二.真核生物的转录后加工

二、真核生物的转录后加工。 真

核生物转录后加工除了mRNA 外，

tRNA 和rRNA 也要经过后加工的过

程。有关真核生物tRNA 的加工处理

了解还不多，可能和原核生物有相

似之处。1. rRNA 的转录后加工。

真核生物有4种rRNA ，即5.8S

rRNA 、18S rRNA、28S rRNA和5S

rRNA 。其中前三者的基因组成一个

转录单位，产生47S 的前体，并很

快转变成45S 前体。45S 前体上有许多甲

基化的位点，在转录过程中或转录后被甲

基化。甲基基团主要是加在核糖上。甲基

化是45S 前体最终成为成熟rRNA 区域的

标志。目前还不清楚45S 前体在剪切位点

断裂后是否就产生成熟的末端，还是要经

进一步的加工。整个加工过程需要蛋白质

的参与，可能形成核蛋白体的形式。真核

生物的5S rRNA是和tRNA 转录在一起的，

经加工处理后成为成熟的5S rRNA 。2.

mRNA 的转录后加工。在真核生物中，几

乎所有的成熟mRNA 有5’帽子（cap ）结

构，多数还有3’末端的poly （A ）尾巴。

这些结构都是在转录后经过修饰的结果。

（1）5’帽子结构。成熟真核生物的mRNA

并没有游离的5’端，而是一种被称为帽子

的结构。真核生物的帽子结构可归纳为三

种：m7GpppX 为帽子0；m7GpppXm 为

帽子1；m7GpppXmYm 为帽子2。不同真

核生物的mRNA 可有不同的帽子结构，同一种真核生物的mRNA 也常有不同的帽子结构。 帽子结构的作用：.为核糖体识别RNA 提供信号；.增加mRNA 的稳定性；.与某些RNA 病毒的正链RNA 的合成有关。(2) 3’ poly(A)尾巴。多数真核生物（酵母除外）的mRNA 3’末端具有长约200 bp的poly （A ）尾巴。poly （A ）尾巴不是由模板DNA 所编码，而是在转录后由RNA 末端腺苷酸转移酶（RNA terminal riboadenylate transferase）催化下，以ATP 为前体，添加到mRNA 的3’末端形成的。有些mRNA 的3’末端没有poly （A ）尾巴，如组蛋白的mRNA ，其3’末端的正确形成依赖于RNA 本身形成的茎环结构，即转录终止于此处。对茎环结构进行突变，只要是维持其二级结构，就不影响转录的终止。说明二级结构所提供的信息比序列本身更重要。poly （ A ）在分子生物学实验中有很大的应用价值。. 应用mRNA 的该特性，可用寡聚T （oligo dT）为引物，反转录合成cDNA 。. 将oligo （ dT ）与载体相连，用于从总RNA 中分离纯化mRNA 。3. 后加工与mRNA 的稳定性。转录后加工是产生各种成熟RNA 分子的重要过程。各种RNA 分子的加工都是在特定的酶参与下完成的，包括核酸内切酶和核酸外切酶。核酸酶除了参与后加工过程外，还负责过剩RNA 的降解。原核生物mRNA 降解的方向为5’至3’ ，可能由内切酶在最后一个核糖体后面发挥作用。余下的片段由外切酶按3’至5’的方向水解成核苷酸。mRNA 分

子结构中的二级结构可以阻止外切酶的

作用。真核生物mRNA 的稳定性可能取决

于去稳定元件（destablizing element）。

将这一元件与mRNA 结合，可引起该

mRNA 的降解。参与RNA 降解的核酸酶类

可能比参与RNA 成熟过程的核酸酶特异

性差。

第六节 RNA 的剪接

割裂基因（split gene ）即不连续基因

（interrupted gene ）是指编码某一RNA 的基因中有些序列并不出现在成熟RNA 序列中，成熟RNA 的序列在基因中被其他的序列间隔开，这些序列称为介入序列，又称为内含子（intron ）。被内含子隔开的、出现在成熟RNA 中的序列称为外显子（exon ）。1977年，Broker 和Sharp 等人发现了断裂基因。现在已经知道绝大多数真核生物的基因都是断裂基因。断裂基因是通过mRNA 与DNA 杂交试验而发现的。一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，然后将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟的RNA 分子，这一过程称为RNA 剪接（RNA splicing）。

一、核基因mRNA 的剪接。 mRNA 的基因在低等真核生物中只有少数含有内含子，为不连续基因。随着进化程度的增高，不连续基因的数目不断增加。细胞核中有一类RNA ，十分不稳定，平均长度比mRNA 要长，序列的复杂程度非

常高，称为核内不均一RNA （ heterogeneous nuclear RNA，hnRNA ）。hnRNA 以与蛋白质结合的状态存在，形成hnRNP （核糖核蛋白颗粒）。体外研究表明，hnRNP 的形状为一个球体和一个与之相连的纤维状结构。在RNA 转录生成以后，在核内完成加帽和加尾的同时，内含子的去除即剪切过程也在进行。然后RNA 转运到胞浆。1. 核基因mRNA 的剪接位点。核基因mRNA 的剪接位点（splicing site ）是指内含子与外显子的断裂点以及相邻外显子的连接点。经过比较mRNA 与其基因的序列发现，在内含子两端分别有两个非常保守的碱基，左剪接位点为GT ，右剪接位点为AG 。内含子在剪接位点的这种特征称为GT －AG

规则（GT-AG role） 。左（5’）剪接点称

为供体位点，右（3’）剪接点称为受体位

点。点突变研究证明，剪接位点GT 或AG

的突变均可以阻止剪接的出现。几乎所有

的真核细胞核基因的内含子均遵循GT －

AG 规则，这也暗示这类内含子存在着共同

的剪接机制。但线粒体、叶绿体和酵母

tRNA 的内含子不遵循这一规则。核RNA

的剪接点及周围并没有自身的互补序列，

5’剪接点总是能正确地与

3’剪接点相连。剪接位点

具有通用性，而内含子的

其他序列（包括二级结构）

不提供特定的信息，对剪

接不产生影响。剪接装置

没有组织特异性，RNA 只

要含有正确的剪接点，在

任何细胞中都可以正确地

剪接。RNA 印迹法（RNA

blotting ）可用于分析核RNA 剪接过程中的

中间体，从而确定内含子的去除顺序。实

验中可以发现含有不同内含子的中间产物，因此内含子的去除似乎没有特定的顺序，但也发现有一定的规律，说明剪接有特定的途径。剪接反应并不是按内含子在RNA 前体上的顺序进行的。RNA 的构象影响剪接点的选择。在去除特定的内含子后，RNA 的构象发生一定的变化，再选择新的剪接点。2. 核基因mRNA 剪接的机制。核提取物能完成mRNA 前体的剪接，说明mRNA 的剪接与转录过程无关。mRNA 的剪接与RNA 的修饰状态也没有关系，没有帽子结构或poly

（A ）尾巴的RNA 都能完成剪接。剪接可以分为三个阶段进行：第一阶段，内含子的5’端切开，形成游离的左侧外显子和右侧的内含子和外显子分子。左侧的外显子呈线状，而右侧的内含子和外显子并不呈线状。与在距内含子的3’端约30个碱基处有一个高度保守的A ，称为分支位点（branching site ）。内含子游离的5’端以5’-2’磷酸二酯键与A 相连，形成一个套索（lariat ）结构。第二个阶段，内含子的3’剪接点被切断而内含子以套索状释放，与此同时右侧外显子与左侧外显子连接在一起。第三个阶段，内含子的套索被切断，形成线状并很快被降解。完成剪接所需要的条件只有三个序列，即5’GT 、3’AG 和分支点序列。内含子和外显子其他序列的缺失并不影响剪接。也说明剪接过程不需要内含子或外显子的特定构象。分支点周围的序列也有一定程度的保守性。突变实验证明，分支点的作用是选择距之最近的3’剪接点作为与5’剪接点相连的靶位点。套索是通过内含子5’的保守G 与分支点A 之间形成磷酸二酯键而形成的，这两个碱基在所有的真核生物中高度保守。在剪接过程中，没有酶的参与，但存在一种机制在反应前对上述保守的序列元件进行检查。只有这些元件都存在的情况下剪接反应才会开始，而任一元件的严重缺失都会抑制剪接反应。剪接过程中的反应为转酯（transesterification ）反应，即酯键由一个位置转移到另一个位置。剪接点的识别是剪接过程中的关键问题。有两种可能，一是通过酶来识别，一是通过RNA 经碱基配对的方式形成二级结构，而后由酶识别。在后一种可能中，识别剪接点的RNA 可以来源于转录产物的本身，或来源于其他的RNA 分子，如snRNA 和scRNA 。各种参与剪接的成分形成一个剪接体系，称为剪接体（spliceosome ）。该体系由几种snRNP

和大量的其他的蛋白质分子组成，这些蛋

白质分子称为剪接因子，估计有40多种。

剪接点和分支点序列由剪接体识别，

snRNA 和蛋白质都参与了识别，特别是

snRNA 之间以及与mRNA 间的碱基配对

起重要作用。剪接体按一定的顺序组装，

已分离到一些组装的中间体。只有组装完

整的剪接体才有功能。在剪接反应中，剪

接体还会释放和添加某些成分。转酯反应

只是磷酸酯键的直接转移，没有水解反应

的出现，因此不需要外部的能量，也不需

要供能物质如ATP 或GTP 的参与剪接体

中起催化转酯反应的成分尚未弄清楚，也

不知道是蛋白质还是RNA 在起作用。3. 酵

母tRNA 的剪接。酵母有400个左右的

tRNA 基因，其中有40个属于割裂基因，

均只含有一个内含子，位于反密码环3’端。

所有酵母的tRNA 内含子含有一段与反密

码环互补的序列，序列互补的结果是使反

密码环处形成了一个与成熟tRNA 分子不

同的构象，而其他的结构均和成熟的

tRNA 相同。在酵母tRNA 的剪接过程中，

内含子的序列和大小对剪接无太大的影

响，剪接反应主要识别其二级结构(三叶草

型结构) 。酵母tRNA 的剪接采用了与核基

因mRNA 不同的机制，链的断裂与连接不

是同时进行的，而是两个独立的反应。第

一步先由内切酶切断磷酸二酯键，第二步

由RNA 连接酶将断端连接形成成熟的tRNA 分子。

二、真核生物的转录后加工。 真

核生物转录后加工除了mRNA 外，

tRNA 和rRNA 也要经过后加工的过

程。有关真核生物tRNA 的加工处理

了解还不多，可能和原核生物有相

似之处。1. rRNA 的转录后加工。

真核生物有4种rRNA ，即5.8S

rRNA 、18S rRNA、28S rRNA和5S

rRNA 。其中前三者的基因组成一个

转录单位，产生47S 的前体，并很

快转变成45S 前体。45S 前体上有许多甲

基化的位点，在转录过程中或转录后被甲

基化。甲基基团主要是加在核糖上。甲基

化是45S 前体最终成为成熟rRNA 区域的

标志。目前还不清楚45S 前体在剪切位点

断裂后是否就产生成熟的末端，还是要经

进一步的加工。整个加工过程需要蛋白质

的参与，可能形成核蛋白体的形式。真核

生物的5S rRNA是和tRNA 转录在一起的，

经加工处理后成为成熟的5S rRNA 。2.

mRNA 的转录后加工。在真核生物中，几

乎所有的成熟mRNA 有5’帽子（cap ）结

构，多数还有3’末端的poly （A ）尾巴。

这些结构都是在转录后经过修饰的结果。

（1）5’帽子结构。成熟真核生物的mRNA

并没有游离的5’端，而是一种被称为帽子

的结构。真核生物的帽子结构可归纳为三

种：m7GpppX 为帽子0；m7GpppXm 为

帽子1；m7GpppXmYm 为帽子2。不同真

核生物的mRNA 可有不同的帽子结构，同一种真核生物的mRNA 也常有不同的帽子结构。 帽子结构的作用：.为核糖体识别RNA 提供信号；.增加mRNA 的稳定性；.与某些RNA 病毒的正链RNA 的合成有关。(2) 3’ poly(A)尾巴。多数真核生物（酵母除外）的mRNA 3’末端具有长约200 bp的poly （A ）尾巴。poly （A ）尾巴不是由模板DNA 所编码，而是在转录后由RNA 末端腺苷酸转移酶（RNA terminal riboadenylate transferase）催化下，以ATP 为前体，添加到mRNA 的3’末端形成的。有些mRNA 的3’末端没有poly （A ）尾巴，如组蛋白的mRNA ，其3’末端的正确形成依赖于RNA 本身形成的茎环结构，即转录终止于此处。对茎环结构进行突变，只要是维持其二级结构，就不影响转录的终止。说明二级结构所提供的信息比序列本身更重要。poly （ A ）在分子生物学实验中有很大的应用价值。. 应用mRNA 的该特性，可用寡聚T （oligo dT）为引物，反转录合成cDNA 。. 将oligo （ dT ）与载体相连，用于从总RNA 中分离纯化mRNA 。3. 后加工与mRNA 的稳定性。转录后加工是产生各种成熟RNA 分子的重要过程。各种RNA 分子的加工都是在特定的酶参与下完成的，包括核酸内切酶和核酸外切酶。核酸酶除了参与后加工过程外，还负责过剩RNA 的降解。原核生物mRNA 降解的方向为5’至3’ ，可能由内切酶在最后一个核糖体后面发挥作用。余下的片段由外切酶按3’至5’的方向水解成核苷酸。mRNA 分

子结构中的二级结构可以阻止外切酶的

作用。真核生物mRNA 的稳定性可能取决

于去稳定元件（destablizing element）。

将这一元件与mRNA 结合，可引起该

mRNA 的降解。参与RNA 降解的核酸酶类

可能比参与RNA 成熟过程的核酸酶特异

性差。

第六节 RNA 的剪接

割裂基因（split gene ）即不连续基因

（interrupted gene ）是指编码某一RNA 的基因中有些序列并不出现在成熟RNA 序列中，成熟RNA 的序列在基因中被其他的序列间隔开，这些序列称为介入序列，又称为内含子（intron ）。被内含子隔开的、出现在成熟RNA 中的序列称为外显子（exon ）。1977年，Broker 和Sharp 等人发现了断裂基因。现在已经知道绝大多数真核生物的基因都是断裂基因。断裂基因是通过mRNA 与DNA 杂交试验而发现的。一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，然后将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟的RNA 分子，这一过程称为RNA 剪接（RNA splicing）。

一、核基因mRNA 的剪接。 mRNA 的基因在低等真核生物中只有少数含有内含子，为不连续基因。随着进化程度的增高，不连续基因的数目不断增加。细胞核中有一类RNA ，十分不稳定，平均长度比mRNA 要长，序列的复杂程度非

常高，称为核内不均一RNA （ heterogeneous nuclear RNA，hnRNA ）。hnRNA 以与蛋白质结合的状态存在，形成hnRNP （核糖核蛋白颗粒）。体外研究表明，hnRNP 的形状为一个球体和一个与之相连的纤维状结构。在RNA 转录生成以后，在核内完成加帽和加尾的同时，内含子的去除即剪切过程也在进行。然后RNA 转运到胞浆。1. 核基因mRNA 的剪接位点。核基因mRNA 的剪接位点（splicing site ）是指内含子与外显子的断裂点以及相邻外显子的连接点。经过比较mRNA 与其基因的序列发现，在内含子两端分别有两个非常保守的碱基，左剪接位点为GT ，右剪接位点为AG 。内含子在剪接位点的这种特征称为GT －AG

规则（GT-AG role） 。左（5’）剪接点称

为供体位点，右（3’）剪接点称为受体位

点。点突变研究证明，剪接位点GT 或AG

的突变均可以阻止剪接的出现。几乎所有

的真核细胞核基因的内含子均遵循GT －

AG 规则，这也暗示这类内含子存在着共同

的剪接机制。但线粒体、叶绿体和酵母

tRNA 的内含子不遵循这一规则。核RNA

的剪接点及周围并没有自身的互补序列，

5’剪接点总是能正确地与

3’剪接点相连。剪接位点

具有通用性，而内含子的

其他序列（包括二级结构）

不提供特定的信息，对剪

接不产生影响。剪接装置

没有组织特异性，RNA 只

要含有正确的剪接点，在

任何细胞中都可以正确地

剪接。RNA 印迹法（RNA

blotting ）可用于分析核RNA 剪接过程中的

中间体，从而确定内含子的去除顺序。实

验中可以发现含有不同内含子的中间产物，因此内含子的去除似乎没有特定的顺序，但也发现有一定的规律，说明剪接有特定的途径。剪接反应并不是按内含子在RNA 前体上的顺序进行的。RNA 的构象影响剪接点的选择。在去除特定的内含子后，RNA 的构象发生一定的变化，再选择新的剪接点。2. 核基因mRNA 剪接的机制。核提取物能完成mRNA 前体的剪接，说明mRNA 的剪接与转录过程无关。mRNA 的剪接与RNA 的修饰状态也没有关系，没有帽子结构或poly

（A ）尾巴的RNA 都能完成剪接。剪接可以分为三个阶段进行：第一阶段，内含子的5’端切开，形成游离的左侧外显子和右侧的内含子和外显子分子。左侧的外显子呈线状，而右侧的内含子和外显子并不呈线状。与在距内含子的3’端约30个碱基处有一个高度保守的A ，称为分支位点（branching site ）。内含子游离的5’端以5’-2’磷酸二酯键与A 相连，形成一个套索（lariat ）结构。第二个阶段，内含子的3’剪接点被切断而内含子以套索状释放，与此同时右侧外显子与左侧外显子连接在一起。第三个阶段，内含子的套索被切断，形成线状并很快被降解。完成剪接所需要的条件只有三个序列，即5’GT 、3’AG 和分支点序列。内含子和外显子其他序列的缺失并不影响剪接。也说明剪接过程不需要内含子或外显子的特定构象。分支点周围的序列也有一定程度的保守性。突变实验证明，分支点的作用是选择距之最近的3’剪接点作为与5’剪接点相连的靶位点。套索是通过内含子5’的保守G 与分支点A 之间形成磷酸二酯键而形成的，这两个碱基在所有的真核生物中高度保守。在剪接过程中，没有酶的参与，但存在一种机制在反应前对上述保守的序列元件进行检查。只有这些元件都存在的情况下剪接反应才会开始，而任一元件的严重缺失都会抑制剪接反应。剪接过程中的反应为转酯（transesterification ）反应，即酯键由一个位置转移到另一个位置。剪接点的识别是剪接过程中的关键问题。有两种可能，一是通过酶来识别，一是通过RNA 经碱基配对的方式形成二级结构，而后由酶识别。在后一种可能中，识别剪接点的RNA 可以来源于转录产物的本身，或来源于其他的RNA 分子，如snRNA 和scRNA 。各种参与剪接的成分形成一个剪接体系，称为剪接体（spliceosome ）。该体系由几种snRNP

和大量的其他的蛋白质分子组成，这些蛋

白质分子称为剪接因子，估计有40多种。

剪接点和分支点序列由剪接体识别，

snRNA 和蛋白质都参与了识别，特别是

snRNA 之间以及与mRNA 间的碱基配对

起重要作用。剪接体按一定的顺序组装，

已分离到一些组装的中间体。只有组装完

整的剪接体才有功能。在剪接反应中，剪

接体还会释放和添加某些成分。转酯反应

只是磷酸酯键的直接转移，没有水解反应

的出现，因此不需要外部的能量，也不需

要供能物质如ATP 或GTP 的参与剪接体

中起催化转酯反应的成分尚未弄清楚，也

不知道是蛋白质还是RNA 在起作用。3. 酵

母tRNA 的剪接。酵母有400个左右的

tRNA 基因，其中有40个属于割裂基因，

均只含有一个内含子，位于反密码环3’端。

所有酵母的tRNA 内含子含有一段与反密

码环互补的序列，序列互补的结果是使反

密码环处形成了一个与成熟tRNA 分子不

同的构象，而其他的结构均和成熟的

tRNA 相同。在酵母tRNA 的剪接过程中，

内含子的序列和大小对剪接无太大的影

响，剪接反应主要识别其二级结构(三叶草

型结构) 。酵母tRNA 的剪接采用了与核基

因mRNA 不同的机制，链的断裂与连接不

是同时进行的，而是两个独立的反应。第

一步先由内切酶切断磷酸二酯键，第二步

由RNA 连接酶将断端连接形成成熟的tRNA 分子。