一、目的
规范脑脊液常规检查。 二、适用范围
适用于脑脊液的常规检测,包括:一般性状的检查、潘氏试验、细胞总数计数、白细胞计数与分类、革兰氏染色、抗酸染色、墨汁染色。 三、支持性文件
《全国临床检验操作规程》(第三版) 、《临床检验基础》(第三版) 四、标本处理
1、标本收集后应立即送验,一般不能超过1h 。收到标本后应立即检查,久置可致细胞破坏,影响细胞计数及分类检查;葡萄糖分解使含量降低;病原菌破坏或溶解。 2、细胞计数管应避免标本凝固,遇高蛋白标本时,可用EDTA 盐抗凝。 五、一般性状检查
主要观察颜色与透明度,可记录为水样透明、白雾状浑浊、微黄浑浊、绿黄浑浊、灰白浑浊等。脓性标本应立即直接涂片进行革兰染色检查细菌,并应及时接种培养基。 1、红色:
如标本为血性,为区别蛛网膜下腔出血或穿刺性损伤,应注意:
(1)将血性脑脊液试管离心沉淀(1500r/min) ,如上层液体呈黄色,隐血试验阳性,多为蛛网膜下腔出血,且出血的时间已超过4h 。如上层液体澄清无色,红细胞均沉管底,多为穿刺损伤或因病变所致的新鲜出血。
(2)红细胞皱缩,不仅见于陈旧性出血,在穿刺外伤引起出血时也可见到。因脑脊液渗透压较血浆高所致。 2、黄色:
除陈旧性出血外,在脑脊髓肿瘤所致脑脊液滞留时,也可呈黄色。黄疸患者的脑脊液也可呈黄色。但前者呈黄色透明的胶冻状。 3、米汤样:
由于白(脓) 细胞增多,可见于各种化脓性细菌引起的脑膜炎。 4、绿色:
可见于绿脓杆菌、肺炎链球菌、甲型链球菌引起的脑膜炎。 5、褐或黑色:
见于侵犯脑膜的中枢神经系统黑色素肉瘤。 五、潘氏(Pandy)球蛋白定性试验 1、原理
脑脊液中球蛋白与苯酚结合,可形成不溶性蛋白盐而下沉,产生白色浑浊或沉淀。 2、试剂
5%苯酚溶液:取纯苯酚25m1,加蒸馏水至500m1,用力振摇,置37℃温箱内1—2天,待完全溶解后,置棕色瓶内保存。 3、操作
取试剂2—3m1,置于小试管内,用毛细滴管滴入脑脊液l 一2滴,衬以黑背景,立即观察结果。 4、结果判断
阴性:清晰透明,不显雾状。
极弱阳性(土) :微呈白雾状,在黑色背景下,才能看到。 弱阳性(十) :灰白色云雾状。 阳性(2十) :白色浑浊。 强阳性(3十) :白色浓絮状沉淀。 最强阳性(4十) :白色凝块。 5、临床意义
正常时多为阴性。有脑组织和脑膜疾患时常呈阳性反应,如化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、梅毒性中枢神经系统疾病、脊髓灰白质炎、流行性脑炎等。脑出血时多呈强阳性反应,如外伤性血液混入脑脊液中,亦可呈阳性反应。 六、细胞计数 (一)、细胞总数 1、器材及试剂 (1)细胞计数板;
(2)红细胞稀释液(配法同血液红细胞稀释液) 。
2、操作
(1)对澄清的脑脊液可混匀后用滴管直接滴入计数池,计数10个大方格内红、白细胞数,其总和即为每μl 的细胞数。再换算成每升脑脊液中的细胞数。如细胞较多,可计数一大格内的细胞×10,即得每μl 脑脊液中细胞总数。如用升表示,则再乘以10。
(2)浑浊或带血的脑脊液可用血红蛋白吸管吸取混匀的脑脊液20μl ,加入含红细胞稀释液0.38m1的小试管内,混匀后滴入计数池内,用低倍镜计数4个大方格中的细胞总数,乘以50,即为每μl 脑脊液的细胞总数。 (二) 、白细胞数 1、非血性标本:
小试管内放入冰乙酸1—2滴,转动试管,使内壁沾有冰乙酸后倾去之,然后滴加混匀的脑脊液3—4滴,数分钟后,混匀充入计数池,按细胞总数操作中的红、白细胞计数法计数。 2、血性标本:
将混匀的脑脊液用1%冰乙酸溶液稀释后进行计数。为剔除因出血而来的白细胞数,用下式进行校正。
每μl 脑脊液内白细胞校正数=每μl 脑脊液内白细胞未校正数
每μl 脑脊液内内红细胞数×每μl 血液内白细胞 - ──────────────────────
3、参考值
正常人脑脊液中无红细胞,仅有少量白细胞。 成人:(0—8)×10ˇ6/L 儿童:(0一15)×10ˇ6/L
多为淋巴细胞及大单核细胞,两者之比约为7:3,偶见内皮细胞。
4、附注
(1)计数应及时进行,以免脑脊液凝固,使结果不准确。
每μl 血液内红细胞
6
(2)细胞计数时,应注意新型隐球菌与白细胞的区别。前者不溶于乙酸,加优质墨汁后可见不着色的荚膜。
(3)计数池用后,应用75%乙醇消毒60min 。忌用苯酚消毒,因有损计数池的刻度。 (三) 、细胞分类 1、直接分类法:
白细胞计数后,将低倍镜换为高倍镜,直接在高倍镜下根据细胞核的形态分别计数单个核细胞(包括淋巴细胞及单核细胞) 和多核细胞,应数100个白细胞,并以百分率表示。若白细胞少于100个,应直接写出单核、多核细胞的具体数字。 2、染色分类法:
如直接分类不易区分细胞时,可将脑脊液离心沉淀,取沉淀物2滴,加正常血清l 滴,推片制成均匀薄膜,置室温或37℃温箱内待干,进行瑞氏染色后用油镜分类。 如见有不能分类的细胞,应另行描述报告,如脑膜白血病或肿瘤时。 (四) 、临床意义
1、中枢神经系统病变的脑脊液,细胞数可增多,其增多的程度及细胞的种类与病变的性质有关。
2、中枢神经系统病毒感染、结核性或霉菌性脑膜炎时,细胞数可中度增加,常以淋巴细胞为主。
3、细菌感染时(化脓性脑膜炎) ,细胞数显著增加,以中性粒细胞为主。 4、脑寄生虫病时,可见较多的嗜酸性粒细胞。
5、脑室或蛛网膜下腔出血时,脑脊液内可见多数红细胞。 七、细菌直接涂片检查 (一)、革兰氏染色
临床怀疑流行性脑脊髓膜炎或化脓性脑脊髓膜炎时,应作细菌学涂片检查。操作如下:
1、将脑脊液立即离心沉淀,取沉淀物涂片2张。
2、涂片应在室温中,或置37℃温箱中干燥,切勿以火焰烘烤。
3、经火焰固定后,一张涂片用亚甲蓝染色30s ,另一张作革兰氏染色,操作如下: (1)加结晶紫染1min ,清水冲去染液,倒去玻片上水。
(2)加碘液染1min ,水冲。
(3)加脱色液(75%乙醇),不时摇动10~30s ,至无紫色脱落为止,水洗。 (4)加复染液,染30s ,水洗。干后镜检。
4、注意细胞内外的细菌形态,报告时应予以描述。报告检查到革兰氏阴(阳) 性细菌,或未见革兰氏细菌。 (二)、抗酸染色
临床上怀疑为结核性脑脊髓膜炎时,应作抗酸染色。单张涂片抗酸染色阳性率较低,但如果检查涂片增至4张,阳性率可达80%以上。操作如下: 石炭酸复红染色法:
1、涂片经火焰固定后,加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸气出现,切不可沸腾。染色5min ,冷却后水洗。
2、加脱色剂,不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗。 3、加复染液,染0.5~1min ,水洗。
4、干后镜检。分枝杆菌呈红色,背景为蓝色。 金永染色法:
1、涂片固定后加第1液5~10min ,不必加热。
2、弃去第1液后水洗,加第2液(脱色液)脱色至无红色脱落为止,水洗。 3、加第3液(复染液)复染30s ,水洗,待干,油镜镜检。抗酸菌染成红色,非抗酸菌及细胞染成谈蓝色。 八、真菌检查-新形隐球菌检查 1、操作
(1)取脑脊液,以2000r /min 离心10min ,以沉淀物作涂片,加优质经过滤的细墨汁l 滴,混合,加盖玻片检查。
(2)先用低倍镜检查,如发现在黑色背景中有圆形透光小点,中间有一细胞大小的圆形物质,即用高倍镜仔细观察结构,新形隐球菌直径5—20μm ,可见明显的厚膜,并有出芽的球形孢子。每次镜检用空白墨水滴作为对照,以防墨汁污染。 2、报告方式
涂片找到“隐球菌属”。
一、目的
规范脑脊液常规检查。 二、适用范围
适用于脑脊液的常规检测,包括:一般性状的检查、潘氏试验、细胞总数计数、白细胞计数与分类、革兰氏染色、抗酸染色、墨汁染色。 三、支持性文件
《全国临床检验操作规程》(第三版) 、《临床检验基础》(第三版) 四、标本处理
1、标本收集后应立即送验,一般不能超过1h 。收到标本后应立即检查,久置可致细胞破坏,影响细胞计数及分类检查;葡萄糖分解使含量降低;病原菌破坏或溶解。 2、细胞计数管应避免标本凝固,遇高蛋白标本时,可用EDTA 盐抗凝。 五、一般性状检查
主要观察颜色与透明度,可记录为水样透明、白雾状浑浊、微黄浑浊、绿黄浑浊、灰白浑浊等。脓性标本应立即直接涂片进行革兰染色检查细菌,并应及时接种培养基。 1、红色:
如标本为血性,为区别蛛网膜下腔出血或穿刺性损伤,应注意:
(1)将血性脑脊液试管离心沉淀(1500r/min) ,如上层液体呈黄色,隐血试验阳性,多为蛛网膜下腔出血,且出血的时间已超过4h 。如上层液体澄清无色,红细胞均沉管底,多为穿刺损伤或因病变所致的新鲜出血。
(2)红细胞皱缩,不仅见于陈旧性出血,在穿刺外伤引起出血时也可见到。因脑脊液渗透压较血浆高所致。 2、黄色:
除陈旧性出血外,在脑脊髓肿瘤所致脑脊液滞留时,也可呈黄色。黄疸患者的脑脊液也可呈黄色。但前者呈黄色透明的胶冻状。 3、米汤样:
由于白(脓) 细胞增多,可见于各种化脓性细菌引起的脑膜炎。 4、绿色:
可见于绿脓杆菌、肺炎链球菌、甲型链球菌引起的脑膜炎。 5、褐或黑色:
见于侵犯脑膜的中枢神经系统黑色素肉瘤。 五、潘氏(Pandy)球蛋白定性试验 1、原理
脑脊液中球蛋白与苯酚结合,可形成不溶性蛋白盐而下沉,产生白色浑浊或沉淀。 2、试剂
5%苯酚溶液:取纯苯酚25m1,加蒸馏水至500m1,用力振摇,置37℃温箱内1—2天,待完全溶解后,置棕色瓶内保存。 3、操作
取试剂2—3m1,置于小试管内,用毛细滴管滴入脑脊液l 一2滴,衬以黑背景,立即观察结果。 4、结果判断
阴性:清晰透明,不显雾状。
极弱阳性(土) :微呈白雾状,在黑色背景下,才能看到。 弱阳性(十) :灰白色云雾状。 阳性(2十) :白色浑浊。 强阳性(3十) :白色浓絮状沉淀。 最强阳性(4十) :白色凝块。 5、临床意义
正常时多为阴性。有脑组织和脑膜疾患时常呈阳性反应,如化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、梅毒性中枢神经系统疾病、脊髓灰白质炎、流行性脑炎等。脑出血时多呈强阳性反应,如外伤性血液混入脑脊液中,亦可呈阳性反应。 六、细胞计数 (一)、细胞总数 1、器材及试剂 (1)细胞计数板;
(2)红细胞稀释液(配法同血液红细胞稀释液) 。
2、操作
(1)对澄清的脑脊液可混匀后用滴管直接滴入计数池,计数10个大方格内红、白细胞数,其总和即为每μl 的细胞数。再换算成每升脑脊液中的细胞数。如细胞较多,可计数一大格内的细胞×10,即得每μl 脑脊液中细胞总数。如用升表示,则再乘以10。
(2)浑浊或带血的脑脊液可用血红蛋白吸管吸取混匀的脑脊液20μl ,加入含红细胞稀释液0.38m1的小试管内,混匀后滴入计数池内,用低倍镜计数4个大方格中的细胞总数,乘以50,即为每μl 脑脊液的细胞总数。 (二) 、白细胞数 1、非血性标本:
小试管内放入冰乙酸1—2滴,转动试管,使内壁沾有冰乙酸后倾去之,然后滴加混匀的脑脊液3—4滴,数分钟后,混匀充入计数池,按细胞总数操作中的红、白细胞计数法计数。 2、血性标本:
将混匀的脑脊液用1%冰乙酸溶液稀释后进行计数。为剔除因出血而来的白细胞数,用下式进行校正。
每μl 脑脊液内白细胞校正数=每μl 脑脊液内白细胞未校正数
每μl 脑脊液内内红细胞数×每μl 血液内白细胞 - ──────────────────────
3、参考值
正常人脑脊液中无红细胞,仅有少量白细胞。 成人:(0—8)×10ˇ6/L 儿童:(0一15)×10ˇ6/L
多为淋巴细胞及大单核细胞,两者之比约为7:3,偶见内皮细胞。
4、附注
(1)计数应及时进行,以免脑脊液凝固,使结果不准确。
每μl 血液内红细胞
6
(2)细胞计数时,应注意新型隐球菌与白细胞的区别。前者不溶于乙酸,加优质墨汁后可见不着色的荚膜。
(3)计数池用后,应用75%乙醇消毒60min 。忌用苯酚消毒,因有损计数池的刻度。 (三) 、细胞分类 1、直接分类法:
白细胞计数后,将低倍镜换为高倍镜,直接在高倍镜下根据细胞核的形态分别计数单个核细胞(包括淋巴细胞及单核细胞) 和多核细胞,应数100个白细胞,并以百分率表示。若白细胞少于100个,应直接写出单核、多核细胞的具体数字。 2、染色分类法:
如直接分类不易区分细胞时,可将脑脊液离心沉淀,取沉淀物2滴,加正常血清l 滴,推片制成均匀薄膜,置室温或37℃温箱内待干,进行瑞氏染色后用油镜分类。 如见有不能分类的细胞,应另行描述报告,如脑膜白血病或肿瘤时。 (四) 、临床意义
1、中枢神经系统病变的脑脊液,细胞数可增多,其增多的程度及细胞的种类与病变的性质有关。
2、中枢神经系统病毒感染、结核性或霉菌性脑膜炎时,细胞数可中度增加,常以淋巴细胞为主。
3、细菌感染时(化脓性脑膜炎) ,细胞数显著增加,以中性粒细胞为主。 4、脑寄生虫病时,可见较多的嗜酸性粒细胞。
5、脑室或蛛网膜下腔出血时,脑脊液内可见多数红细胞。 七、细菌直接涂片检查 (一)、革兰氏染色
临床怀疑流行性脑脊髓膜炎或化脓性脑脊髓膜炎时,应作细菌学涂片检查。操作如下:
1、将脑脊液立即离心沉淀,取沉淀物涂片2张。
2、涂片应在室温中,或置37℃温箱中干燥,切勿以火焰烘烤。
3、经火焰固定后,一张涂片用亚甲蓝染色30s ,另一张作革兰氏染色,操作如下: (1)加结晶紫染1min ,清水冲去染液,倒去玻片上水。
(2)加碘液染1min ,水冲。
(3)加脱色液(75%乙醇),不时摇动10~30s ,至无紫色脱落为止,水洗。 (4)加复染液,染30s ,水洗。干后镜检。
4、注意细胞内外的细菌形态,报告时应予以描述。报告检查到革兰氏阴(阳) 性细菌,或未见革兰氏细菌。 (二)、抗酸染色
临床上怀疑为结核性脑脊髓膜炎时,应作抗酸染色。单张涂片抗酸染色阳性率较低,但如果检查涂片增至4张,阳性率可达80%以上。操作如下: 石炭酸复红染色法:
1、涂片经火焰固定后,加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸气出现,切不可沸腾。染色5min ,冷却后水洗。
2、加脱色剂,不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗。 3、加复染液,染0.5~1min ,水洗。
4、干后镜检。分枝杆菌呈红色,背景为蓝色。 金永染色法:
1、涂片固定后加第1液5~10min ,不必加热。
2、弃去第1液后水洗,加第2液(脱色液)脱色至无红色脱落为止,水洗。 3、加第3液(复染液)复染30s ,水洗,待干,油镜镜检。抗酸菌染成红色,非抗酸菌及细胞染成谈蓝色。 八、真菌检查-新形隐球菌检查 1、操作
(1)取脑脊液,以2000r /min 离心10min ,以沉淀物作涂片,加优质经过滤的细墨汁l 滴,混合,加盖玻片检查。
(2)先用低倍镜检查,如发现在黑色背景中有圆形透光小点,中间有一细胞大小的圆形物质,即用高倍镜仔细观察结构,新形隐球菌直径5—20μm ,可见明显的厚膜,并有出芽的球形孢子。每次镜检用空白墨水滴作为对照,以防墨汁污染。 2、报告方式
涂片找到“隐球菌属”。