常见细菌种属鉴定
摘要：【目的】了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。分析不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。研究细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。【原理】各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 关键词：微生物；细菌；种属；鉴定
Common bacterial species identification
Abstract: [ Objective ] to understand bacterial physiological and biochemical reaction principle, master the identification of bacteria commonly found in the physiological and biochemical reaction method. Analysis of different bacteria on different carbon, nitrogen containing compounds are decomposed using the situation. Studies on bacteria in different culture medium with different growth phenomenon and its metabolites in bacterial identification and significance of. [ principle ] various bacteria with enzyme system is endless and same, on nutrition matrix decomposition ability is different, so the metabolite differences. By physiological and biochemical test methods for detection of bacteria on a variety of substrate metabolism and its metabolites, thus differentiating bacterial species, known as bacterial physiological and biochemical reaction.
Key words: microbe; bacteria; species identification
前言
在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢的过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes ）。许多细菌产生胞外酶（exoenzymes ），这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。
在这部分实验中，通过细菌对大分子物质的水解、糖发酵实验、鉴定肠道菌的不同生理生化反应等几个试验，来证明不同细菌生理生化功能的多样性。
1 .材料和方法
1.1实验器材
1.1.1菌种
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌；
1.1.2培养基
固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基等；
1.1.3试剂和溶液
甲基红，Lugol’s碘液，40%的KOH ，5%的a-萘酚溶液；
1.1.4仪器或其他用具
无菌培养皿，无菌试管，杜氏小管，记号笔，移液管及无菌枪头，棉塞，皮筋，报纸，培养箱等。
1.2试验方法
1.2.1 培养基的制备
1) 固体淀粉培养基
蛋白胨 10g；NaCl 5g；牛肉膏 5g；可溶性淀粉 2g；蒸馏水 1000ml；琼脂 15-20g；121℃灭菌20min 。
2) 糖发酵培养基
蛋白胨水培养基 1000ml；1.6溴加分紫乙醇溶液 1-2ml；pH 7.6；另配20%葡萄糖溶液、乳糖溶液各10ml 。
制作方法:
①将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH=7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的杜氏小管，使充满培养液。
②将已分装好的蛋白冻水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌20min ；糖溶液112℃灭菌30min 。
③灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5ml （按每10ml 培养基中加入20%的糖溶液0.5ml ，则成1%的浓度）。
配置用的试管必须洗干净，避免结果混乱。
3) 葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨 5g；葡萄糖 5g；K2HPO4 2g；蒸馏水 1000ml。将上述各成分溶于1000ml 水中，调pH7.0-7.2，过滤。分装试管，每管10ml ，112℃灭菌30min 。
1.2.2 淀粉水解试验
1) 将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃，无菌操作制成平板。
2) 用记号笔在平板底步划成四部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称，剩余部分为空白对照。
3) 37 ℃倒置培养24-48小时
4) 观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板
5) 观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以初步判断菌体解淀粉的活性。
1.2.3 糖发酵试验
1) 用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别标明培养基名称和所接种的细菌菌名。
2) 取葡萄糖发酵培养基试管4支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、普通变形杆菌，对照
不接种。另取乳糖发酵培养基试管4支，操作同上。
3) 接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡。
4) 将接过种的和作为对照的8支管均置于37℃培养24~48小时。
5) 观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。
1.2.4 MR、VP 试验
1) 配制蛋白胨水培养基，分别接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌各两支，另制两支作为对照。
2) 培养48小时后，将一组葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色者为阴性。
3) 取另外一组培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加入5~10滴40%的KOH ，然后加入等量的5%的a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37°温箱中保温15~30分钟，以加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P 反应阳性。
2实验结果与分析
2.1实验结果
表1 淀粉水解试验
表2 糖发酵试验
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 普通变形杆菌 对照 葡萄糖发酵 有气泡，呈黄色， 无气泡，浅绿
色 有气泡，黄绿色 紫色，无气泡
乳糖发酵 24h 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡
48h 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡
表 3 MR
、VP 试验
2.2照片及分析
图1 淀粉水解试验
现象：在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形菌和空白对照四区域内只有枯草芽孢杆菌区域出现透明圈
分析：枯草芽孢杆菌产生了淀粉酶，将培养基内的淀粉水解遇到碘液不变蓝，出现透明圈，其他菌不产淀粉酶。
图2 葡萄糖发酵试验：顺序为：对照，枯草，大肠，普通变形
现象：葡萄糖发酵中，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形菌的溶液都变黄，为阳性；仅大肠杆菌杜氏小管含气泡。
分析：大肠杆菌能分解葡萄糖，产生甲酸等产物，并有甲酸解氢酶，可将其分解为CO2和H2，故生化反应结果为产酸产气。而另外两种菌代谢产生了酸，但没有气体产生。
图3 MR试验（甲基红试验）顺序为：大肠，枯草，普通变形，对照
现象：甲基红试验中，普通变形菌为红色，说明其产生的酸最多；其他为黄色或者微黄，说明它基本不产酸。
分析：普通变形杆菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸等，使培养基的pH 降低，培养基呈现红色。产气杆菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，，使pH 升至大约6，培养基呈现黄色。
图4 VP试验顺序为：枯草，普通变形，大肠，对照
现象：大肠杆菌黄色（即无变化），普通变形菌稍有红色，枯草芽孢杆菌为红色。 分析：，说明大肠杆菌在葡萄糖蛋白胨水中代谢不产生乙酰基甲醇；普通变形菌产生了少量乙酰基甲醇；枯草芽孢杆菌产生了较多乙酰基甲醇。
2.3实验反思
2.3.1从理论上分析大肠杆菌能够利用乳糖进行发酵，并产酸产气，培养基颜色应该有所变
化，乳糖发酵实验没有明显现象，实验过程或者在培养基的配制上存在问题。
2.3.2实验前需要做好统筹与安排
2.3.3各实验小组之间需要协调合作
参考文献
[1] 沈萍, 陈向东. 微生物学实验. 北京:高等教育出版社,2007：112-119.
[2] 周德庆. 微生物教程. 北京:高等教育出版社,2005
常见细菌种属鉴定
摘要：【目的】了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。分析不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。研究细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。【原理】各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 关键词：微生物；细菌；种属；鉴定
Common bacterial species identification
Abstract: [ Objective ] to understand bacterial physiological and biochemical reaction principle, master the identification of bacteria commonly found in the physiological and biochemical reaction method. Analysis of different bacteria on different carbon, nitrogen containing compounds are decomposed using the situation. Studies on bacteria in different culture medium with different growth phenomenon and its metabolites in bacterial identification and significance of. [ principle ] various bacteria with enzyme system is endless and same, on nutrition matrix decomposition ability is different, so the metabolite differences. By physiological and biochemical test methods for detection of bacteria on a variety of substrate metabolism and its metabolites, thus differentiating bacterial species, known as bacterial physiological and biochemical reaction.
Key words: microbe; bacteria; species identification
前言
在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢的过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes ）。许多细菌产生胞外酶（exoenzymes ），这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。
在这部分实验中，通过细菌对大分子物质的水解、糖发酵实验、鉴定肠道菌的不同生理生化反应等几个试验，来证明不同细菌生理生化功能的多样性。
1 .材料和方法
1.1实验器材
1.1.1菌种
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌；
1.1.2培养基
固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基等；
1.1.3试剂和溶液
甲基红，Lugol’s碘液，40%的KOH ，5%的a-萘酚溶液；
1.1.4仪器或其他用具
无菌培养皿，无菌试管，杜氏小管，记号笔，移液管及无菌枪头，棉塞，皮筋，报纸，培养箱等。
1.2试验方法
1.2.1 培养基的制备
1) 固体淀粉培养基
蛋白胨 10g；NaCl 5g；牛肉膏 5g；可溶性淀粉 2g；蒸馏水 1000ml；琼脂 15-20g；121℃灭菌20min 。
2) 糖发酵培养基
蛋白胨水培养基 1000ml；1.6溴加分紫乙醇溶液 1-2ml；pH 7.6；另配20%葡萄糖溶液、乳糖溶液各10ml 。
制作方法:
①将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH=7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的杜氏小管，使充满培养液。
②将已分装好的蛋白冻水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌20min ；糖溶液112℃灭菌30min 。
③灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5ml （按每10ml 培养基中加入20%的糖溶液0.5ml ，则成1%的浓度）。
配置用的试管必须洗干净，避免结果混乱。
3) 葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨 5g；葡萄糖 5g；K2HPO4 2g；蒸馏水 1000ml。将上述各成分溶于1000ml 水中，调pH7.0-7.2，过滤。分装试管，每管10ml ，112℃灭菌30min 。
1.2.2 淀粉水解试验
1) 将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃，无菌操作制成平板。
2) 用记号笔在平板底步划成四部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称，剩余部分为空白对照。
3) 37 ℃倒置培养24-48小时
4) 观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板
5) 观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以初步判断菌体解淀粉的活性。
1.2.3 糖发酵试验
1) 用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别标明培养基名称和所接种的细菌菌名。
2) 取葡萄糖发酵培养基试管4支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、普通变形杆菌，对照
不接种。另取乳糖发酵培养基试管4支，操作同上。
3) 接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡。
4) 将接过种的和作为对照的8支管均置于37℃培养24~48小时。
5) 观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。
1.2.4 MR、VP 试验
1) 配制蛋白胨水培养基，分别接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌各两支，另制两支作为对照。
2) 培养48小时后，将一组葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色者为阴性。
3) 取另外一组培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加入5~10滴40%的KOH ，然后加入等量的5%的a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37°温箱中保温15~30分钟，以加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P 反应阳性。
2实验结果与分析
2.1实验结果
表1 淀粉水解试验
表2 糖发酵试验
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 普通变形杆菌 对照 葡萄糖发酵 有气泡，呈黄色， 无气泡，浅绿
色 有气泡，黄绿色 紫色，无气泡
乳糖发酵 24h 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡
48h 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡 紫色，无气泡
表 3 MR
、VP 试验
2.2照片及分析
图1 淀粉水解试验
现象：在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形菌和空白对照四区域内只有枯草芽孢杆菌区域出现透明圈
分析：枯草芽孢杆菌产生了淀粉酶，将培养基内的淀粉水解遇到碘液不变蓝，出现透明圈，其他菌不产淀粉酶。
图2 葡萄糖发酵试验：顺序为：对照，枯草，大肠，普通变形
现象：葡萄糖发酵中，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形菌的溶液都变黄，为阳性；仅大肠杆菌杜氏小管含气泡。
分析：大肠杆菌能分解葡萄糖，产生甲酸等产物，并有甲酸解氢酶，可将其分解为CO2和H2，故生化反应结果为产酸产气。而另外两种菌代谢产生了酸，但没有气体产生。
图3 MR试验（甲基红试验）顺序为：大肠，枯草，普通变形，对照
现象：甲基红试验中，普通变形菌为红色，说明其产生的酸最多；其他为黄色或者微黄，说明它基本不产酸。
分析：普通变形杆菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸等，使培养基的pH 降低，培养基呈现红色。产气杆菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，，使pH 升至大约6，培养基呈现黄色。
图4 VP试验顺序为：枯草，普通变形，大肠，对照
现象：大肠杆菌黄色（即无变化），普通变形菌稍有红色，枯草芽孢杆菌为红色。 分析：，说明大肠杆菌在葡萄糖蛋白胨水中代谢不产生乙酰基甲醇；普通变形菌产生了少量乙酰基甲醇；枯草芽孢杆菌产生了较多乙酰基甲醇。
2.3实验反思
2.3.1从理论上分析大肠杆菌能够利用乳糖进行发酵，并产酸产气，培养基颜色应该有所变
化，乳糖发酵实验没有明显现象，实验过程或者在培养基的配制上存在问题。
2.3.2实验前需要做好统筹与安排
2.3.3各实验小组之间需要协调合作
参考文献
[1] 沈萍, 陈向东. 微生物学实验. 北京:高等教育出版社,2007：112-119.
[2] 周德庆. 微生物教程. 北京:高等教育出版社,2005