境，使细胞不能表达分化特征，加上细胞对体外环境的不适应而发生了变化。
答：a.检查：培养液pH，细胞健康状况，微生物污染及其排除（细菌污染、真菌污染、支原体污染、病毒污染），细胞交叉污染，化学物质污染。
b.细菌污染较轻的，培养液仍清亮，但细胞生长缓慢；污染严重时，培养液变浑浊。排除污染方法：向培养液中加入5～10倍常用剂量的抗生素，冲击细胞24～48h，再将细胞转入正常培养液。
真菌（霉菌）污染肉眼可见到白色，黄色或黑色的菌落，光学显微镜下可见到丝状、树枝状或瘤状的菌丝，纵横交错，穿行于细胞之间。
支原体污染需采用专一性的方法鉴别，如DNA荧光染色法、支原体培养法、免疫学方法、PCR等。排除污染方法：抗生素处理，特异性抗血清处理，高热处理，巨噬细胞和抗生素联合处理，鼠的传代处理。
病毒污染细胞病变效应（CPE）如蚀斑，可作为早期检测病毒污染的指示特征。
细胞交叉污染：实验器材如吸管最好用一次即更换，绝不能用带有细胞的吸管吸公共培养液。 化学物质污染：只要培养器皿洗涤干净，培养用液来源可靠，很容易避免。
答：a.之所以要低温冻存动物细胞，是由于体外长期传代培养动物细胞耗时费力费材料，且容易受微生物污染，而且传代过程中细胞的遗传性状也可能会发生改变。低温条件下，细胞的一切代谢活动都停止或极其缓慢，从而避免细胞遗传形状的改变和衰老。
b.非玻璃化冻存：原理：冰晶损伤和溶质损伤，缓慢冷冻和快速复苏细胞以及冷冻保护剂的作用。方法：相对缓慢降温，快速融冻（冷冻步骤，复苏步骤）。（见课本P197） 玻璃化冻存：原理：方法：冷冻步骤，复苏步骤。（见课本P199）
答：a.细胞融合的基本过程：（1）细胞在诱融剂或正弦电场作用下凝集、彼此靠近；（2）两个相邻细胞间的质膜相互融合，随后两个亲本细胞质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等质膜成分也在融合后的质膜上重新分布；（3）细胞质发生融合；（4）细胞核融合，形成单核融合细胞。 b.杂交细胞的筛选方法：非选择性筛选：用机械方法把单个杂交细胞挑选出来，让其分裂繁殖，培养出细胞克隆。也称单细胞克隆。
选择性筛选：根据细胞对药物的抗性、营养要求或温度敏感性等的不同，选择适当的培养条件，将杂交细胞分离出来。可分为抗药性筛选系统、营养缺陷型筛选系统、温度敏感型筛选系统。
【a.原理：（1） 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。（2）化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。（3）电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。】
答：a. 正常的B淋巴细胞不能在体外条件下长期生存，因而不能在体外持续产生抗体。而骨髓瘤细胞可以在体外快速生长但不能分泌抗体。将骨髓瘤细胞和淋巴细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，既能在体外长期生存又能分泌抗体。
【原理：杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。】
b.技术过程：（1）亲本细胞的准备：①致敏B淋巴细胞的准备：免疫用的目的抗原是各种病毒、细菌、癌细胞等。采用小鼠腹腔或皮下注射，每隔3～4d注射一次，连续3～4周后，检查抗体滴度效价。若符合要求，再由尾静脉作最后一次加强免疫，4～5d后，取脾脏分离B淋巴细胞备用。②骨髓瘤细胞的准备：骨髓瘤细胞应尽可能与B淋巴细胞来源相同的种系，
而且必须具有代谢缺陷特征（HGPRT或TK）。另外，还要优化骨髓瘤细胞的培养条件，使其克隆形成率达到80%以上。
（2）细胞融合：按一定比例（多为5:1）将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，并加入PEG诱溶剂诱导细胞融合。
（3）杂交瘤细胞的筛选：融合后将细胞转移到HAT培养液中，培养1～2周后，只有杂交瘤细胞存活并形成细胞集落。
（4）可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞的筛选：以杂交瘤细胞生长孔内的上清液为一抗，以放射性核素、酶或荧光素标记的兔/羊抗鼠IgG为二抗，利用放射性核素测定、底物显色或在荧光显微镜下观察荧光颗粒，判断上清液中是否含有相应的抗体。
（5）杂交瘤细胞的克隆化培养：有限稀释法是将稀释到一定密度的细胞接种到96孔培养板中，尽可能使每个孔只有一个细胞生长。软琼脂培养法利用软琼脂半固态性质，使单个的杂交瘤细胞在相对固定的位置上增殖形成细胞克隆。
（6）单克隆抗体的生产和纯化：一种是体外培养杂交瘤细胞，收集上清液，通过离子交换、凝胶过滤等方法纯化得到单克隆抗体。另一种是将杂交瘤细胞接种到同系小鼠的腹腔中生长，然后抽取腹水，通过离子交换、凝胶过滤等方法纯化得到单克隆抗体。
【（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。】
答：供体与受体的同步化，胚胎的游离状态，胚胎与受体的关系及胚胎移植中的免疫问题。（见课本P224）
答：原则：胚胎移植的同一性，胚胎发育的期限，胚胎的质量。
基本程序：供体和受体的选择，供体超排处理与配种，受体同期发情处理，胚胎回收与鉴定，胚胎移植等。（见课本P225，P226）
答：动物种类，卵细胞供体母畜年龄及性机能和卵巢状态，卵母细胞类型，卵巢运输、取卵方式和季节，培养系统（温度和湿度、空气环境或气相、培养基）。
答：显微受精是借助于显微操作的体外受精，分为ICSI（卵胞质内受精）和SUZI（带下受精）两类（具体见课本P255）。
影响因素：精子注入卵母细胞的注射部位，精子的状态，精子发生，卵子状态，显微受精卵的激活，显微操作环境条件（多精子注入，操作技术）。
答：（1）卵裂球分离培养法：对早期卵裂阶段的胚胎，一般采用卵裂球分离培养法进行同卵--
双生或同卵多生动物的培育。用固定吸管吸引固定胚胎，用显微玻璃针自上而下切开透明带使其形成一个切口，用微吸管自切口处伸入透明带吸住半数卵裂球，慢慢吸出，即可将胚胎等份的分为两部分。
（2）桑葚胚及其以后阶段胚胎的直接分割法：可不进行固定而直接分割。由于透明带韧性较强，分割之前分可先用链霉蛋白酶进行软化处理。
①显微玻璃针分割法：把显微玻璃针的分割部调节到胚胎的正上方，然后把针沿胚胎正中的二等分线向下移动，把胚胎轻轻压住，针稍微陷入透明带，由此把胚胎固定在分割针与分割皿表面之间，继续下切，胚胎被压扁，调整分割针使其稍向前用力，胚胎即被切开。
②显微刀片分割法：此法较为简单，用固定吸管固定胚胎即可进行分割，也可以不经固定而直接分割，简化了胚胎分割过程，主要用于较晚阶段的胚胎分割。
③胚胎徒手分割法：这种方法可不需要显微操作仪的帮助而直接进行徒手分割，或者先用显微手术刀切开透明带的一部分，再用玻璃针分割胚胎团。
答：胚胎细胞、胚胎肝细胞、胎儿成纤维细胞以及成年体细胞的每一个细胞核具有相同的遗传物质。发生早期分化的胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，可因其特殊因子的作用，使植入核基因表达被重新编排或调整，将“发育钟”拨回到受精状态，即恢复全能性。胚胎干细胞具有全能性及调整能力。胎儿成纤维细胞和成年体细胞等已分化细胞同样具有潜在发育全能性，经过去分化培养，可以恢复其全能性。因而，经过核移植后的重组胚胎可以正常发育为具有相同遗传物质的新个体。
答：（见课本P278）。
（非要求：）
原代细胞系：是原代细胞经首次传代成功后即为原代细胞系。
【指从机体中取出而直接培养的细胞，从一代到十代的细胞培养是原代培养，形成的整个系统叫原代细胞系。】
间接筛选：是借助与突变体表型有某种相关特征作指标进行筛选的方法。
直接筛选：是指利用在选择条件下细胞突变体可优先生长的特点进行的筛选。
P54：
3.谈谈你对生长培养基和维持培养基中各种组成成分及其在动物细胞培养中所起作用的认识。
答：生长培养基成分：水、无机盐、微量元素、维生素、缓冲系统、能源和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂。
生长培养基各种组成成分作用：
（1）水：水是细胞主要组成部分之一，在细胞内主要起溶剂作用。细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水里；细胞的化学反应、细胞的运动等也离不开水。水是离体培养细胞的重要生存环境。
（2）无机盐：用于培养细胞的培养基，其渗透压必须接近或等于细胞本身的渗透压，即等渗溶液。
（3）微量元素：缺乏微量元素的培养基对任何真核细胞的培养都是不合适的。
（4）维生素：动物细胞培养也需要维生素，动物细胞需要的维生素种类通常比植物细胞多一些。
（5）缓冲系统：维持培养基的pH。
（6）能源和碳源：葡萄糖是动物细胞的主要碳源大多数细胞通过1~4g/L葡萄糖获取能量，丙酮酸、琥珀酸、肌酸常常成为动物细胞的补充能源。
（7）氮源：为动物细胞合成蛋白质和核酸提供原料。
（8）激素和生长因子：是培养动物细胞生长和增殖必不可少的物质。
（9）添加剂：微量改变培养基的粘滞性和起沫属性，常常像培养基中加入各种添加剂。 生长培养基：促使培养细胞快速生长和增值的培养基。
维持培养基：对动物细胞来说，一般只要将生长培养基中的血清浓度降低或全部除去，就可以获得维持培养基。维持培养基的主要特点是能在数周内使培养细胞保持良好的状态，而不会使细胞的特性受到损害，其目的是提高培养细胞的生产力，更多更快的生产目的产物。 P90
7.简述植物细胞培养单细胞分离方法及培养方法。
答：a.单细胞分离方法：
（1）机械法：机械法是从完整的植物器官中分离单细胞的方法之一。（2）酶法：单细胞分离的酶法是指利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离的方法。（3）化学法：单细胞分离的化学法是指利用一些化学药剂游离细胞的方法。
b.培养方法：
（1）细胞悬浮培养：是将植物游离细胞或细小的细胞团，在液体培养基中培养的方法。（2）看护培养：是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。（3）平板培养：按一定细胞浓度制备好单细胞悬浮液，再将含琼脂的培养基加热熔化后冷却至35°C左右，尚未凝固时与细胞悬液混合，迅速倒入培养皿形成一平板进行培养。（4）微室培养：是在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮培养液培养在少量培养基上，再使其分裂增殖形成细胞团的方法。
P207
10.体外培养细胞的细胞分裂是否同步？如何得到同步化的细胞？
答：体外培养细胞的分裂增殖活动是比较旺盛的，但并不同步。获得同步化细胞可以从两条途径着手：一是诱导细胞同步化；二是分离同步化的细胞。
振荡收集法、秋水仙胺阻抑法、N2阻断法，此方法较秋水仙胺阻抑法好。
2012年《细胞工程学》复习
一、名词解释（20分，10题，每题2分）（2个左右英文）
二、填空（20分，40空，每空0.5分）
三、选择题（10分，10题，每题1分）
四、简答题（30分，6题）
五、问答题（20分，2-3题）
一、名词解释。
（植物：）
方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得新的有用性状的细胞系或生物体的有关理论和技术方法的学科。【它是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。】
宜的条件下，细胞具有发育成完整个体的潜在能力。
或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。（或：当继代培养时，将原培养物切割或不切割转移至新的培养基中的材料称为外植体。）
【从植物体上分离下来的，用于初代离体培养的材料。】
（愈伤组织(callus)：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团，称为愈伤组织。或：在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，
这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。）
管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚
或胚状体（不定胚、无性胚）
（见胚状体）
体细胞无性系（somaclones）。这些植株所表现出来的变异称之为
体细胞无性系变异。
（直接筛选：是指利用在选择条件下细胞突变体可优先生长的特点进行的筛选。）
，即原生质体融合（protoplast fusion），指在人工控制条件下，
不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。
（四种融合形式：异核体或异核细胞，杂种原生质体或合子细胞，同核体，非对称杂种过细胞质杂种。）
【附词：细胞融合类型：
（1）同核体（homokaryon）：同源原生质体的融合体。自体融合。
（2）异核体（heterokaryon）：非同源原生质体的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育成个体的也是可能的。如烟草属种间的细胞杂种。
（3）多核体（polykaryon）：含有双亲不同比例核物质的融合体。一般是亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质。
例：胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。
（4）异胞质体（heterocybrid）：胞质体×有核的原生质体→异胞质体细胞杂种（含本种的细胞核，及异种的细胞质）。
矮牵牛×爬山虎。核：爬山虎，质：双亲（即有爬山虎、又有矮牵牛）。
（5）嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体、发生膜融合和胞质融合后，尚未发生核融合，双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物。】
（自发融合（spontaneous fusion）：当细胞壁被溶解后，胞间连丝发生膨大，相邻细胞原生质和细胞器通过膨大的胞间连丝融合形成同核体，实现原生质体的自发融合，这种融合仅限于同一物种内。）
行融合。
（对称融合（asymmetric fusion）：即两个完整的细胞原生质体融合。（自体融合、异体融合））
液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。（或：生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基。）
（条件培养基即预先培养过合适花药的培养基。条件培养实质上是一种花粉细胞悬浮培养方法，与普通细胞悬浮培养方法的不同之处在于，在液体培养基中加入了一定浓度的条件培养基，条件培养基一般是花药提取液。）
织上放一个小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上，当培养细胞长出微小细胞团后，将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。（是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂增殖的方法。）
养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，又称微室悬滴培养。它是为进行单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术，运用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂的全过程、胞质环流的规律等进行活体连续观察。这一方法同样也可用于原生质体培养，用于观察细胞壁的再生与细胞分裂过程。微室培养是细胞学研究的优良实验体系。
【植板率：是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例，或：长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分比。
】
件下使之生长发育的技术。
（是指使胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。广义胚胎培养研究还包括胚珠培养和试管受精等技术。）
胚发育阶段，在未达到生理和形态成熟时迅速萌发长成幼苗，这一现象称早熟萌发。（或：幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。
）
花粉萌发进入胚珠，完成受精作用。因全过程，即从花粉萌发到精卵细胞融合受精形成种子，直到种子萌发产生幼苗，均在试管内完成，也称为离体受精或植物生殖工程。
分和保护功能的人工胚乳和人工中皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。
人工种子亦称体细胞种子。早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮包被后而形成的体细胞种子。任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。
in vitro
propagation）、微型繁殖（micropropagation）或快速繁殖（rapid clone propagation），是指利用组织培养方法进行植物离体培养，在短时间内获得大量遗传性一致个体的方法。
（离体无性繁殖是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。）
超净无菌的条件下培养不带病菌的植株，进行营养繁殖，快速繁育和生产出无病毒的种苗、种薯、应运于大田生产。
【由人工用物理、化学和生物方法将植物体组织器官病原体消除，以使这些组织器官生成完整植株。】
（动物：）
【附词：细胞系(cell line)：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。
有限细胞系(finite cell line)：如果细胞系不能继续传代或传代数有限，它由原代培养中的许多细胞系列组成。
连续细胞系(continuous cell line)：如细胞系可连续传代，即已建成的细胞系(establisted cell line)。
细胞系的转化：细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其它特性的可遗传的变化。
体外恶性转化(in vitro malignant transformation)：细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物，可以产生肿瘤。
】
体取得材料开始，在培养瓶内培养至第一代传代前的这一过程。
释，将细胞从一个容器转移到另一个容器中的培养称为传代培养，简称传代。
经过30~50次传代，只有少数细胞系发生了转化，获得永久性，可以度过这一死亡“危机”，从而在体外永久存活下来，成为连续性细胞系（continuous cell line），或称已建立的细胞系（established cell line），或称永生性细胞系（immortal cell line）。
【大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，在体外永久存活下来发育成永久细胞系或称连续细胞系。】
经传代培养后即成为有限细胞系。有限细胞系：多数二倍体细胞系，最多在体外生存一年左右，传代30~50次，就衰老死亡了，这种传代次数有限的细胞系称为有限细胞系。
【经继代培养后细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，经过运动世代后细胞将逐渐死亡。】。
转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化。
是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。玻璃态固体分子之间的空间排列和液态相比无明显变化。玻璃化研究的核心是：1.寻找容易实现玻璃化并且对细胞损害较少的溶液。2.设法提高冷冻速度。
（加快降温速度，使细胞内水冻结冰晶体积非常小，出现玻璃状的冻结现象，从而也可使细胞免受伤害，达到细胞冻存的目的。）
（非玻璃化冻存：采用缓慢降温和快速复苏的方法以及在冻存液中加入冷冻保存剂，尽可能减少细胞的冰晶损伤和溶质损伤，提高复苏后细胞的活力。）
于适当基质上进行增殖培养的方法，它适用于一切贴壁依赖性细胞以及兼性贴壁细胞。 适用于非贴壁依赖性细胞，也可用于兼性贴壁细胞。其操作方法与植物细胞悬浮培养相似。
【是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。】
某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。
选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1／S期交界处；一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于M期。
stem cell）是一类具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。胚胎干细胞又称为多能干细胞（pluripotent stem cell，
PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后，筛选出的具有发育全能性的细胞，是已知的分化潜能最广的一类干细胞。
一个细胞的技术。所得到的融合细胞叫杂交细胞。
（细胞融合（cell fusion
）：通过培养和诱导，将两个或两个以上细胞合并成一个双核或多细胞的技术。）
（细胞重组（cell reconstruction）：将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介质诱导下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。包括核移植和染色体转移等。）
在离心过程中，细胞核及其外面包围的少量细胞质和细胞膜由细胞中央部位向外突出，直至脱离细胞而成为核体。剩下的无核部分称为胞质体。
无核细胞（anucleate cell），由完整细胞的绝大部分细胞质组成，外面包有细胞膜。（胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。）
小型细胞（minicell），含有完整细胞核，外面包围着少量细胞质和细胞膜。（核质体：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微
小原生质体(miniprotoplast)。）
秋水仙素（colchicine）处理后，细胞核可分裂成若干个分别含有几条甚至一条染色体的微核（micronucleus），再经CB（细胞松弛素B）处理和离心作用，微核便从细胞质中分离出来，形成外面包有细胞膜和少量细胞质的微细胞。
单克隆抗体技术（monoclonal antibody technology）。
（百度：即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。）
（单克隆抗体：一种浆细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子。从一个单克隆细胞产生的抗体分子，即称为单克隆抗体，其具有独特的均一结构。）
（杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：
（1）抗原制备；
（2）免疫动物；
（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；
（4）细胞融合；
（5）杂交瘤细胞的选择培养；
（6）杂交瘤细胞的筛选；
（7）杂交瘤细胞的克隆化；
（8）单克隆抗体的检定；
（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；
（10）单克隆抗体的大量制备。）
（杂交瘤细胞(hybridoma cell)：既具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又能象骨髓瘤细胞那样在体外长期快速无限增殖的细胞。（或：杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和
B细胞融合而成的细胞。））
补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。
分裂而停止增殖，这种现象叫接触抑制。（或：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片形成连续性细胞单层后，即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞扩展运动停止，细胞就不再分裂而停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制。）
（密度抑制（density inhibition）：当细胞的数量达到一定量后，细胞的增殖受到抑制，生长速度减缓，出现细胞生长的密度抑制现象。（或：当细胞在基质上分裂增殖，达到一定密度时，营养液中营养成份下降，有毒代谢产物积累，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为密度抑制现象。））
次地分割，然后分别移植给受体，妊娠产生多个遗传性状相同的后代的克隆方法。
（胚胎分割（多细胞复制）：将未着床的早期胚胎经显微手术后，分割成多等份，给每个受体内植入一块分割物而妊娠产仔的方法，一个胚胎克隆多个遗传性能完全一样的后代个体。）
群的过程。
经过人为选择，获得在遗传上纯一的后代的技术或过程。专指一般DNA在与载体DNA分子重组后，重组DNA分子由载体导入寄主细胞内，依赖载体的复制能力在寄主细胞中进行扩增，形成一个无性繁殖系的过程。）
二、问答题。
答：基本实验室：
准备室：进行一切与实验有关的准备工作，进行药品的保存、配置、消毒、分装等。器具的洗涤、干燥、消毒，生理生化指标的测定等。要求宽敞明亮，通风条件好。分为洗涤区、灭菌区、贮藏区和培养基配制区。
接种室：进行无菌操作，材料的接种。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。外设缓冲间—放置拖鞋，工作服，工作帽等。分为缓冲准备区、接种区。
培养室：对离体植物材料进行控制无菌培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。可根据培养规模，分为若干个培养室。
细胞学实验室：进行培养材料的组织学.细胞学.观察照相等。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。
生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化基本设备配置验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。
答：培养基基本成分：
水：水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95％。 原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水。如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净水以降低生产成本，提高生产效益。
无机盐类大量元素：培养基的使用量一般在每升几十至几千毫克。包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
微量元素：微量元素的用量一般低于10-5～10-7g分子浓度。有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co。
糖：是碳源和能源，多利用蔗糖。
维生素：B1是必需的，B6、烟酸等，原生质培养含有大多数基本维生素。
氨基酸：细胞原生质培养特别需要，水解酪蛋白。
激素：细胞分裂素--BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（异戊烯酰嘌呤，生长素--2.4-D，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯抑制。 琼脂、卡拉胶：固体培养。
活性炭：防止外植体变褐。
附加复合成分：椰子汁、酵母提取液。
答：光照：组织培养通常在散射光线下进行。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能
形成芽和根（光照时间影响植株再生状态）。
温度：在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合。 渗透压：渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。
通气：悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。
PH：通常使用的pH值范围是5.5～6.5。PH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。
答：激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的数量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。
在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样。如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高。
生长素/细胞分裂素高，有利于根分化；
生长素/细胞分裂素低，有利于芽分化。
生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体。
答：植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根(adventitious roots)、不定芽(adventitious shoots)等器官的过程。
器官发生方式：先芽后根，先根后芽，根芽同步发生。
器官发生过程：
经过愈伤组织的器官发生：愈伤组织形成→生长中心形成→器官原基及器官形成。
不经过愈伤组织的器官发生：在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种情况：
一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。
（1）起始材料对器官分化的影响：
总体上说，被子植物比裸子植物容易培养。在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。草本植物比木本植物容易培养。通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力。同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异已是不争的事实。基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。外植体对诱导反应及其再生能力的影响还体现在生理状态上。来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体更易成。外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。
（2）激素对器官发生的影响：
离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。
GA3，Eth，ABA在器官分化中也具有一定调控作用。
生长素/细胞分裂素高，有利于根分化；
生长素/细胞分裂素低，有利于芽分化。
生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体。
（3）光照对器官分化的影响：
光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、光照强度以及光质对器官分化均有影响。连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。 培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。
（4）基因调控对器官分化的影响：
Banno等(2001)从拟南芥根培养再生芽的体系中克隆了一个增强芽再生能力的基因ESR1，将该基因与35S启动子连接转化拟南芥，在有细胞分裂素存在的情况下转基因外植体可以显著提高不定芽的分化率。生长素不能诱导该基因表达，也不能提高不定芽分化频率。
答：体细胞胚从外植体上直接发生；经过愈伤组织的体细胞胚形成；经过悬浮细胞的体细胞胚形成。
（1）激素的调控作用：2,4-D是应用最为广泛的生长素。2,4-D的应用有规律性的变化，首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素有利于体细胞胚的继续发育。
细胞分裂素对体细胞胚发育的影响研究报道较少，但几乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均有细胞分裂素的配合使用。细胞分裂素在促进细胞分裂，维持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚胎发育细胞分裂是基本前体，当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作用。
（2）培养基及培养条件的影响：培培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，一些氨基酸可以代替还原态氮的作用。
一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。 一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。
（3）基因型的影响。
答：体细胞变异的细胞遗传学基础：
DNA核内重复复制：DNA重复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生，细胞内DNA含量就会不断上升。
染色体断裂与重组：染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现
染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。产生染色体结构变异的再生植株一般生长不正常，生活力低下，很难长期生存，因此以保存种质资源为目的的离体培养应尽可能避免这种变异发生，以免造成基因资源流失。
非正常有丝分裂：离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖遗传稳定差。纺锤体形成异常使得有丝分裂不正常是其原因之一。核裂经常导致双核与多核细胞的出现。 体细胞变异的分子遗传学基础：
基因水平上的变异从根本上讲就是DNA水平上的碱基突变或修饰状态的改变。
碱基突变：碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。突变碱基的DNA序列处于结构基因的位置或调控序列的位置时，即可导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之
一。对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。
DNA序列的选择性扩增与丢失——DNA序列的扩增与丢失也是体细胞无性系变异的原因之一。
转座子活化：上个世纪80年代，Larkin和Scowcroft首先提出，转座因子的活化可能是体细胞无性系变异的原因之一。
DNA甲基化：DNA甲基化在基因表达调控中具有重要作用。DNA甲基化和去甲基化，不仅能通过调控基因的表达与关闭来控制生物的发育，同时也可以通过DNA甲基化途径来适应环境对生物体的压力。
答：（1）诱变起始材料的选择：
选择起始材料需考虑以下几方面的问题:
其一，目标性状的可行性。体细胞突变性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状是体细胞突变系选择的目的。
其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平。
其三，适当的细胞类型亦是体细胞突变系筛选效率的重要条件。 如原生质体、单细胞、小孢子等有较高的诱变频率。
（2）诱变方法：
物理诱变：X射线、γ射线、快中子、紫外线等。
以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的γ射线、快中子等进行辐射。
以细胞或原生质体，则可以选择X射线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料时，可以使用紫外线照射，因为常用紫外线的波长为270nm，与DNA吸收波长260nm相近，而原生质体因为没有细胞壁的屏障，对紫外线的敏感性较强，从而可以达到较好的诱变效果。 化学诱变：常用的化学诱变剂主要有：
烷化剂（硫酸二乙酯 DES、乙基磺酸乙酯 EES、甲基黄酸乙酯 EMS、环氧乙烷 EO、乙烯亚胺 EI），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与DNA分子中的碱基或磷酸基结合，改变DNA的结构而引起突变；
碱基类似物（5－溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物、2－氨基嘌呤是腺嘌呤类似物），在细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺入到新合成的DNA分子中引起错配；
移码诱变剂，如ICR化合物和吖啶类似物等。
此外亚硝酸、羟胺等某些抗菌素等亦可引起突变产生。
转座子插入：诱变转座子插入诱变是近年来利用分子生物学技术发展起来的新的体细胞变异
诱导方法。转座子既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能诱导变异。
（3）突变体的选择：
直接选择：其方法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。
间接选择：间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。
答：a.物理消毒灭菌：干热、湿热、过滤、射线等；化学消毒灭菌：消毒剂、抗生素等。
（1）干热消毒灭菌法；（2）湿热消毒灭菌法；（3）过滤除菌法；（4）射线消毒灭菌法；（5）酒精灯消毒灭菌法；（6）消毒剂消毒法；（7）抗生素抑菌法。
b.培养材料的消毒灭菌：采用自然界的实验材料，携带微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。采来的实验材料先用流水冲洗10～20min或更长时间，然后在一定浓度药剂中浸泡处理（须在超净工作台上操作），进行表面消毒灭菌。所用的药剂种类、浓度、处处理时间随植物种类和取用的器官部位的不同而异，常用消毒剂的灭菌效果见表3-2。消毒剂对植物组织是有毒的，应正确选择其浓度和处理时间，减少它对组织的伤害。经过灭菌的培养材料，需用无菌水洗4～
5次，沥去水分待用。
答：a.（1）提供对维持细胞指数生长的激素和氮源；
（2）提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其它激素等，能结合或调节它们所结合的物质活力；
（3）有些情况下，结合蛋白能与有毒金属和热原结合，起到解毒作用；
（4）起促进细胞在培养基质上附着和铺开的作用；是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子的来源；
（5）起酸碱度缓冲剂的作用；
（6）提供蛋白酶抑制剂，使细胞传代时使用的胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。
b.判断无血清培养基是否适合动物细胞的生长和增殖，主要看其中有没有替代血清成分的明确的补充成分，可以有四类：激素和生长因子，结合蛋白，贴壁和扩展因子，微量因素和低分子质量的营养成分。（通过观察细胞的大小，检验培养基里的产物，可以判断。）
答：意义：（1）繁殖速度快，经济效益高；（2）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗；（3）有利于繁殖各种珍稀、濒危苗木和突变体，为育种服务。（能够有效地保持优良品种的特性；快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；生产无病毒种苗，防止品种退化；节约耕地，提高农产品的商品率；便于运输。）
类型（方式）：不定芽型，器官型，器官发生型，胚状体发生型，原球茎型。
答：a.物理方法：高温处理（即热处理或温热疗法），低温处理（冷疗法）。化学方法；生物
方法：茎尖培养，微体嫁接法，珠心组织培养法，愈伤组织脱毒。
b.茎尖几乎不含病毒，采用旺盛分裂的茎尖组织培养，就有可能去除病毒。此法能与快速离体繁殖相结合，周期短，效率高。
c.直接测定法，指示植物法，抗血清鉴定法，电镜检查法，分子检测法。
答：（1）次生物质的生产是在可控条件下进行的，因此可以通过改变培养条件和筛选新细胞系得到超过整株植物产量的代谢产物。不仅可以节约资源，而且可以减少所占用的耕地面积；
（2）培养细胞是在无菌条件下生长的，因此可以排除病菌和虫害的侵扰；（3）可以进行特定的生物转化反应；（4）可以探索新的合成路线和获得新的有用物质。
答： a.分离方法：（1）机械分离法：借助于利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放；（2）酶解分离法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，使细胞壁被降解，获得有活力的原生质体。原生质体的分离步骤见课本P99，P97。
b.原生质体培养
包括：原生质体分离、纯化、培养体细胞壁再生、细胞团形成、器官形成、植株再生等步骤。原生质体在适宜培养基和适宜培养条件下经培养2～4d可再生细胞壁，并很快进行细胞分裂，30～60d出现肉眼可见的细胞团，以后再继续分裂增殖，几个月后形成愈伤组织或胚状体，最后形成完整小植株。培养方法：固体薄层培养法，液体浅层培养法，双层培养法。
答：a.（1）化学融合：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。
（2）电融合：利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间脉冲使质膜发生可逆性电击穿，促使原生质体融合的方法。
b.理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，
为远源物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA也可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
（分为自发融合和诱发融合。自发融合是无意义的。）
答：形态学鉴定，细胞学鉴定，同功酶鉴定，DNA分子标记鉴定。（举例见课本P112）
答：培养材料的选取与制备，植株再生，单倍体植株鉴定和染色体加倍。
（花药培养基本程序：外植体选择→外植体（花蕾）预处理→外植体消毒→剥取花药→接种→诱导培养→分化培养。）
答：花药和花粉培养与其他植物组织培养工作相比，对供试材料的要求更加严格，选取适宜材料，做适当的处理，制备出适宜的初代外植体是取得成功的第一个重要环节。基因型、小孢子发育时期及生理状态等对花药和花粉培养效果具有极大影响，因而是材料选择所要考虑的主要因素。
基因型选择、花粉发育时期的选择、生理状态的选择。（见课本P119）
答：a.花药和花粉植株的倍性与植物的种类、接种材料的类型、接种花粉的发育时期、培养基中的激素种类和浓度、花粉植株的发生方式及愈伤组织继代培养时间的长短等因素有关。 b.花药植株倍性混杂的原因是体细胞组织的干扰和生殖细胞的自发加倍。
（1）体细胞组织的干扰。花药构造包括药壁、药隔、药囊、花粉，花粉又与花丝相连。药壁、药隔、花丝都是体细胞组织，在离体培养条件下也能再生出植株，而且在很多情况下比花粉更易诱导生成再生植株，由这些体细胞再生出的植株一般都是二倍体；
（2）生殖细胞的的自发加倍，即核内有丝分裂不正常，形成不完全的细胞壁，造成核分裂与细胞壁形成不同步而发生核融合现象，这种再生植株便是二倍体或多倍体。
答：方法：形态鉴定，结实性鉴定，染色体数目鉴定，遗传标记鉴定（生化标记鉴定，分子标记鉴定）。（见课本P129）
答：a.植物胚胎培养包括：幼胚培养，成熟胚培养，胚珠培养，子房培养，胚乳培养，试管受精等内容。
b.（1）克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物；（2）打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限；（3）使生活力低下或无生活力的种子萌发；（4）
使柑橘类植物合子胚正常发育；（5）测定种子生活力；（6）获三倍体或单倍体植株；（7）快速繁殖特殊植物；（8）用于理论研究。
答：a.离体授粉指在无菌条件下，培养未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠，完成受精作用。因全过程，即从花粉萌发到精卵细胞融合受精形成种子，直到种子萌发产生幼苗，均在试管内完成，也称为离体受精或植物生殖工程。
b.该技术在育种实践上可克服自交不亲和性和远缘杂交障碍。此外，
采用远缘花粉授粉可诱导单性生殖产生单倍体植物。试管受精技术也为外源特异基因的有性转移，诱导遗传变异开辟了一条新途径。
c.（1）收集花粉；（2）剥取子房和胚珠；（3）离体受精方法（子房试管授粉：直接引入法，注射法；胚珠试管授粉：哺育法，接近法）。
答：a.人工种子指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工中皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。
b.优越性：人工种子的意义：（1）人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；（2）不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产；（3）有利于繁殖生长周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁
殖无病毒材料；（4）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质；
（5）体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。
局限性：人工种子存在种皮的缺陷，有菌条件下发芽率低，贮藏难，生产成本高，制作流程复杂等问题。
答：低温保存，超低温保存，生长抑制剂保存。（见课本P157）
答：见P151超低温保存原理。（在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存的目的。）
a.低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境后正常进行细胞分裂和分化就是在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存目的。植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料投放到液氮中，细胞和组织由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡。可见，超低温保存的植物材必须借助于冷冻防护剂。冷冻防护剂属于分子质量低的中性物质，
如甘油、脯氨酸、二甲基亚砜（DMSO）等，在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，水固化程度减弱，对降低培养基、植物组织、细胞的冰点起重要作用。特别是DMSO的发现，使植物种质在超低温环境中得以保存，因为它极易渗入细胞内部，防止细胞冰冻或融冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。另外，冷冻保护剂的使用可以提高培养基渗透压，导致细胞轻微质壁分离，提高组织和细胞的抗寒力。
b.超低温保存的基本程序：预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻和再培养。
答：a.影响因素：预处理方法、冷冻方法、解冻方法对植物材料冷冻保存效果产生重要影响，还有一些其他因素，如：植物材料的性质，冷冻防护剂。
b.综合考虑实验要求、经济条件等各种因素选择合适的实验方法，尤其要注意的是不同性质的保存材料应选择相应的保存措施，如胚状体材料以幼龄球形胚为佳、幼苗和成长植株以茎尖组织为佳；冷冻防护剂在一段时间内逐渐加入。
答：a.原代培养方法：（1）组织块接种培养法：无菌条件下，从有机体内取出组织，用平衡
3盐溶液漂洗数次，洗去血污，并剔除多余成分；剪成1mm大小的组织小块；均匀接种于培养
瓶底部，采用薄层培养法或翻转干涸法使组织小块贴壁。（2）酶解培养法：无菌条件下，从
3有机体内取出组织，用平衡盐溶液漂洗数次，洗去血污，并剔除多余成分；剪成1mm大小的
组织小块；用胰蛋白酶或胶原酶溶液消化；将制备成的单细胞悬液，接种到培养基中培养；数天后，细胞贴壁生长，并铺满培养瓶底部，形成细胞单层。（3）鱼类细胞组织块原代培养。
（4）哺乳动物和鸟类的原代培养。
【原代培养：（1）组织块接种培养：直接切割分离的组织块，在一定程度上保持了原有的组织结构，对于初期体外培养的环境适应性比直接分离成单细胞要强，因此，短期组织块培养
成为动物细胞培养的材料来源之一。（2）单层细胞培养：更换培养基容易，便于观察不同条件对细胞生长的影响，从而灵活调节培养条件；培养后期容易使用灌注技术改善营养条件；细胞贴附于基底质上，更容易表达产物。（3）悬浮细胞培养：适用细胞具有非贴壁特性的细胞，如血细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。】 b.传代培养方法：（1）贴壁培养：原代培养物或传代细胞形成细胞单层后，倒掉旧培养液；用PBS或PE洗细胞单层1～2次，以洗去死细胞和残存的培养液；加入适量的0.25%的胰蛋白酶溶液消化细胞单层，制备单细胞悬液；取1/2悬液接种于另一培养瓶，分别补加培养液后，于培养箱中静置培养。（2）悬浮培养：非贴壁依赖性细胞，如血细胞、淋巴细胞等，可用此法进行培养。但动物细胞无细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气，因此动物细胞的悬浮培养与微生物发酵又大不相同。实验室悬浮培养可在配有磁力搅拌的三角烧瓶内进行，或将三角瓶烧放在摇床上进行。传代时，只需离心去掉旧培养液，换上新培养液即可。
答：a.生长曲线一般分为潜伏期、指数生长期、平台期和衰退期四个时期。
（1）潜伏期：细胞有生长活动而无细胞分裂，是细胞分裂前的准备时期。一方面细胞逐渐适应新的环境，另一方面，细胞不断积累分裂增殖所需要的某些物质，使之达到一定的浓度，以便使细胞能够跨入分裂期。（2）指数生长期：细胞数目成倍增长，细胞活力最佳，进行实验研究一般选择此期细胞。（3）平台期：接触抑制即当细胞长满瓶底，形成连续性细胞单层后，细胞就不再分裂而停止增殖。在平台期，虽然细胞仍能存活一段时间，但如果不及时传代，就会影响细胞活力。（4）衰退期：平台期后，由于没有及时传代，培养液中得营养物质耗尽，代谢废物累积，pH降低，使细胞发生中毒性改变，甚至脱落死亡。
b.细胞系的演化是指细胞系从原代培养开始直至衰老死亡的整个生命历程。可分为三个阶段：原代培养阶段，有限细胞系阶段和连续培养系或衰老死亡阶段。
c.终末分化细胞失去分裂增殖能力，获得特异分化性质，执行特定分化功能，如肌肉细胞、肝脏细胞、表皮细胞等。在体内生长环境下，这些分化细胞的分化状态是稳定的、不可逆的。但是这些终末分化细胞在体外人工环境下，往往可以获得分裂增殖的能力，有些细胞还会失去其特异分化性质，如肝细胞失去精氨酸酶活性，不能贮存糖原，不能分泌血清蛋白，甚至通过诱导也不能再现，这种现象称为体外培养细胞的去分化。去分化的原因可能是由于缺少适当的诱导环境，使细胞不能表达分化特征，加上细胞对体外环境的不适应而发生了变化。
答：a.检查：培养液pH，细胞健康状况，微生物污染及其排除（细菌污染、真菌污染、支原体污染、病毒污染），细胞交叉污染，化学物质污染。
b.细菌污染较轻的，培养液仍清亮，但细胞生长缓慢；污染严重时，培养液变浑浊。排除污染方法：向培养液中加入5～10倍常用剂量的抗生素，冲击细胞24～48h，再将细胞转入正常培养液。
真菌（霉菌）污染肉眼可见到白色，黄色或黑色的菌落，光学显微镜下可见到丝状、树枝状或瘤状的菌丝，纵横交错，穿行于细胞之间。
支原体污染需采用专一性的方法鉴别，如DNA荧光染色法、支原体培养法、免疫学方法、PCR等。排除污染方法：抗生素处理，特异性抗血清处理，高热处理，巨噬细胞和抗生素联合处理，鼠的传代处理。
病毒污染细胞病变效应（CPE）如蚀斑，可作为早期检测病毒污染的指示特征。
细胞交叉污染：实验器材如吸管最好用一次即更换，绝不能用带有细胞的吸管吸公共培养液。 化学物质污染：只要培养器皿洗涤干净，培养用液来源可靠，很容易避免。
答：a.之所以要低温冻存动物细胞，是由于体外长期传代培养动物细胞耗时费力费材料，且容易受微生物污染，而且传代过程中细胞的遗传性状也可能会发生改变。低温条件下，细胞的一切代谢活动都停止或极其缓慢，从而避免细胞遗传形状的改变和衰老。
b.非玻璃化冻存：原理：冰晶损伤和溶质损伤，缓慢冷冻和快速复苏细胞以及冷冻保护剂的作用。方法：相对缓慢降温，快速融冻（冷冻步骤，复苏步骤）。（见课本P197） 玻璃化冻存：原理：方法：冷冻步骤，复苏步骤。（见课本P199）
答：a.细胞融合的基本过程：（1）细胞在诱融剂或正弦电场作用下凝集、彼此靠近；（2）两个相邻细胞间的质膜相互融合，随后两个亲本细胞质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等质膜成分也在融合后的质膜上重新分布；（3）细胞质发生融合；（4）细胞核融合，形成单核融合细胞。 b.杂交细胞的筛选方法：非选择性筛选：用机械方法把单个杂交细胞挑选出来，让其分裂繁殖，培养出细胞克隆。也称单细胞克隆。
选择性筛选：根据细胞对药物的抗性、营养要求或温度敏感性等的不同，选择适当的培养条件，将杂交细胞分离出来。可分为抗药性筛选系统、营养缺陷型筛选系统、温度敏感型筛选系统。
【a.原理：（1） 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。（2）化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。（3）电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。】
答：a. 正常的B淋巴细胞不能在体外条件下长期生存，因而不能在体外持续产生抗体。而骨髓瘤细胞可以在体外快速生长但不能分泌抗体。将骨髓瘤细胞和淋巴细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，既能在体外长期生存又能分泌抗体。
【原理：杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。】
b.技术过程：（1）亲本细胞的准备：①致敏B淋巴细胞的准备：免疫用的目的抗原是各种病毒、细菌、癌细胞等。采用小鼠腹腔或皮下注射，每隔3～4d注射一次，连续3～4周后，检查抗体滴度效价。若符合要求，再由尾静脉作最后一次加强免疫，4～5d后，取脾脏分离B淋巴细胞备用。②骨髓瘤细胞的准备：骨髓瘤细胞应尽可能与B淋巴细胞来源相同的种系，
而且必须具有代谢缺陷特征（HGPRT或TK）。另外，还要优化骨髓瘤细胞的培养条件，使其克隆形成率达到80%以上。
（2）细胞融合：按一定比例（多为5:1）将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，并加入PEG诱溶剂诱导细胞融合。
（3）杂交瘤细胞的筛选：融合后将细胞转移到HAT培养液中，培养1～2周后，只有杂交瘤细胞存活并形成细胞集落。
（4）可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞的筛选：以杂交瘤细胞生长孔内的上清液为一抗，以放射性核素、酶或荧光素标记的兔/羊抗鼠IgG为二抗，利用放射性核素测定、底物显色或在荧光显微镜下观察荧光颗粒，判断上清液中是否含有相应的抗体。
（5）杂交瘤细胞的克隆化培养：有限稀释法是将稀释到一定密度的细胞接种到96孔培养板中，尽可能使每个孔只有一个细胞生长。软琼脂培养法利用软琼脂半固态性质，使单个的杂交瘤细胞在相对固定的位置上增殖形成细胞克隆。
（6）单克隆抗体的生产和纯化：一种是体外培养杂交瘤细胞，收集上清液，通过离子交换、凝胶过滤等方法纯化得到单克隆抗体。另一种是将杂交瘤细胞接种到同系小鼠的腹腔中生长，然后抽取腹水，通过离子交换、凝胶过滤等方法纯化得到单克隆抗体。
【（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。】
答：供体与受体的同步化，胚胎的游离状态，胚胎与受体的关系及胚胎移植中的免疫问题。（见课本P224）
答：原则：胚胎移植的同一性，胚胎发育的期限，胚胎的质量。
基本程序：供体和受体的选择，供体超排处理与配种，受体同期发情处理，胚胎回收与鉴定，胚胎移植等。（见课本P225，P226）
答：动物种类，卵细胞供体母畜年龄及性机能和卵巢状态，卵母细胞类型，卵巢运输、取卵方式和季节，培养系统（温度和湿度、空气环境或气相、培养基）。
答：显微受精是借助于显微操作的体外受精，分为ICSI（卵胞质内受精）和SUZI（带下受精）两类（具体见课本P255）。
影响因素：精子注入卵母细胞的注射部位，精子的状态，精子发生，卵子状态，显微受精卵的激活，显微操作环境条件（多精子注入，操作技术）。
答：（1）卵裂球分离培养法：对早期卵裂阶段的胚胎，一般采用卵裂球分离培养法进行同卵--
双生或同卵多生动物的培育。用固定吸管吸引固定胚胎，用显微玻璃针自上而下切开透明带使其形成一个切口，用微吸管自切口处伸入透明带吸住半数卵裂球，慢慢吸出，即可将胚胎等份的分为两部分。
（2）桑葚胚及其以后阶段胚胎的直接分割法：可不进行固定而直接分割。由于透明带韧性较强，分割之前分可先用链霉蛋白酶进行软化处理。
①显微玻璃针分割法：把显微玻璃针的分割部调节到胚胎的正上方，然后把针沿胚胎正中的二等分线向下移动，把胚胎轻轻压住，针稍微陷入透明带，由此把胚胎固定在分割针与分割皿表面之间，继续下切，胚胎被压扁，调整分割针使其稍向前用力，胚胎即被切开。
②显微刀片分割法：此法较为简单，用固定吸管固定胚胎即可进行分割，也可以不经固定而直接分割，简化了胚胎分割过程，主要用于较晚阶段的胚胎分割。
③胚胎徒手分割法：这种方法可不需要显微操作仪的帮助而直接进行徒手分割，或者先用显微手术刀切开透明带的一部分，再用玻璃针分割胚胎团。
答：胚胎细胞、胚胎肝细胞、胎儿成纤维细胞以及成年体细胞的每一个细胞核具有相同的遗传物质。发生早期分化的胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，可因其特殊因子的作用，使植入核基因表达被重新编排或调整，将“发育钟”拨回到受精状态，即恢复全能性。胚胎干细胞具有全能性及调整能力。胎儿成纤维细胞和成年体细胞等已分化细胞同样具有潜在发育全能性，经过去分化培养，可以恢复其全能性。因而，经过核移植后的重组胚胎可以正常发育为具有相同遗传物质的新个体。
答：（见课本P278）。
（非要求：）
原代细胞系：是原代细胞经首次传代成功后即为原代细胞系。
【指从机体中取出而直接培养的细胞，从一代到十代的细胞培养是原代培养，形成的整个系统叫原代细胞系。】
间接筛选：是借助与突变体表型有某种相关特征作指标进行筛选的方法。
直接筛选：是指利用在选择条件下细胞突变体可优先生长的特点进行的筛选。
P54：
3.谈谈你对生长培养基和维持培养基中各种组成成分及其在动物细胞培养中所起作用的认识。
答：生长培养基成分：水、无机盐、微量元素、维生素、缓冲系统、能源和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂。
生长培养基各种组成成分作用：
（1）水：水是细胞主要组成部分之一，在细胞内主要起溶剂作用。细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水里；细胞的化学反应、细胞的运动等也离不开水。水是离体培养细胞的重要生存环境。
（2）无机盐：用于培养细胞的培养基，其渗透压必须接近或等于细胞本身的渗透压，即等渗溶液。
（3）微量元素：缺乏微量元素的培养基对任何真核细胞的培养都是不合适的。
（4）维生素：动物细胞培养也需要维生素，动物细胞需要的维生素种类通常比植物细胞多一些。
（5）缓冲系统：维持培养基的pH。
（6）能源和碳源：葡萄糖是动物细胞的主要碳源大多数细胞通过1~4g/L葡萄糖获取能量，丙酮酸、琥珀酸、肌酸常常成为动物细胞的补充能源。
（7）氮源：为动物细胞合成蛋白质和核酸提供原料。
（8）激素和生长因子：是培养动物细胞生长和增殖必不可少的物质。
（9）添加剂：微量改变培养基的粘滞性和起沫属性，常常像培养基中加入各种添加剂。 生长培养基：促使培养细胞快速生长和增值的培养基。
维持培养基：对动物细胞来说，一般只要将生长培养基中的血清浓度降低或全部除去，就可以获得维持培养基。维持培养基的主要特点是能在数周内使培养细胞保持良好的状态，而不会使细胞的特性受到损害，其目的是提高培养细胞的生产力，更多更快的生产目的产物。 P90
7.简述植物细胞培养单细胞分离方法及培养方法。
答：a.单细胞分离方法：
（1）机械法：机械法是从完整的植物器官中分离单细胞的方法之一。（2）酶法：单细胞分离的酶法是指利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离的方法。（3）化学法：单细胞分离的化学法是指利用一些化学药剂游离细胞的方法。
b.培养方法：
（1）细胞悬浮培养：是将植物游离细胞或细小的细胞团，在液体培养基中培养的方法。（2）看护培养：是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。（3）平板培养：按一定细胞浓度制备好单细胞悬浮液，再将含琼脂的培养基加热熔化后冷却至35°C左右，尚未凝固时与细胞悬液混合，迅速倒入培养皿形成一平板进行培养。（4）微室培养：是在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮培养液培养在少量培养基上，再使其分裂增殖形成细胞团的方法。
P207
10.体外培养细胞的细胞分裂是否同步？如何得到同步化的细胞？
答：体外培养细胞的分裂增殖活动是比较旺盛的，但并不同步。获得同步化细胞可以从两条途径着手：一是诱导细胞同步化；二是分离同步化的细胞。
振荡收集法、秋水仙胺阻抑法、N2阻断法，此方法较秋水仙胺阻抑法好。