摘要：采用乳酸菌（Lactobacillus）发酵鲢鱼（Hypophthaimichthys molitrix）下脚料水解液，通过响应面分析法优化其最佳的工艺条件。结果表明，优工艺条件为蔗糖添加量1.80%、乳酸菌接种量1.97%、发酵温度42.23 ℃、发酵时间43.04 h，水解液感观评价均值能达到92.02分，该水解液具有特殊乳酸发酵香味和风味，酸度、甜度适中，口感良好。 关键词：乳酸菌（Lactobacillus）；发酵；鲢鱼（Hypophthaimichthys molitrix）下脚料；响应面分析法 中图分类号：TQ921+.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4175-04 Optimization of Lactobacillus Fermentation of the Hydrolysates of Silver Carp By-product by Response Surface Methodology JIANG Sheng-tao1，2，LIN Biao-sheng1，CHEN Li-min1，LAI Xue-lian1 （1.Longyan University，Longyan 364000，Fujian，China； 2.Ningde Normal University，Ningde 352100，Fujian，China） Abstract： The Lactobacillus fermentation of the hydrolysates of silver carp by-product was studied and the technological conditions were optimized by response surface methodology. The results indicated that the optimal technological conditions were as follows， sugar concentration 1.80%， seeding amount of Lactobacillus 1.97%， fermented for 43.04 h under 42.23 ℃， the mean value of sensory estimate was reached 92.02， the flavor of the fermentation liquid was best with peat-reek of lactic acid， and the liquid tasted sweet and sour， very delicate. Key words： Lactobacillus； fermentation； silver carp by-product； response surface methodology 收稿日期：2013-01-21 基金项目：福建省教育厅B类龙岩学院校立服务海西项目（JB09209）；2012年福建省“大学生创新创业培训计划”项目 作者简介：江胜滔（1971-），男，福建建瓯人，讲师，硕士，主要从事微生物发酵工程研究，（电话）[1**********]（电子信箱）[email protected]。 乳酸菌（Lactobacillus）是指能发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。乳酸菌能分解食物中的糖类、蛋白质，合成维生素，对脂肪类化合物也有微弱的分解能力，能提高脂肪类食物的消化率，促进其消化吸收[1]。 在鱼类加工过程中会产生大量的下脚料，包括鱼头、鱼尾、鱼骨、鱼鳍等。据报道，这些下脚料占鱼总重的40%～55%[2]。大量的下脚料不仅造成环境的污染，而且其营养价值也未得到充分利用，因此必须加强对下脚料有效利用，提高鱼的附加利用价值。下脚料用清水洗净后剪切成小片后用组织捣碎机捣碎，制备成水解液，经过酸化处理后可以作为肥料或者饲料添加剂。水解液的制备可以采用硫酸等无机酸，也可以采用乳酸等有机酸。利用有机酸降低酸度具有更大的优势，使用时保藏时间较长、无需中和处理，并且能被土壤利用，可提高饲料的营养价值且不破坏土壤[3]。采用乳酸菌发酵鲢鱼（Hypophthaimichthys molitrix）下脚料水解液，不仅能够除去大部分的腥味，赋予水解液特殊的发酵香味，而且还能增加水解液中的其他风味物质，使鲢鱼下脚料水解液的整体风味得到了很大改善[4]。本研究采用乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液，通过响应面分析法优化其发酵工艺条件，为提高鲢鱼等水产品下脚料产品附加值的研究与开发利用提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料 鲢鱼下脚料包括鲢鱼的鱼头、鱼尾、鱼骨、鱼鳍及剩余的鱼肉等均取自龙岩学院校大门对面的某酒店。嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。 嗜热链球菌MRS培养基：葡萄糖5.0 g、牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.05 g、硫酸锰0.2 g、碳酸钙20.0 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.8，固体培养基加20.0 g琼脂。 保加利亚乳杆菌培养基：葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、吐温-80 1.0 mL、醋酸钠5.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.2 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.8，固体培养基加20.0 g琼脂。 1.2 方法 1.2.1 乳酸菌种的活化与培养 将保藏于实验室的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，接种于三角瓶液体培养基中，置于37 ℃培养18～20 h，待用。 1.2.2 乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程 鲢鱼下脚料水解液→装入250 mL三角瓶中→100 ℃水浴锅中杀菌15 min→冷却至40 ℃→加入蔗糖调节→接种乳酸菌（1∶1接种嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌）→恒温发酵→灭活→感观评价 1.2.3 工艺流程中各参数的单因素优化 参照文献[5，6]，对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程各参数进行单因素试验。蔗糖添加量取1%、2%、3%、4%、5%，乳酸菌接种量1%、2%、3%、4%、5%，发酵温度35、37、39、42、44 ℃，发酵时间24、32、40、48、56 h，以水解液感观评价为指标，确定较优的各因素取值范围，用于响应面分析法优化的参数水平。感观评价标准[7]：总分100分，以10个学生打分平均值为准。色泽：色泽均匀一致；气味：有明显的发酵乳香气；滋味：酸甜适中；组织状态：表面光滑，细腻，凝块均匀。 1.2.4 响应面分析法优化乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程 在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用响应面分析法，以感官品质作为评价指标，利用Design-Expert 7.0软件在4因素3水平上对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程中的影响因素蔗糖添加量、乳酸菌接种量、发酵温度、发酵时间进行优化，确定最佳的工艺流程[8]。Box-Benhnken设计的因素与水平见表1。 2 结果与分析 2.1 乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程单因素试验结果 2.1.1 蔗糖添加量对水解液感观评价的影响 蔗糖添加量对水解液感观评价的影响如图1所示。由图1可知，随着蔗糖添加量增大，水解液甜度太高，综合评分均值降低。蔗糖添加量在1%～3%时综合评分均值较高，因此选定这3个数值作为响应面分析法优化的因素水平。 2.1.2 乳酸菌接种量对水解液感观评价的影响 乳酸菌接种量对水解液感观评价的影响如图2所示。由图2可知，随着乳酸菌接种量增大，水解液酸度太高，综合评分均值降低。乳酸菌接种量在1%～3%时综合评分均值较高，因此选定这3个数值作为响应面分析法优化的因素水平。 2.1.3 发酵温度对水解液感观评价的影响 发酵温度对水解液感观评价的影响如图3所示。由图3可知，随着发酵温度升高，乳酸菌发酵速度加快，发酵效果较好，综合评分均值较高；但当温度超过42 ℃以后，综合评分均值呈下降趋势，可能是发酵温度过高，乳酸菌死亡较多。发酵温度在39、42、44 ℃时综合评分均值较高，因此选定这3个数值为响应面分析法优化的因素水平。 2.1.4 发酵时间对水解液感观评价的影响 发酵时间对水解液感观评价的影响如图4所示。由图4可知，随着发酵时间延长，乳酸菌发酵产酸，改善了水解液风味，综合评分均值增加；但当乳酸菌发酵时间过长，产酸过多，综合评分均值呈下降趋势。发酵时间在32、40、48 h时综合评分均值较高，因此选定这3个数值作为响应面分析法优化的因素水平。 2.2 响应面优化试验结果 以综合感观评价为指标进行Box-Benhnken设计结果见表2所示。利用Design-Expert 7.0软件进行回归分析，得到感观评价均值和各因素变量之间的二元回归方程为：Y=-1 067.803 75+29.760 00×A-11.052 00×B+38.148 29×C+15.737 04× D+0.720 00×A×B-0.503 00×A×C-0.034 687×A×D+0.615 00×B×C+0.116 56×B×D-0.120 87×C×D-2.352 42×A2- 5.377 42×B2-0.393 79×C2-0.125 49×D2。 对回归模型进行方程分析，结果见表3所示。该模型具有统计学意义（P0.05），表明回归方程拟合情况好、误差小，能较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该方程确定最优的工艺流程。从各因素方差分析结果看，对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的感观评价均值影响大小依次顺序为：发酵时间（D）>发酵温度（C）>乳酸菌接种量（B）>蔗糖添加量（A），其中发酵时间（D）和发酵温度（C）对响应值结果影响显著，乳酸菌接种量（B）和蔗糖添加量（A）对响应值结果影响不显著。 各因素响应面曲面分析结果如图5所示。根据所得的模型可预测得到最优的乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的感观评价均值最高的工艺条件为：蔗糖添加量1.80%、乳酸菌接种量1.97%、发酵温度42.23 ℃、发酵时间43.04 h，在该条件下感观评价均值能达到92.08分。分别按上述的最优工艺条件进行3次平行试验，所得的乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的感观评价均值为92.02分，与理论预测值92.08分接近，重复性较好，说明响应面优化所得的工艺条件参数准确、可靠、可行。 3 结论 通过响应面分析法优化了乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的最优工艺流程。结果表明，在最优工艺条件蔗糖添加量1.80%、乳酸菌接种量1.97%、发酵温度42.23 ℃、发酵时间43.04 h下，水解液感观评价均值能达到92.02分，该水解液具有特殊乳酸发酵香味和风味，酸度、甜度适中，口感良好。 参考文献： [1] 朱学伸，甘 泉，肖华党，等.乳酸在生鲜牛肉加工中的应用[J].肉类工业，2012（6）：38-40. [2] 龚钢明，顾 慧，蔡宝国.鱼类加工下脚料的资源化与利用途径[J]. 中国资源综合利用，2003，7（7）：23-24. [3] 卢红梅.鳕鱼下脚料水解液的连续乳酸发酵[J].无锡轻工大学学报，2004，23（6）：103-106. [4] 杨秀坚，罗远洲.水产品乳酸液化试验研究[J].水利渔业，2006， 26（3）：82-83. [5] 段旭昌，徐怀德，李志成，等.乳酸菌发酵法改良甲鱼蛋白酶解液风味的研究[J].中国食品学报，2004，4（4）：39-42. [6] 张晓敏. 带鱼下脚料水解蛋白的制备及其利用研究[D].重庆：西南大学，2008. [7] 裘迪红，周 涛，戴志远.水解鲐鱼蛋白制备浓肽口服液[J].广州食品工业科技，2001，17（1）：72-73. [8] 于晓丹，马 霞，王 可，等.利用响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵培养基[J].中国酿造，2010（11）：132-135. （责任编辑 屠 晶）
摘要：采用乳酸菌（Lactobacillus）发酵鲢鱼（Hypophthaimichthys molitrix）下脚料水解液，通过响应面分析法优化其最佳的工艺条件。结果表明，优工艺条件为蔗糖添加量1.80%、乳酸菌接种量1.97%、发酵温度42.23 ℃、发酵时间43.04 h，水解液感观评价均值能达到92.02分，该水解液具有特殊乳酸发酵香味和风味，酸度、甜度适中，口感良好。 关键词：乳酸菌（Lactobacillus）；发酵；鲢鱼（Hypophthaimichthys molitrix）下脚料；响应面分析法 中图分类号：TQ921+.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4175-04 Optimization of Lactobacillus Fermentation of the Hydrolysates of Silver Carp By-product by Response Surface Methodology JIANG Sheng-tao1，2，LIN Biao-sheng1，CHEN Li-min1，LAI Xue-lian1 （1.Longyan University，Longyan 364000，Fujian，China； 2.Ningde Normal University，Ningde 352100，Fujian，China） Abstract： The Lactobacillus fermentation of the hydrolysates of silver carp by-product was studied and the technological conditions were optimized by response surface methodology. The results indicated that the optimal technological conditions were as follows， sugar concentration 1.80%， seeding amount of Lactobacillus 1.97%， fermented for 43.04 h under 42.23 ℃， the mean value of sensory estimate was reached 92.02， the flavor of the fermentation liquid was best with peat-reek of lactic acid， and the liquid tasted sweet and sour， very delicate. Key words： Lactobacillus； fermentation； silver carp by-product； response surface methodology 收稿日期：2013-01-21 基金项目：福建省教育厅B类龙岩学院校立服务海西项目（JB09209）；2012年福建省“大学生创新创业培训计划”项目 作者简介：江胜滔（1971-），男，福建建瓯人，讲师，硕士，主要从事微生物发酵工程研究，（电话）[1**********]（电子信箱）[email protected]。 乳酸菌（Lactobacillus）是指能发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。乳酸菌能分解食物中的糖类、蛋白质，合成维生素，对脂肪类化合物也有微弱的分解能力，能提高脂肪类食物的消化率，促进其消化吸收[1]。 在鱼类加工过程中会产生大量的下脚料，包括鱼头、鱼尾、鱼骨、鱼鳍等。据报道，这些下脚料占鱼总重的40%～55%[2]。大量的下脚料不仅造成环境的污染，而且其营养价值也未得到充分利用，因此必须加强对下脚料有效利用，提高鱼的附加利用价值。下脚料用清水洗净后剪切成小片后用组织捣碎机捣碎，制备成水解液，经过酸化处理后可以作为肥料或者饲料添加剂。水解液的制备可以采用硫酸等无机酸，也可以采用乳酸等有机酸。利用有机酸降低酸度具有更大的优势，使用时保藏时间较长、无需中和处理，并且能被土壤利用，可提高饲料的营养价值且不破坏土壤[3]。采用乳酸菌发酵鲢鱼（Hypophthaimichthys molitrix）下脚料水解液，不仅能够除去大部分的腥味，赋予水解液特殊的发酵香味，而且还能增加水解液中的其他风味物质，使鲢鱼下脚料水解液的整体风味得到了很大改善[4]。本研究采用乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液，通过响应面分析法优化其发酵工艺条件，为提高鲢鱼等水产品下脚料产品附加值的研究与开发利用提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料 鲢鱼下脚料包括鲢鱼的鱼头、鱼尾、鱼骨、鱼鳍及剩余的鱼肉等均取自龙岩学院校大门对面的某酒店。嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。 嗜热链球菌MRS培养基：葡萄糖5.0 g、牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.05 g、硫酸锰0.2 g、碳酸钙20.0 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.8，固体培养基加20.0 g琼脂。 保加利亚乳杆菌培养基：葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、吐温-80 1.0 mL、醋酸钠5.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.2 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.8，固体培养基加20.0 g琼脂。 1.2 方法 1.2.1 乳酸菌种的活化与培养 将保藏于实验室的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，接种于三角瓶液体培养基中，置于37 ℃培养18～20 h，待用。 1.2.2 乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程 鲢鱼下脚料水解液→装入250 mL三角瓶中→100 ℃水浴锅中杀菌15 min→冷却至40 ℃→加入蔗糖调节→接种乳酸菌（1∶1接种嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌）→恒温发酵→灭活→感观评价 1.2.3 工艺流程中各参数的单因素优化 参照文献[5，6]，对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程各参数进行单因素试验。蔗糖添加量取1%、2%、3%、4%、5%，乳酸菌接种量1%、2%、3%、4%、5%，发酵温度35、37、39、42、44 ℃，发酵时间24、32、40、48、56 h，以水解液感观评价为指标，确定较优的各因素取值范围，用于响应面分析法优化的参数水平。感观评价标准[7]：总分100分，以10个学生打分平均值为准。色泽：色泽均匀一致；气味：有明显的发酵乳香气；滋味：酸甜适中；组织状态：表面光滑，细腻，凝块均匀。 1.2.4 响应面分析法优化乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程 在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用响应面分析法，以感官品质作为评价指标，利用Design-Expert 7.0软件在4因素3水平上对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程中的影响因素蔗糖添加量、乳酸菌接种量、发酵温度、发酵时间进行优化，确定最佳的工艺流程[8]。Box-Benhnken设计的因素与水平见表1。 2 结果与分析 2.1 乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的工艺流程单因素试验结果 2.1.1 蔗糖添加量对水解液感观评价的影响 蔗糖添加量对水解液感观评价的影响如图1所示。由图1可知，随着蔗糖添加量增大，水解液甜度太高，综合评分均值降低。蔗糖添加量在1%～3%时综合评分均值较高，因此选定这3个数值作为响应面分析法优化的因素水平。 2.1.2 乳酸菌接种量对水解液感观评价的影响 乳酸菌接种量对水解液感观评价的影响如图2所示。由图2可知，随着乳酸菌接种量增大，水解液酸度太高，综合评分均值降低。乳酸菌接种量在1%～3%时综合评分均值较高，因此选定这3个数值作为响应面分析法优化的因素水平。 2.1.3 发酵温度对水解液感观评价的影响 发酵温度对水解液感观评价的影响如图3所示。由图3可知，随着发酵温度升高，乳酸菌发酵速度加快，发酵效果较好，综合评分均值较高；但当温度超过42 ℃以后，综合评分均值呈下降趋势，可能是发酵温度过高，乳酸菌死亡较多。发酵温度在39、42、44 ℃时综合评分均值较高，因此选定这3个数值为响应面分析法优化的因素水平。 2.1.4 发酵时间对水解液感观评价的影响 发酵时间对水解液感观评价的影响如图4所示。由图4可知，随着发酵时间延长，乳酸菌发酵产酸，改善了水解液风味，综合评分均值增加；但当乳酸菌发酵时间过长，产酸过多，综合评分均值呈下降趋势。发酵时间在32、40、48 h时综合评分均值较高，因此选定这3个数值作为响应面分析法优化的因素水平。 2.2 响应面优化试验结果 以综合感观评价为指标进行Box-Benhnken设计结果见表2所示。利用Design-Expert 7.0软件进行回归分析，得到感观评价均值和各因素变量之间的二元回归方程为：Y=-1 067.803 75+29.760 00×A-11.052 00×B+38.148 29×C+15.737 04× D+0.720 00×A×B-0.503 00×A×C-0.034 687×A×D+0.615 00×B×C+0.116 56×B×D-0.120 87×C×D-2.352 42×A2- 5.377 42×B2-0.393 79×C2-0.125 49×D2。 对回归模型进行方程分析，结果见表3所示。该模型具有统计学意义（P0.05），表明回归方程拟合情况好、误差小，能较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该方程确定最优的工艺流程。从各因素方差分析结果看，对乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的感观评价均值影响大小依次顺序为：发酵时间（D）>发酵温度（C）>乳酸菌接种量（B）>蔗糖添加量（A），其中发酵时间（D）和发酵温度（C）对响应值结果影响显著，乳酸菌接种量（B）和蔗糖添加量（A）对响应值结果影响不显著。 各因素响应面曲面分析结果如图5所示。根据所得的模型可预测得到最优的乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的感观评价均值最高的工艺条件为：蔗糖添加量1.80%、乳酸菌接种量1.97%、发酵温度42.23 ℃、发酵时间43.04 h，在该条件下感观评价均值能达到92.08分。分别按上述的最优工艺条件进行3次平行试验，所得的乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的感观评价均值为92.02分，与理论预测值92.08分接近，重复性较好，说明响应面优化所得的工艺条件参数准确、可靠、可行。 3 结论 通过响应面分析法优化了乳酸菌发酵鲢鱼下脚料水解液的最优工艺流程。结果表明，在最优工艺条件蔗糖添加量1.80%、乳酸菌接种量1.97%、发酵温度42.23 ℃、发酵时间43.04 h下，水解液感观评价均值能达到92.02分，该水解液具有特殊乳酸发酵香味和风味，酸度、甜度适中，口感良好。 参考文献： [1] 朱学伸，甘 泉，肖华党，等.乳酸在生鲜牛肉加工中的应用[J].肉类工业，2012（6）：38-40. [2] 龚钢明，顾 慧，蔡宝国.鱼类加工下脚料的资源化与利用途径[J]. 中国资源综合利用，2003，7（7）：23-24. [3] 卢红梅.鳕鱼下脚料水解液的连续乳酸发酵[J].无锡轻工大学学报，2004，23（6）：103-106. [4] 杨秀坚，罗远洲.水产品乳酸液化试验研究[J].水利渔业，2006， 26（3）：82-83. [5] 段旭昌，徐怀德，李志成，等.乳酸菌发酵法改良甲鱼蛋白酶解液风味的研究[J].中国食品学报，2004，4（4）：39-42. [6] 张晓敏. 带鱼下脚料水解蛋白的制备及其利用研究[D].重庆：西南大学，2008. [7] 裘迪红，周 涛，戴志远.水解鲐鱼蛋白制备浓肽口服液[J].广州食品工业科技，2001，17（1）：72-73. [8] 于晓丹，马 霞，王 可，等.利用响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵培养基[J].中国酿造，2010（11）：132-135. （责任编辑 屠 晶）