・综述与专论・
DNA分子遗传标记技术及其在生药学中的应用
杨柳 程波 曾凡波 (华中科技大学同济医学院药学院 武汉430030)
关键词 DNA分子遗传标记技术 RFLP PCR RAPD AFLP
中图分类号:R93 文献标识码:A 文章编号:10082049X(2004)0720559203 DNA分子遗传标记(DNAmoleculargeneticmarkers)本
质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。这种DNA片段是由基因组DNA经限制性内切酶切割或PCR扩增、分子杂交后在电泳胶上或杂交膜上
[1]
检测到的。物种的生物多样性(biodiversity)就是由于其基因组中DNA遗传多态性的结果,检测这种多态性的方法就是DNA分子遗传标记技术。而利用比较物种间DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是遗传标记鉴别。生药学是应用各种相关学科理论知识和现代科学技术来研究生药(药材)的名称、来源、生产、采制、鉴定、化学成分、品质评价、细胞组织培养、医疗用途及资源开发与利用等方面的科学。生药品种繁多,同一种生药由于物种及产地等的不同,其质量差异较大。为了保证生药品种的真实性,疗效和用药安全,必须进行生药的基源鉴定。目前生药学研究中,主要是应用形态学、组织学、化学等物种特异的遗传标记特征,这些特征特别是以形态学为基础的鉴别方法虽然简便、易行,但由于特征的稳定性欠佳和有局限性,使其应用受到了限制。自从1974年Grodzicker等[2]创立了限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术及Bostein和White等于1980年利用RFLP作为遗传标记,开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。由于DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强、准确可靠且不受生育阶段、供试部位、环境条件、贮藏等因素的影响,使其应用前景更加广阔。现根据有关文献将
DNA分子遗传标记技术的特点,方法和原理作一综述。1 DNA分子遗传标记技术的特点[4]1.1 遗传稳定性
DNA分子作为遗传信息的直接载体,不受外界因素和
[3]
入、易位、倒位、重排或存在长短与排列不一的重复序列等机
制而产生的多态性,以电泳图谱的形式表现[5]。根据其原理的不同分为3类。
2.1 以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术2.1.1 限制性内切酶酶切片段长度多态性 RFLP是最早
发展的分子标记技术。其基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下,在特定的核苷酸顺序上切割,产生相当多的大小不等的限制性片段,导致其在凝胶上运动速率不同,用放射性同位素标记的单拷贝或低拷贝的DNA探针检测与被标记DNA相关的片段,构建多态性图谱。2.1.2 DNA指纹技术 DNA指纹是以重复序列(包括串联重复序列:如卫星DNA,小卫星DNA及微卫星DNA和散布序列:如转座子和逆转座子)为探针进行杂交,检测多态性的一种技术[6]。其原理类似RFLP,是RFLP分析的一种特殊类型,只是两者分析使用的探针不同。2.2 以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术
2.2.1 聚合酶链式反应(PCR) PCR是一种模拟体内
DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又
称无细胞分子克隆技术。它以待扩增的两条DNA链为摸板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增。
2.2.2 AP2PCR标记 AP2PCR标记是由Welsh和McClel2land(1990)提出的[7]。它是以任意的寡核苷酸作为引物,对
基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物表现高度的变异性,所扩增的序列是未知的,扩增的每个部分要求的条件与组分浓度不同。
2.2.3 随机扩增多态性DNA(RAPD) RAPD是由Williams等(1990)提出的建立在PCR技术基础上的遗传标
生物体发育阶段及器官组织差异的影响,每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此,用DNA分子特征作为遗传标记进行物种鉴别更为准确可靠。
1.2 遗传多样性
DNA分子是由G,A,C,T四种碱基构成,生物体特定的
记技术[8]。其基本原理是采用随机合成的较短的单个随机
引物(10核苷酸),利用药材总DNA为摸板,在DNA聚合酶作用下,进行非特异性的PCR扩增反应。由于引物结合的生物总DNA序列上发生了单个碱基点突变、缺失、重复、易位、插入,从而改变了扩增片段的大小或无法扩增。扩增产物通过琼脂糖电泳并经溴化乙锭染色,即可在紫外光下检测
DNA多态性片段[6]。
2.2.4 简单重复顺序标记(SSR) SSR又称微卫星标记。
遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中,不同物种遗传上的差异表现在这四种碱基排列顺序的变化,这就是生物的遗
传多样性。1.3 化学稳定性
DNA分子作为遗传信息的载体,比蛋白质、同工酶等具有较高的化学稳定性。在生物体死亡后,标本中所保存下来的DNA仍能够用于DNA分子遗传标记的研究。2 DNA分子遗传标记技术的方法及原理
DNA分子标记技术是基于研究DNA分子由于缺失、插
它是由2～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸
(AC)n、(GAA)n等。微卫星中重复的重复序列,如(GA)n、
单位的数目是高度变异的,具有长度多态性,易于用PCR方法检测[9]。
2.2.5 PCR扩增的特定片段的限制性位点分析(AFLP) AFLP是由Zabeau和Vos(1993)发展的[10]。AFLP是新一
代分子标记技术,是RFLP和RAPD的结合和发展,它继承了RFLP的可靠性和RAPD的方便敏捷,只需极少量的
DNA材料,不需要Southern杂交,不需要预知DNA的顺序信息,实验结果稳定可靠。其基本原理是基因组DNA先用限制性内切酶酶切后的限制性片段两端在T4连接酶作用下与特定的接头连接,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点,进行
PCR扩增。由于引物的合成具有特异性,从而使扩增产物
因组rpoC2(引物间距约4.1kb)片段扩增后,用23个限制性内切酶解进行了DNA分析,结果发现37个突变点和一个10bp的长度变异,并据此对黄芪属植物进行了分类鉴定[4]。3.3 在中药材鉴别中的应用传统的中药材鉴别一般根据药材形态、组织、粉末特征、理化性质等进行鉴别,分子标记则直接根据药材的遗传本质2DNA的多态性,找出药材特有的DNA片段(标记)进行鉴别,提高了鉴别的准确性[6]。Shaw等首次用RAPD方法对人参、西洋参、三七及伪品的DNA进行PCR扩增,能有效鉴别三种药材[15]。在动物药材中,特别是以部分组织器官入药和切成块的药材,由于外部形态特征被破坏,细胞组织学特征不明显,理化成分复杂而重现性差,给生药鉴定带来困难,用RAPD技术对蛇类药材的鉴别研究结果表明,该方法可以准确地区别乌梢蛇及其混淆品和金钱白花蛇及其伪品[4]。
3.4 在道地药材研究中的应用
也具有特异性。PCR产物变性后,含尿素的聚丙烯酰胺变
性胶上电泳,分离扩增的DNA片段,经放射自显影(X线片感光)或银染或荧光技术,得到被扩增的DNA片段谱带,通过比较,即可找出不同样品DNA谱带的差异[11]。
2.2.6 DAF技术 它用内切酶消化摸板DNA,使引物浓度
更高长度更短,在两个温度循环时,常用聚丙烯酰凝胶电泳分离后银染,故带型较为复杂[12]。2.3 以DNA序列为核心的分子标记技术
动植物在进化过程中,其基因会发生碱基的重排、替代等,从而导致基因序列的差异。通过检测其DNA片段序列的差异,即可将不同的特种区别开来。利用已知基因的结构、序列,可以为PCR引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件[6]。而基于PCR的DNA直接测序技术,以PCR扩增引物作为测序引物,使DNA分子鉴定技术取得了突破性进展。目前用于DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcL,matKrpoC等;植物核基因组的rRNA、ITS等;动物线粒体基因组Cyt2b基因等[13]。
3 DNA分子遗传标记技术在生药学研究中的应用3.1 在植物进化与亲缘关系研究中的应用
同一物种在不同地区,不同生态条件下,质量差异很大。
道地药材是我国传统药物学的一大特色,是长期的临床实践中,经临床总结的评价药材质量的综合标准。特指那些来源于特定产区的名优正品药材。众所周知,有些道地药材是一些独特的种群,更多的道地药材其原植物是一个种,种内多样性是道地药材品质形成的生物学基础。药材道地性的研究主要包括两方面:一是研究形成药材道地性的重要原因;二是如何鉴别药材市场上的道地性药材。应用DNA遗传标记技术,揭示道地药材中存在的遗传变异规律,将有助于阐明道地药材的成因。同时,针对生物体内DNA分子的不同区段其遗传的保守性和变异性不同选择适当的方法,利用DNA分子遗传标记技术,研究DNA分子中保守较低的区段,便可达到准确区分出道地药材与非道地药材的目的。陈永久等对来自青藏高原3个区域5个具有代表性地方的13个冬虫夏草(Cordycepssinensis)样本进行RAPD分析。结果表明来自同一地方的样本间遗传差异甚微,同一区域不同地方的样本间遗传差异较大。这说明冬虫夏草地理群体间存在着遗传分化,可作为有效的遗传标记,用于研究虫草的遗传与多样性,进而用于道地药材的鉴别[4]。
参 考 文 献
1 傅荣昭,邵鹏柱,高文远,等.DNA分子标记技术及其在药用植物研究上的
主要依据形态学特征建立的植物系统学具有一定的局
限性,通过应用RAPD、RFLP、AFLP标记及基因测序技术等分子遗传标记技术来研究种间、属间的DNA变异情况,从而揭示物种的自然居群,品种中遗传结构的基因流动与演变等系统发育与亲缘关系的真实本质,为物种开发利用提供真实的生物学依据。利用分子标记技术研究品种间亲缘关系,可以为选择合适亲本提供依据。如Bemado等用DNA标记检测亲本的多态性,预测其杂种优势,获得了可信的结果[14]。山崎等报告采用RAPD分子标记方法比较了4种甘草属植物光果甘草(Glycyrrhizaglabra)、甘草(G.uralensis)、刺甘草(G.echinata)和刺果甘草(G.pallidiflora)的遗传关系,通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析,结果发现富含甘草甜素(glycyrrhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近,这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远,与植物分类学研究相吻合[4]。Wen和Zimmer对人参属12种植物的ITS区和5.8SrRNA基因区进行了序列分析,结果表明美洲东北部的2个种西洋参与三叶人参中,西洋参与东亚人参、竹节参、三七具有更近的亲缘关系
[4]
应用前景[J].生物工程进展,1998,18(4):14217
2 Grpdzicker,T,ColdSpringHarbourSympQuantBid,1974,39:4933 BosteinDR,WhiteRL,SkolnickM,etal.ConstructionofaGeneticlinkage
MapinMapUsingRestrictionFragmentLengthPpngthPpolymorphism[J].
AmJHumGenet1980,32;3142331
4 郑俊华.DNA分子遗传标记技术在生药学研究中的应用[J].生药学,
2003,3(3):75279
5 杨文鹏.DNA分子标记及其在遗传育种上的应用[J].种子,1997,(2):306 李隆云,钟国跃,卫莹芳,等.DNA分子标记及其在中药中的应用[J].中国
。
中医药科技,2002,9(5):3152320
7 WelshJ,McClellandM.FingerprintingGenomesUsingPCRwithArbitrary
Primers[J].NucleicAcidsResearch,1990,18(24):7213
8 WilliamsJGK,KubelikAR,LivskKL,etal.DNAPolymorphismsAmplified
byArbitraryPrimersareUswfulaasGeneticMarkers[J].NuleicAcidsRe2search,1990,18(22):6531
9 李汝玉,杨平平,宋国安,等.SSR及其在品种鉴定及种子检测中的应用
[J].种子,1999,(5):33
3.2 在植物分类、鉴定中的应用
随着中药资源及分类鉴定研究的不断深入,新种不断发现,新种的确立常有异议,同一物种分类地位经常变动,给正本清源及一系列的研究带来困难。应用DNA分子遗传标记技术将为物种鉴定及系统学研究提供依据。Liston利用PCR2RFLP方法对黄芪属(Astragalus)14个近缘种叶绿体基
10ZabeauMandVosP,1993,Europeanpatentapplicationpublicationnumber,
EP0534858
11吴敏生,戴景瑞.扩增片段长度多态性(AFLP)—一种新的分子标记技术
[J].植物学通报,1998,15(4):69
12黎裕,贾继增,王天宇.分子标记的种类及其发展[J].生物技术通报,1999,
(4):19
13曹晖,邵鹏柱,毕培曦,等.DNA分子指纹图谱与测序技术在中药品质研究
中的现状及展望[J].中国中药杂志,1998,23(11):643
14张德水,陈受宜.DNA分子标记、基因组作图及其在植物遗传育种上的应
用[J].生物技术通报,1998,(5):15
15ShawPC,ButPPH.AuthentictionofPanaxSpeciesandtheiradultrantsby
random2primedpolymeraseChaingreaction[J].PlantaMed,1995.612466
(2003212209收稿 2003203223修回)
更年期综合征药物的选择与评价
祝红达 黄琳琳 汤春芳 (湖北省荆州市中心医院 湖北荆州434100)
关键词 更年期综合征 药物选择 评价
中图分类号:R984 文献标识码:A 文章编号:10082049X(2004)0720561202 妇女绝经前后由于卵巢功能衰退,雌激素水平下降所致的各器官系统症状的综合症侯群如潮热、出汗、骨质疏松症、萎缩性泌尿生殖道炎、心血管系统症状、骨折等,称为更年期综合征。在我国随着人口平均寿命的提高,更年期妇女也不断增多,如何指导更年期妇女顺利渡过更年期,减少更年期症状,提高老年人生活质量日益受到重视。目前最常用的治疗方法有性激素补充疗法(HRT);针对更年期症状进行药物治疗如调节植物神经功能、钙剂、镇静剂等;采用副作用小的中药及其制剂缓解更年期症状等。本文着重介绍治疗更年期综合征药物的分类和比较。1 性激素补充疗法(HRT)药物经临床观察HRT是缓解更年期症状最直接最有效的方法,使用后确实提高了更年期妇女的生活质量。但随着使用人数的增加、加之国外大样本系统的深入研究,其弊端也显现出来。如长期使用发生子宫内膜癌、乳腺癌的相对危险性增加等。2002年7月美国妇女健康引导项目(WHI)的部分研究成果2雌孕激素对绝经后健康妇女的利弊[1],对长期应用的否定性结果引起了HRT利弊的讨论。相关文献[2,3]通过对国内外最新有关HRT文献的系统性分析,肯定了WHI研究结果的可靠性和临床意义,也指出了其研究尚未涉及的问题或局限性。国内外绝大多数专业组织认可HRT用于治疗绝经期症状和体征以提高患者生命质量,并提出了围绝经妇女合理应用HRT的建议。临床使用HRT药物时应掌握好HRT的适应证及禁忌证,个体化给药(依据不同个体选择最小有效剂量和给药途径),权衡和考虑治疗的益处、风险和可供选择的其它措施,掌握应用HRT的时机,定期监测与随访,尽量减少其不良反应。
1.1 HRT的口服制剂
1.1.1 雌激素 天然雌激素由于对肝脏代谢影响少,且具
用雌激素应注意监测子宫内膜。单用雌激素引起子宫内膜
增生、癌变和不规则出血的危险性较大,加用孕激素能有效降低上述危险性提高治疗依从性。1.1.2 孕激素 目前最常用的孕激素为甲羟孕酮、炔诺酮、左炔诺孕酮、醋炔诺酮等。首选有天然孕酮及安宫黄体酮。可用于围绝经及绝经过渡期黄体酮不足时的周期性补充,但多数与雌激素联合或序贯使用。
1.1.3 雌2孕激素的复方制剂 小剂量雌2孕激素联合给
药,使体内维持一定浓度的雌、孕激素水平既可以解除症状,也能防止子宫内膜增生和减少阴道出血等不良症状,这种方法依从性高,是HRT的趋势。目前有倍美安、倍美盈、诺更宁、诺康律,可分别用于连续联合及序贯方案。WHI已公布的研究结果显示:健康绝经妇女长期(5.2a)服用雌2孕激素的总体风险大于益处,如出现乳腺癌等风险大于预防骨折等益处[1]。但多数专家认为WHI的试验药物只是某一种剂量和比例的雌2孕激素,不能简单推论小剂量或其它组方同类药物的作用及风险[3]。国内外已有不少研究显示:采用低剂量性激素(仅为药物说明书推荐剂量的50%)既能维持身体器官功能,又能避免或减轻可能产生的副作用,这与WHI研究给我们的启示一致[4]。雌激素与孕激素的使用比例一直没有定论。目前国内外使用的雌激素与孕激素的比例多为1∶4,但在HRT中,目前国际上普遍存在孕激素使用比例过高的问题。应进一步探索雌孕激素联合疗法的合适用药比例。1.1.4 同时具有雌激素、孕激素和雄激素样作用的药物 目前有替勃龙(利维爱),用量为2.5mg・d-1。替勃龙通过组织特异性代谢产生具有雌激素,孕激素,雄激素样作用的代谢产物,其在有效治疗更年期综合征症状的同时,降低部分HRT药物的不良反应如:阴道出血率低,乳房胀痛较少,对乳房影响小,被认定为当今较理想的绝经后HRT药物[5]。1.1.5 选择性雌激素受体调节剂(SERM) 有他莫昔芬、雷洛昔芬,后者是一种既保留雌激素对骨、心血管的保护,又在子宫内膜和乳腺处抗雌激素,不增加致癌危险,成为预防绝经后有关疾病的新HRT药物。1.1.6 植物雌激素(PE) PE为一系列来自植物的复合物,存在于大部分植物、水果和蔬菜中,PE的结构和甾体类
有抗氧化作用,在欧美,几乎所有的制剂均选用天然雌激素,如雌二醇、雌三醇、孕马雌酮及戊酸雌二醇等。首选有孕马
雌酮(倍美力)、戊酸雌二醇(补佳乐)等。倍美力0.625mg・d-1、补佳乐1mg・d-1均为HRT的生理补充量,且吸收迅速。适用于已切除子宫不需保护子宫内膜的妇女。人工合成类有尼尔雌醇(维尼安),是我国20世纪80年代研究的一种雌三醇类缓释剂,服用剂量为每月5mg或2mg,其主要作用于阴道上皮,对子宫粘膜影响相对较小。有子宫妇女单
・综述与专论・
DNA分子遗传标记技术及其在生药学中的应用
杨柳 程波 曾凡波 (华中科技大学同济医学院药学院 武汉430030)
关键词 DNA分子遗传标记技术 RFLP PCR RAPD AFLP
中图分类号:R93 文献标识码:A 文章编号:10082049X(2004)0720559203 DNA分子遗传标记(DNAmoleculargeneticmarkers)本
质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。这种DNA片段是由基因组DNA经限制性内切酶切割或PCR扩增、分子杂交后在电泳胶上或杂交膜上
[1]
检测到的。物种的生物多样性(biodiversity)就是由于其基因组中DNA遗传多态性的结果,检测这种多态性的方法就是DNA分子遗传标记技术。而利用比较物种间DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别物种就是遗传标记鉴别。生药学是应用各种相关学科理论知识和现代科学技术来研究生药(药材)的名称、来源、生产、采制、鉴定、化学成分、品质评价、细胞组织培养、医疗用途及资源开发与利用等方面的科学。生药品种繁多,同一种生药由于物种及产地等的不同,其质量差异较大。为了保证生药品种的真实性,疗效和用药安全,必须进行生药的基源鉴定。目前生药学研究中,主要是应用形态学、组织学、化学等物种特异的遗传标记特征,这些特征特别是以形态学为基础的鉴别方法虽然简便、易行,但由于特征的稳定性欠佳和有局限性,使其应用受到了限制。自从1974年Grodzicker等[2]创立了限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术及Bostein和White等于1980年利用RFLP作为遗传标记,开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。由于DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强、准确可靠且不受生育阶段、供试部位、环境条件、贮藏等因素的影响,使其应用前景更加广阔。现根据有关文献将
DNA分子遗传标记技术的特点,方法和原理作一综述。1 DNA分子遗传标记技术的特点[4]1.1 遗传稳定性
DNA分子作为遗传信息的直接载体,不受外界因素和
[3]
入、易位、倒位、重排或存在长短与排列不一的重复序列等机
制而产生的多态性,以电泳图谱的形式表现[5]。根据其原理的不同分为3类。
2.1 以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术2.1.1 限制性内切酶酶切片段长度多态性 RFLP是最早
发展的分子标记技术。其基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下,在特定的核苷酸顺序上切割,产生相当多的大小不等的限制性片段,导致其在凝胶上运动速率不同,用放射性同位素标记的单拷贝或低拷贝的DNA探针检测与被标记DNA相关的片段,构建多态性图谱。2.1.2 DNA指纹技术 DNA指纹是以重复序列(包括串联重复序列:如卫星DNA,小卫星DNA及微卫星DNA和散布序列:如转座子和逆转座子)为探针进行杂交,检测多态性的一种技术[6]。其原理类似RFLP,是RFLP分析的一种特殊类型,只是两者分析使用的探针不同。2.2 以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术
2.2.1 聚合酶链式反应(PCR) PCR是一种模拟体内
DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又
称无细胞分子克隆技术。它以待扩增的两条DNA链为摸板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增。
2.2.2 AP2PCR标记 AP2PCR标记是由Welsh和McClel2land(1990)提出的[7]。它是以任意的寡核苷酸作为引物,对
基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物表现高度的变异性,所扩增的序列是未知的,扩增的每个部分要求的条件与组分浓度不同。
2.2.3 随机扩增多态性DNA(RAPD) RAPD是由Williams等(1990)提出的建立在PCR技术基础上的遗传标
生物体发育阶段及器官组织差异的影响,每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此,用DNA分子特征作为遗传标记进行物种鉴别更为准确可靠。
1.2 遗传多样性
DNA分子是由G,A,C,T四种碱基构成,生物体特定的
记技术[8]。其基本原理是采用随机合成的较短的单个随机
引物(10核苷酸),利用药材总DNA为摸板,在DNA聚合酶作用下,进行非特异性的PCR扩增反应。由于引物结合的生物总DNA序列上发生了单个碱基点突变、缺失、重复、易位、插入,从而改变了扩增片段的大小或无法扩增。扩增产物通过琼脂糖电泳并经溴化乙锭染色,即可在紫外光下检测
DNA多态性片段[6]。
2.2.4 简单重复顺序标记(SSR) SSR又称微卫星标记。
遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中,不同物种遗传上的差异表现在这四种碱基排列顺序的变化,这就是生物的遗
传多样性。1.3 化学稳定性
DNA分子作为遗传信息的载体,比蛋白质、同工酶等具有较高的化学稳定性。在生物体死亡后,标本中所保存下来的DNA仍能够用于DNA分子遗传标记的研究。2 DNA分子遗传标记技术的方法及原理
DNA分子标记技术是基于研究DNA分子由于缺失、插
它是由2～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸
(AC)n、(GAA)n等。微卫星中重复的重复序列,如(GA)n、
单位的数目是高度变异的,具有长度多态性,易于用PCR方法检测[9]。
2.2.5 PCR扩增的特定片段的限制性位点分析(AFLP) AFLP是由Zabeau和Vos(1993)发展的[10]。AFLP是新一
代分子标记技术,是RFLP和RAPD的结合和发展,它继承了RFLP的可靠性和RAPD的方便敏捷,只需极少量的
DNA材料,不需要Southern杂交,不需要预知DNA的顺序信息,实验结果稳定可靠。其基本原理是基因组DNA先用限制性内切酶酶切后的限制性片段两端在T4连接酶作用下与特定的接头连接,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点,进行
PCR扩增。由于引物的合成具有特异性,从而使扩增产物
因组rpoC2(引物间距约4.1kb)片段扩增后,用23个限制性内切酶解进行了DNA分析,结果发现37个突变点和一个10bp的长度变异,并据此对黄芪属植物进行了分类鉴定[4]。3.3 在中药材鉴别中的应用传统的中药材鉴别一般根据药材形态、组织、粉末特征、理化性质等进行鉴别,分子标记则直接根据药材的遗传本质2DNA的多态性,找出药材特有的DNA片段(标记)进行鉴别,提高了鉴别的准确性[6]。Shaw等首次用RAPD方法对人参、西洋参、三七及伪品的DNA进行PCR扩增,能有效鉴别三种药材[15]。在动物药材中,特别是以部分组织器官入药和切成块的药材,由于外部形态特征被破坏,细胞组织学特征不明显,理化成分复杂而重现性差,给生药鉴定带来困难,用RAPD技术对蛇类药材的鉴别研究结果表明,该方法可以准确地区别乌梢蛇及其混淆品和金钱白花蛇及其伪品[4]。
3.4 在道地药材研究中的应用
也具有特异性。PCR产物变性后,含尿素的聚丙烯酰胺变
性胶上电泳,分离扩增的DNA片段,经放射自显影(X线片感光)或银染或荧光技术,得到被扩增的DNA片段谱带,通过比较,即可找出不同样品DNA谱带的差异[11]。
2.2.6 DAF技术 它用内切酶消化摸板DNA,使引物浓度
更高长度更短,在两个温度循环时,常用聚丙烯酰凝胶电泳分离后银染,故带型较为复杂[12]。2.3 以DNA序列为核心的分子标记技术
动植物在进化过程中,其基因会发生碱基的重排、替代等,从而导致基因序列的差异。通过检测其DNA片段序列的差异,即可将不同的特种区别开来。利用已知基因的结构、序列,可以为PCR引物的设计及目的基因的扩增提供前提条件[6]。而基于PCR的DNA直接测序技术,以PCR扩增引物作为测序引物,使DNA分子鉴定技术取得了突破性进展。目前用于DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcL,matKrpoC等;植物核基因组的rRNA、ITS等;动物线粒体基因组Cyt2b基因等[13]。
3 DNA分子遗传标记技术在生药学研究中的应用3.1 在植物进化与亲缘关系研究中的应用
同一物种在不同地区,不同生态条件下,质量差异很大。
道地药材是我国传统药物学的一大特色,是长期的临床实践中,经临床总结的评价药材质量的综合标准。特指那些来源于特定产区的名优正品药材。众所周知,有些道地药材是一些独特的种群,更多的道地药材其原植物是一个种,种内多样性是道地药材品质形成的生物学基础。药材道地性的研究主要包括两方面:一是研究形成药材道地性的重要原因;二是如何鉴别药材市场上的道地性药材。应用DNA遗传标记技术,揭示道地药材中存在的遗传变异规律,将有助于阐明道地药材的成因。同时,针对生物体内DNA分子的不同区段其遗传的保守性和变异性不同选择适当的方法,利用DNA分子遗传标记技术,研究DNA分子中保守较低的区段,便可达到准确区分出道地药材与非道地药材的目的。陈永久等对来自青藏高原3个区域5个具有代表性地方的13个冬虫夏草(Cordycepssinensis)样本进行RAPD分析。结果表明来自同一地方的样本间遗传差异甚微,同一区域不同地方的样本间遗传差异较大。这说明冬虫夏草地理群体间存在着遗传分化,可作为有效的遗传标记,用于研究虫草的遗传与多样性,进而用于道地药材的鉴别[4]。
参 考 文 献
1 傅荣昭,邵鹏柱,高文远,等.DNA分子标记技术及其在药用植物研究上的
主要依据形态学特征建立的植物系统学具有一定的局
限性,通过应用RAPD、RFLP、AFLP标记及基因测序技术等分子遗传标记技术来研究种间、属间的DNA变异情况,从而揭示物种的自然居群,品种中遗传结构的基因流动与演变等系统发育与亲缘关系的真实本质,为物种开发利用提供真实的生物学依据。利用分子标记技术研究品种间亲缘关系,可以为选择合适亲本提供依据。如Bemado等用DNA标记检测亲本的多态性,预测其杂种优势,获得了可信的结果[14]。山崎等报告采用RAPD分子标记方法比较了4种甘草属植物光果甘草(Glycyrrhizaglabra)、甘草(G.uralensis)、刺甘草(G.echinata)和刺果甘草(G.pallidiflora)的遗传关系,通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析,结果发现富含甘草甜素(glycyrrhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近,这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远,与植物分类学研究相吻合[4]。Wen和Zimmer对人参属12种植物的ITS区和5.8SrRNA基因区进行了序列分析,结果表明美洲东北部的2个种西洋参与三叶人参中,西洋参与东亚人参、竹节参、三七具有更近的亲缘关系
[4]
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3.2 在植物分类、鉴定中的应用
随着中药资源及分类鉴定研究的不断深入,新种不断发现,新种的确立常有异议,同一物种分类地位经常变动,给正本清源及一系列的研究带来困难。应用DNA分子遗传标记技术将为物种鉴定及系统学研究提供依据。Liston利用PCR2RFLP方法对黄芪属(Astragalus)14个近缘种叶绿体基
10ZabeauMandVosP,1993,Europeanpatentapplicationpublicationnumber,
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12黎裕,贾继增,王天宇.分子标记的种类及其发展[J].生物技术通报,1999,
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14张德水,陈受宜.DNA分子标记、基因组作图及其在植物遗传育种上的应
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15ShawPC,ButPPH.AuthentictionofPanaxSpeciesandtheiradultrantsby
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(2003212209收稿 2003203223修回)
更年期综合征药物的选择与评价
祝红达 黄琳琳 汤春芳 (湖北省荆州市中心医院 湖北荆州434100)
关键词 更年期综合征 药物选择 评价
中图分类号:R984 文献标识码:A 文章编号:10082049X(2004)0720561202 妇女绝经前后由于卵巢功能衰退,雌激素水平下降所致的各器官系统症状的综合症侯群如潮热、出汗、骨质疏松症、萎缩性泌尿生殖道炎、心血管系统症状、骨折等,称为更年期综合征。在我国随着人口平均寿命的提高,更年期妇女也不断增多,如何指导更年期妇女顺利渡过更年期,减少更年期症状,提高老年人生活质量日益受到重视。目前最常用的治疗方法有性激素补充疗法(HRT);针对更年期症状进行药物治疗如调节植物神经功能、钙剂、镇静剂等;采用副作用小的中药及其制剂缓解更年期症状等。本文着重介绍治疗更年期综合征药物的分类和比较。1 性激素补充疗法(HRT)药物经临床观察HRT是缓解更年期症状最直接最有效的方法,使用后确实提高了更年期妇女的生活质量。但随着使用人数的增加、加之国外大样本系统的深入研究,其弊端也显现出来。如长期使用发生子宫内膜癌、乳腺癌的相对危险性增加等。2002年7月美国妇女健康引导项目(WHI)的部分研究成果2雌孕激素对绝经后健康妇女的利弊[1],对长期应用的否定性结果引起了HRT利弊的讨论。相关文献[2,3]通过对国内外最新有关HRT文献的系统性分析,肯定了WHI研究结果的可靠性和临床意义,也指出了其研究尚未涉及的问题或局限性。国内外绝大多数专业组织认可HRT用于治疗绝经期症状和体征以提高患者生命质量,并提出了围绝经妇女合理应用HRT的建议。临床使用HRT药物时应掌握好HRT的适应证及禁忌证,个体化给药(依据不同个体选择最小有效剂量和给药途径),权衡和考虑治疗的益处、风险和可供选择的其它措施,掌握应用HRT的时机,定期监测与随访,尽量减少其不良反应。
1.1 HRT的口服制剂
1.1.1 雌激素 天然雌激素由于对肝脏代谢影响少,且具
用雌激素应注意监测子宫内膜。单用雌激素引起子宫内膜
增生、癌变和不规则出血的危险性较大,加用孕激素能有效降低上述危险性提高治疗依从性。1.1.2 孕激素 目前最常用的孕激素为甲羟孕酮、炔诺酮、左炔诺孕酮、醋炔诺酮等。首选有天然孕酮及安宫黄体酮。可用于围绝经及绝经过渡期黄体酮不足时的周期性补充,但多数与雌激素联合或序贯使用。
1.1.3 雌2孕激素的复方制剂 小剂量雌2孕激素联合给
药,使体内维持一定浓度的雌、孕激素水平既可以解除症状,也能防止子宫内膜增生和减少阴道出血等不良症状,这种方法依从性高,是HRT的趋势。目前有倍美安、倍美盈、诺更宁、诺康律,可分别用于连续联合及序贯方案。WHI已公布的研究结果显示:健康绝经妇女长期(5.2a)服用雌2孕激素的总体风险大于益处,如出现乳腺癌等风险大于预防骨折等益处[1]。但多数专家认为WHI的试验药物只是某一种剂量和比例的雌2孕激素,不能简单推论小剂量或其它组方同类药物的作用及风险[3]。国内外已有不少研究显示:采用低剂量性激素(仅为药物说明书推荐剂量的50%)既能维持身体器官功能,又能避免或减轻可能产生的副作用,这与WHI研究给我们的启示一致[4]。雌激素与孕激素的使用比例一直没有定论。目前国内外使用的雌激素与孕激素的比例多为1∶4,但在HRT中,目前国际上普遍存在孕激素使用比例过高的问题。应进一步探索雌孕激素联合疗法的合适用药比例。1.1.4 同时具有雌激素、孕激素和雄激素样作用的药物 目前有替勃龙(利维爱),用量为2.5mg・d-1。替勃龙通过组织特异性代谢产生具有雌激素,孕激素,雄激素样作用的代谢产物,其在有效治疗更年期综合征症状的同时,降低部分HRT药物的不良反应如:阴道出血率低,乳房胀痛较少,对乳房影响小,被认定为当今较理想的绝经后HRT药物[5]。1.1.5 选择性雌激素受体调节剂(SERM) 有他莫昔芬、雷洛昔芬,后者是一种既保留雌激素对骨、心血管的保护,又在子宫内膜和乳腺处抗雌激素,不增加致癌危险,成为预防绝经后有关疾病的新HRT药物。1.1.6 植物雌激素(PE) PE为一系列来自植物的复合物,存在于大部分植物、水果和蔬菜中,PE的结构和甾体类
有抗氧化作用,在欧美,几乎所有的制剂均选用天然雌激素,如雌二醇、雌三醇、孕马雌酮及戊酸雌二醇等。首选有孕马
雌酮(倍美力)、戊酸雌二醇(补佳乐)等。倍美力0.625mg・d-1、补佳乐1mg・d-1均为HRT的生理补充量,且吸收迅速。适用于已切除子宫不需保护子宫内膜的妇女。人工合成类有尼尔雌醇(维尼安),是我国20世纪80年代研究的一种雌三醇类缓释剂,服用剂量为每月5mg或2mg,其主要作用于阴道上皮,对子宫粘膜影响相对较小。有子宫妇女单