实验方案 镧铈对铜胁迫下豌豆种子萌发和生长的影响
1.La(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发影响的显效剂量筛选
(1)浓度梯度设计:
LaCl3/ CeCl 3溶液配置:先配置1g•L-1的LaCl3/ CeCl 3溶液母液,然后将母液分别稀释
成浓度为5、10、20、40,60 mg•L-1梯度浓度,调节PH(HCL/NAOH)至6.5,对照(CK)
为PH调节至6.5的去离子水。
重金属Cuso4浓度的设置: 10、25、50、100、200、400 mg•L-1,对照用蒸馏水。
(2)试材培养
种子预处理:选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min,分别用自来水和
去离子水洗净,常温下晾干备用。
(3)实验设置:CK,La,Ce,Cu(共4组18个浓度57个样品)
(4)试材处理:
选取LaCl3、 CeCl3和 CuSO4各个梯度溶液溶液,豌豆种子经预处理后用各个梯度溶液
浸没处理,对照用蒸馏水,置于25±1℃浸种24h后,将处理后种子均匀排列在直径9cm、
垫有2层滤纸的培养皿中,每处理加入一定量水培养(以没过种子2/3为标准),每处理3
皿重复,每皿20粒。
指标测定方法:
种子发芽第三天测α—淀粉酶,第四天测发芽势,前三天测发芽指数和发芽率,第五天
测量根长、茎长,第六天测根系活力、叶绿素含量、可溶性蛋白质、可溶性糖、SOD、POD、
CAT、MDA.
2. La(Ⅲ)和Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发及保护酶的影响
(1)试材培养
种子预处理:选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min,分别用自来水和
去离子水洗净,常温下晾干备用。
(2)实验设置:在上一步骤中分别筛选出LaCl3、CeCl3的低剂量、适宜剂量、高剂量
三个有效浓度和CuSO4的一个有效浓度,分别记为A1,A2,A3;B1,B2,B3;C。
(3)实验步骤:有以下几组:
A+C:A1+C、A2+C、A3+C
B+C:B1+C、B2+C、B3+C
A+B+C:A1+B1+C 、A1+B2+C 、A1+B3+C、 A2+B1+C、 A2+B2+C、A2+B3+C、
A3+B1+C 、A3+B2+C、 A3+B3+C
酸盐缓冲液(PBS)配制方法
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2M)
pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml
7.0 61.0 39.0
7.7 89.5 10.5
7.8 91.5 8.5
Na2HPO4·2H2O分子量=178.05 0.2M溶液含35.61g/L
Na2HPO4·12 H2O分子量=358.22 0.2M溶液含71.64g/L
NaH2PO4·H2O分子量=138.01 0.2M溶液含27.6g/L
NaH2PO4·2H2O分子量=156.03 0.2M溶液含31.21g/L
0.01M PBS
PBS (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, and 8 mM K2HPO4,pH 7.2)
PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L,
KH2PO4 1.4mmol/L
称7.9g NaCl,0.2g KCl,0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4,溶于
800 ml 蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1 L。保存于4℃
冰箱中即可。
母液的配制:
0.2M Na2HPO4:称取 71.6g Na2HPO4-12H2O,溶于 1000ml 水
0.2M NaH2PO4:称取 31.2g NaH2PO4-2H2O,溶于1000ml 水
各种浓度PB(pH=7.4)的配制:
先配 0.2M PB (pH=7.4,100ml):取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4, 81ml 0.2mol/L 的
Na2HPO4, 即可。
然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可,如:
0.1M PB(PH=7.4) :取 500ml 0.2M PB,加水稀释至 1000ml 即可。
0.01M PB (PH=7.4):取50ml 0.2M PB,加水稀释至 1000ml 即可。
0.02M PB (PH=7.4):取100ml 0.2 M PB,加水稀释至 1000ml 即可。
若需要 NaCl的话,加入 NaCl 至0.9%(g/100ml)即可。
另:其它各种另 PH值的 0.2M PB(100ml)配方 :
pH 0.2M NaH2PO4(ml) 0.2M Na2HPO4(ml)
7.0 38 62
7.8 8.5 91.5
0.01M 磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,用
HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高
压下蒸气灭菌(至少20分钟),保存存于室温或4℃冰箱中。
需要注意的是,通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度,而非Na 离
子或K 离子的浓度,Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。如果是用于免疫组化的话,
则需要在配置的时候分别加入100 u/ml青霉素和链霉素之后再调PH、定容、灭菌消毒。
PH 7.6 7.4 7.2 7.0
H2O 1000 1000 1000 1000
NaCl 8.5 8.5 8.5 8.5
Na2HPO4 2.2 2.2 2.2 2.2
NaH2PO4 0.1 0.2 0.3 0.4
PBS缓冲液
称取NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO412H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g,溶于900ml双蒸水中,
用盐酸调pH值至7.4,加水定容至1L,常温保存备用。
0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution,PBS)的配制:
甲液:0.05mol/L Na2HPO4溶液 :称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸 馏水至1000ml ;
乙液:0.05mol/L KH2P04溶液: 称取磷酸二氢钾, 9.07g 6.803g,加蒸馏水至1000m1。
将甲乙液分装在棕色瓶内,于4℃冰箱中保存,用时甲、乙两液各按不同比例混合,即
可得所需pH的缓冲液,见下表:
pH 甲液ml 乙液mI
7.17 70.0 30.0
7.38 80.0 20.0
7.73 90.0 10.0
8.04 95.0 5.0
实验01根系活力的测定(TTC法)
(二)仪器设备:1. 分光光度计;2. 分析天平(感量0.1mg);3. 电子顶载天平
(感量0.1g);4. 温箱;5. 研钵;6. 三角瓶50ml;7. 漏斗;8. 量筒100ml;9. 吸量管
10ml;10. 刻度试管10ml;11. 试管架;12. 容量瓶10ml;13. 药勺;14. 石英砂适量;
15. 烧杯10ml、1000ml。
(三)试剂:1. 乙酸乙酯(分析纯)。2. 次硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉
末。3.1%TTC溶液 准确称取TTC1.0g,溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需
要的浓度。4. 磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7)。5. 1mol/L硫酸 用量筒取比重1.84的
浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml。6. 0.4mol/L
琥珀酸 称取琥珀酸4.72g,溶于水中,定容至100ml即成。
三、实验步骤
(1)TTC标准曲线的制作 取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中,加少许
Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取
此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻
度,即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列,以空白
作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。
(2)称取根尖样品0.5g,放入10ml烧杯中,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等
量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h,此后加入1mol/L硫酸
2ml,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,其他操作同上)。
(3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎,以提出
甲月替。红色提取液移入试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次,皆移入试管,最后
加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比测出吸
光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量。
四、结果计算
四氮唑还原强度(mg/g(根鲜重)/h)=四氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)]
实验02 脯氨酸含量的测定
(二)仪器设备:1. 722型分光光度计;2. 研钵;3. 100ml小烧杯;4. 容量瓶;
5. 大试管;6. 普通试管;7. 移液管;8. 注射器;9. 水浴锅;10. 漏斗;11. 漏斗架;12.
滤纸;13 剪刀。
(三)试剂1. 酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L
磷酸中,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中;2. 3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏
水溶解后定容至100ml;3. 冰醋酸;4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯内,用
少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每ml含脯
氨酸100μg。(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶,分别盛入脯氨酸原液0.5,
1.0,1.5,2.0,2.5及3.0ml,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为1,2,
3,4,5及6μg/ml。(3)取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml
冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。(4)冷却后各试管准确加入
4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管
上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/2ml)。
2. 样品的测定(1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中,然后向各管分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10min,(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。(3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30S,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000rpm下离心5min。(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2ml),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下:
脯氨酸含量(μg/g)=[X×5/2]/样重(g)。
实验03 叶绿素含量的测定
(二)仪器设备:1. 分光光度计;2. 电子顶载天平(感量0.01g);3. 研钵;4. 棕色容量瓶;5. 小漏斗;6. 定量滤纸;7. 吸水纸;8. 擦境纸;9. 滴管。
(三)试剂:96%乙醇(或80%丙酮);石英砂;碳酸钙粉。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g,共3份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml95%乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。静置3~5min。
3. 取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml,摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95%乙醇为空白,在波长665nm、649nm下测定吸光度。
四、实验结果计算:将测定得到的吸光值代入下面的式子:Ca=13.95A665-
6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度(Ca、Cb:mg/L),二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量:叶绿素的含量(mg/g)= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重(或干重)。
实验04植物组织中可溶性蛋白质含量的测定(福林-酚试剂法)
(二)仪器设备:1. 722分光光度计;2. 离心机;3. 恒温水浴;4. 定量加样器;5. 冷凝回流装置一套;6. 研钵;7. 离心管;8. 刻度移液管;9. 微量滴定管;10. 试管等;
(三)试剂: 标准蛋白质溶液:称取25mg牛血清蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使终浓度为250μg/ml;试剂甲;试剂乙。
首先配制A液:4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3,0.1mol NaOH);B液:1%硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuSO4·5H2O,0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn-酚试剂甲液,此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于Folin试剂)的配备:称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%
的H3PO450ml,浓HCl 100ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g,水50ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15min,以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15min)。使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞作为指示剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1mol/L H+酸,此为Folin-酚试剂乙液(Folin试剂)。
在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。
三、实验步骤
(一)标准曲线的绘制
1. 取18×200mm试管7支,1~7编号,分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液,用蒸馏水补足1ml,使每管含蛋白量分别为0、25、50、100、150、200、250μg/ml。
2. 用定量加样器给每支试管中加入5ml甲液,混匀,于30℃下放置10min。
3. 再向试管中喷射加入0.5ml乙液,立即振荡混匀,在30℃下准确保温30min。
4. 以不加标准蛋白的1号管为空白,在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
(二)样品的测定
称取鲜样0.8g,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,定容25ml过滤,取滤液1.0ml于试管中,然后重复标准曲线绘制中的2~4步骤,以空白管调零,测定吸光度。根据吸光度查标准曲线,求出样品中的蛋白质含量。
五、结果计算:
样品中蛋白的含量(mg/g)=C×VT/(Vs×FW×1000)
式中:C-查标准曲线值(μg);VT-提取液总体积(ml);FW-样品鲜重(g);Vs-测定时加样量(ml)
粗蛋白量(%)=蛋白氮含量×6.2
实验05 植物组织中可溶性糖含量测定(苯酚法)
(二)仪器设备:1. 分光光度计;2. 水浴锅;3. 刻度试管;4. 刻度吸管。
(三)试剂:1. 90%苯酚溶液 称取90克苯酚(AR),加蒸馏水10ml溶解,在室温下可保存数月;2. 9%苯酚溶液 取3ml90%苯酚溶液,加蒸馏水至30ml,现配现用;
3. 浓硫酸(比重1.84);4. 1%蔗糖标准液 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重,精确称取1.000克。加少量水溶解,转入100ml容量瓶中,加入0.5ml浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度;
5. 100μg/L 蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中,加水至刻度。
三、实验步骤
1. 标准曲线的制:向试管内加入1ml9%苯酚溶液,摇匀,再从管液正面以5~20S加入5ml浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8ml,在室温下放置30min,比色。然后以空白为参比,在485nm波长下比色,以糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程。
2. 可溶性糖的提取取:取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取0.10~0.30g,共3份(或干材料),分别放入3支刻度试管中,加入5~10ml蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25ml容量瓶中,反复漂洗试管及残渣,定容至刻度。
3. 测定 吸取0.5ml样品液于试管中(重复2次),加蒸馏水1.5ml,同制作标准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液,显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的量。
四、结果计算
按下式计算测试样品的糖含量:
可溶性糖含量(%)=从标准曲线查得糖的量(μg)×提取液体积(ml)×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100
过氧化氢含量的测定
【仪器和用具】
研钵;移液管0.2ml×2支,5ml×1支;容量瓶10ml×7个,离心管5ml×8支;离心机;分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂:取30%分析纯H2O2 57μl,溶于100ml,再稀释100倍;2mol/L硫酸;5%(W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线:取10ml离心管7支,顺序编号,并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后,将其小心转入10ml容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容至10ml刻度,415nm波长下比色。
2.样品提取和测定:(1)称取新鲜植物组织2~5g(视H2O2含量多少而定),按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000 r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml,按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后3000rpm/min离心10min,弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3~5次,直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算:
CVt
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=FWV1
式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度(μmol);
Vt—样品提取液总体积(ml);
V1—测定时用样品提取液体积(ml);
FW—植物组织鲜重(g)。
实验方案 镧铈对铜胁迫下豌豆种子萌发和生长的影响
1.La(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发影响的显效剂量筛选
(1)浓度梯度设计:
LaCl3/ CeCl 3溶液配置:先配置1g•L-1的LaCl3/ CeCl 3溶液母液,然后将母液分别稀释
成浓度为5、10、20、40,60 mg•L-1梯度浓度,调节PH(HCL/NAOH)至6.5,对照(CK)
为PH调节至6.5的去离子水。
重金属Cuso4浓度的设置: 10、25、50、100、200、400 mg•L-1,对照用蒸馏水。
(2)试材培养
种子预处理:选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min,分别用自来水和
去离子水洗净,常温下晾干备用。
(3)实验设置:CK,La,Ce,Cu(共4组18个浓度57个样品)
(4)试材处理:
选取LaCl3、 CeCl3和 CuSO4各个梯度溶液溶液,豌豆种子经预处理后用各个梯度溶液
浸没处理,对照用蒸馏水,置于25±1℃浸种24h后,将处理后种子均匀排列在直径9cm、
垫有2层滤纸的培养皿中,每处理加入一定量水培养(以没过种子2/3为标准),每处理3
皿重复,每皿20粒。
指标测定方法:
种子发芽第三天测α—淀粉酶,第四天测发芽势,前三天测发芽指数和发芽率,第五天
测量根长、茎长,第六天测根系活力、叶绿素含量、可溶性蛋白质、可溶性糖、SOD、POD、
CAT、MDA.
2. La(Ⅲ)和Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发及保护酶的影响
(1)试材培养
种子预处理:选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min,分别用自来水和
去离子水洗净,常温下晾干备用。
(2)实验设置:在上一步骤中分别筛选出LaCl3、CeCl3的低剂量、适宜剂量、高剂量
三个有效浓度和CuSO4的一个有效浓度,分别记为A1,A2,A3;B1,B2,B3;C。
(3)实验步骤:有以下几组:
A+C:A1+C、A2+C、A3+C
B+C:B1+C、B2+C、B3+C
A+B+C:A1+B1+C 、A1+B2+C 、A1+B3+C、 A2+B1+C、 A2+B2+C、A2+B3+C、
A3+B1+C 、A3+B2+C、 A3+B3+C
酸盐缓冲液(PBS)配制方法
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2M)
pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml
7.0 61.0 39.0
7.7 89.5 10.5
7.8 91.5 8.5
Na2HPO4·2H2O分子量=178.05 0.2M溶液含35.61g/L
Na2HPO4·12 H2O分子量=358.22 0.2M溶液含71.64g/L
NaH2PO4·H2O分子量=138.01 0.2M溶液含27.6g/L
NaH2PO4·2H2O分子量=156.03 0.2M溶液含31.21g/L
0.01M PBS
PBS (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, and 8 mM K2HPO4,pH 7.2)
PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L,
KH2PO4 1.4mmol/L
称7.9g NaCl,0.2g KCl,0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4,溶于
800 ml 蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1 L。保存于4℃
冰箱中即可。
母液的配制:
0.2M Na2HPO4:称取 71.6g Na2HPO4-12H2O,溶于 1000ml 水
0.2M NaH2PO4:称取 31.2g NaH2PO4-2H2O,溶于1000ml 水
各种浓度PB(pH=7.4)的配制:
先配 0.2M PB (pH=7.4,100ml):取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4, 81ml 0.2mol/L 的
Na2HPO4, 即可。
然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可,如:
0.1M PB(PH=7.4) :取 500ml 0.2M PB,加水稀释至 1000ml 即可。
0.01M PB (PH=7.4):取50ml 0.2M PB,加水稀释至 1000ml 即可。
0.02M PB (PH=7.4):取100ml 0.2 M PB,加水稀释至 1000ml 即可。
若需要 NaCl的话,加入 NaCl 至0.9%(g/100ml)即可。
另:其它各种另 PH值的 0.2M PB(100ml)配方 :
pH 0.2M NaH2PO4(ml) 0.2M Na2HPO4(ml)
7.0 38 62
7.8 8.5 91.5
0.01M 磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,用
HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高
压下蒸气灭菌(至少20分钟),保存存于室温或4℃冰箱中。
需要注意的是,通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度,而非Na 离
子或K 离子的浓度,Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。如果是用于免疫组化的话,
则需要在配置的时候分别加入100 u/ml青霉素和链霉素之后再调PH、定容、灭菌消毒。
PH 7.6 7.4 7.2 7.0
H2O 1000 1000 1000 1000
NaCl 8.5 8.5 8.5 8.5
Na2HPO4 2.2 2.2 2.2 2.2
NaH2PO4 0.1 0.2 0.3 0.4
PBS缓冲液
称取NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO412H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g,溶于900ml双蒸水中,
用盐酸调pH值至7.4,加水定容至1L,常温保存备用。
0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution,PBS)的配制:
甲液:0.05mol/L Na2HPO4溶液 :称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸 馏水至1000ml ;
乙液:0.05mol/L KH2P04溶液: 称取磷酸二氢钾, 9.07g 6.803g,加蒸馏水至1000m1。
将甲乙液分装在棕色瓶内,于4℃冰箱中保存,用时甲、乙两液各按不同比例混合,即
可得所需pH的缓冲液,见下表:
pH 甲液ml 乙液mI
7.17 70.0 30.0
7.38 80.0 20.0
7.73 90.0 10.0
8.04 95.0 5.0
实验01根系活力的测定(TTC法)
(二)仪器设备:1. 分光光度计;2. 分析天平(感量0.1mg);3. 电子顶载天平
(感量0.1g);4. 温箱;5. 研钵;6. 三角瓶50ml;7. 漏斗;8. 量筒100ml;9. 吸量管
10ml;10. 刻度试管10ml;11. 试管架;12. 容量瓶10ml;13. 药勺;14. 石英砂适量;
15. 烧杯10ml、1000ml。
(三)试剂:1. 乙酸乙酯(分析纯)。2. 次硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉
末。3.1%TTC溶液 准确称取TTC1.0g,溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需
要的浓度。4. 磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7)。5. 1mol/L硫酸 用量筒取比重1.84的
浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml。6. 0.4mol/L
琥珀酸 称取琥珀酸4.72g,溶于水中,定容至100ml即成。
三、实验步骤
(1)TTC标准曲线的制作 取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中,加少许
Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取
此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻
度,即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列,以空白
作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。
(2)称取根尖样品0.5g,放入10ml烧杯中,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等
量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h,此后加入1mol/L硫酸
2ml,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,其他操作同上)。
(3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎,以提出
甲月替。红色提取液移入试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次,皆移入试管,最后
加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比测出吸
光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量。
四、结果计算
四氮唑还原强度(mg/g(根鲜重)/h)=四氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)]
实验02 脯氨酸含量的测定
(二)仪器设备:1. 722型分光光度计;2. 研钵;3. 100ml小烧杯;4. 容量瓶;
5. 大试管;6. 普通试管;7. 移液管;8. 注射器;9. 水浴锅;10. 漏斗;11. 漏斗架;12.
滤纸;13 剪刀。
(三)试剂1. 酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L
磷酸中,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中;2. 3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏
水溶解后定容至100ml;3. 冰醋酸;4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸,倒入小烧杯内,用
少量蒸馏水溶解,然后倒入250ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,此标准液中每ml含脯
氨酸100μg。(2)系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶,分别盛入脯氨酸原液0.5,
1.0,1.5,2.0,2.5及3.0ml,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,各瓶的脯氨酸浓度分别为1,2,
3,4,5及6μg/ml。(3)取6支试管,分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml
冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30min。(4)冷却后各试管准确加入
4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。(5)用注射器轻轻吸取各管
上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,于520nm波长处进行比色。(6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式,再按回归方程式绘制标准曲线,计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/2ml)。
2. 样品的测定(1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中,然后向各管分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10min,(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。(2)吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。(3)冷却后加入4ml甲苯,摇荡30S,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000rpm下离心5min。(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2ml测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2ml),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下:
脯氨酸含量(μg/g)=[X×5/2]/样重(g)。
实验03 叶绿素含量的测定
(二)仪器设备:1. 分光光度计;2. 电子顶载天平(感量0.01g);3. 研钵;4. 棕色容量瓶;5. 小漏斗;6. 定量滤纸;7. 吸水纸;8. 擦境纸;9. 滴管。
(三)试剂:96%乙醇(或80%丙酮);石英砂;碳酸钙粉。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g,共3份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml95%乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。静置3~5min。
3. 取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml,摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95%乙醇为空白,在波长665nm、649nm下测定吸光度。
四、实验结果计算:将测定得到的吸光值代入下面的式子:Ca=13.95A665-
6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度(Ca、Cb:mg/L),二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量:叶绿素的含量(mg/g)= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重(或干重)。
实验04植物组织中可溶性蛋白质含量的测定(福林-酚试剂法)
(二)仪器设备:1. 722分光光度计;2. 离心机;3. 恒温水浴;4. 定量加样器;5. 冷凝回流装置一套;6. 研钵;7. 离心管;8. 刻度移液管;9. 微量滴定管;10. 试管等;
(三)试剂: 标准蛋白质溶液:称取25mg牛血清蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使终浓度为250μg/ml;试剂甲;试剂乙。
首先配制A液:4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等比例混合(2%Na2CO3,0.1mol NaOH);B液:1%硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5%CuSO4·5H2O,0.1%酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn-酚试剂甲液,此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于Folin试剂)的配备:称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%
的H3PO450ml,浓HCl 100ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g,水50ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15min,以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15min)。使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞作为指示剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1mol/L H+酸,此为Folin-酚试剂乙液(Folin试剂)。
在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。
三、实验步骤
(一)标准曲线的绘制
1. 取18×200mm试管7支,1~7编号,分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液,用蒸馏水补足1ml,使每管含蛋白量分别为0、25、50、100、150、200、250μg/ml。
2. 用定量加样器给每支试管中加入5ml甲液,混匀,于30℃下放置10min。
3. 再向试管中喷射加入0.5ml乙液,立即振荡混匀,在30℃下准确保温30min。
4. 以不加标准蛋白的1号管为空白,在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
(二)样品的测定
称取鲜样0.8g,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,定容25ml过滤,取滤液1.0ml于试管中,然后重复标准曲线绘制中的2~4步骤,以空白管调零,测定吸光度。根据吸光度查标准曲线,求出样品中的蛋白质含量。
五、结果计算:
样品中蛋白的含量(mg/g)=C×VT/(Vs×FW×1000)
式中:C-查标准曲线值(μg);VT-提取液总体积(ml);FW-样品鲜重(g);Vs-测定时加样量(ml)
粗蛋白量(%)=蛋白氮含量×6.2
实验05 植物组织中可溶性糖含量测定(苯酚法)
(二)仪器设备:1. 分光光度计;2. 水浴锅;3. 刻度试管;4. 刻度吸管。
(三)试剂:1. 90%苯酚溶液 称取90克苯酚(AR),加蒸馏水10ml溶解,在室温下可保存数月;2. 9%苯酚溶液 取3ml90%苯酚溶液,加蒸馏水至30ml,现配现用;
3. 浓硫酸(比重1.84);4. 1%蔗糖标准液 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重,精确称取1.000克。加少量水溶解,转入100ml容量瓶中,加入0.5ml浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度;
5. 100μg/L 蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中,加水至刻度。
三、实验步骤
1. 标准曲线的制:向试管内加入1ml9%苯酚溶液,摇匀,再从管液正面以5~20S加入5ml浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8ml,在室温下放置30min,比色。然后以空白为参比,在485nm波长下比色,以糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程。
2. 可溶性糖的提取取:取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取0.10~0.30g,共3份(或干材料),分别放入3支刻度试管中,加入5~10ml蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25ml容量瓶中,反复漂洗试管及残渣,定容至刻度。
3. 测定 吸取0.5ml样品液于试管中(重复2次),加蒸馏水1.5ml,同制作标准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液,显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的量。
四、结果计算
按下式计算测试样品的糖含量:
可溶性糖含量(%)=从标准曲线查得糖的量(μg)×提取液体积(ml)×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100
过氧化氢含量的测定
【仪器和用具】
研钵;移液管0.2ml×2支,5ml×1支;容量瓶10ml×7个,离心管5ml×8支;离心机;分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂:取30%分析纯H2O2 57μl,溶于100ml,再稀释100倍;2mol/L硫酸;5%(W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线:取10ml离心管7支,顺序编号,并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后,将其小心转入10ml容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容至10ml刻度,415nm波长下比色。
2.样品提取和测定:(1)称取新鲜植物组织2~5g(视H2O2含量多少而定),按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000 r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml,按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后3000rpm/min离心10min,弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3~5次,直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算:
CVt
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=FWV1
式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度(μmol);
Vt—样品提取液总体积(ml);
V1—测定时用样品提取液体积(ml);
FW—植物组织鲜重(g)。