血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展
高血压是世界范围内的重大公共卫生问题，目前全球高血压患者已达18亿，我国高血压患病率2002年为18．8%[1]。抗根据2009年发布的《中国心血管病报告》，我国18岁以上高血压人口估计至少有2亿。已经成为名副其实的高血压人口大国[2]。目前，常用抗高血压药物有利尿剂、钙拮抗剂(CCB)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、β-受体拮抗剂[3]5类。血管紧张素转化酶抑制剂的作用是通过抑制ACE 的活性，使得血管紧张素II 的生成和激肽的破坏均减少，从而达到降低血压的目的。ACE 抑制肽是一类是介于氨基酸与蛋白质之间的生物活性肽，具有安全性高、效果专一无副作用、易被人体消化吸收和稳定性好等优势，易被生产厂家和消费者所接受，具有极好的市场前景。
1.1高血压病
1.1.1高血压病简介
高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症。按照世界卫生组织（WTO ）、国际高血压学会（ISH ）高血压防治指南和中国高血压防治指南[4]，高血压定义为：在18周岁以上成年人，未服抗高血压药物的情况下，收缩压≥140 mmHg和舒张压≥90 mmHg。有关研究表明，引起高血压病的主要因素为肥胖、食盐摄入过量、饮酒、遗传、年龄、性别、工作的紧张度等等[5,6]。由于其病因十分复杂，对高血压的发病机理至今仍未有确切的认识，目前存在的学说主要有：精神、神经学说、肾原学说、心钠素学说、离子学说、胰岛素学说等。
1.1.2高血压病的防治方法
轻度高血压病一般不需要药物治疗，通过改善生活方式来治疗，如限制食盐（
对于较严重的高血压病一般要进行药物治疗，高血压的现代治疗药物主要有六大类，即利尿剂、β受体阻滞剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂
（Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI ）、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB ）及α受体阻滞剂。另外我国也有一些复方制剂及中药制剂在使用。
1.2 降压肽及其作用机制
1.2.1 ACE对血压的调节作用
ACE 是一种金属二肽羧肽酶, 由一个糖蛋白和一条多肽单链复合而成。相对分子质量大约在170 kD左右, 广泛分布于体内各组织中。人体的升压系统肾素血管紧张素系统(renial angioten-sin system,RAS) 和降压系统激肽释放酶激肽系统(kallikrein-kinin system,KKS) 在血压调节及心血管功能方面扮演着重要角色。ACE 通过对RAS 系统和KKS 系统的调控达到调节血压的作用(图1) 。
图1 ACE 在血压调节中的作用
Fig.1 Role of ACE in blood pressure accommodation
在RAS 系统中:血管紧张素原在肾素的作用下水解,C 端失去Leu, 转化为血管紧张素Ⅰ(AngⅠ),Ang Ⅰ在ACE 的作用下水解, C-端失去His-Leu, 转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 。Ang Ⅱ一方面可以使小动脉、血管平滑肌收缩, 增加周边
血管阻力, 引起血压迅速增高; 另一方面能够刺激醛固酮分泌, 促进人体肾脏对Na+、K+的吸收, 减少肾血流量, 引起钠储量和血容量的增加, 导致血压升高。在KKS 系统中:激肽原在激肽释放酶的作用下水解, 转化为缓激肽, 缓激肽可通过
血管内皮细胞释放NO 及合成前列腺素而使血管舒张, 使血压下降。然而在ACE 的作用下, 舒缓激肽C 端失去Phe-Arg, 转化为缓释肽1-7, 失去降压功能, 导致血压升高。因此, 通过抑制ACE, 使Ang Ⅰ无法转化为具有强升压作用的Ang Ⅱ, 同时保持具有血管舒张作用缓激肽的生物活性, 是降压最重要的途径。
1.2.2 ACE抑制肽定量构效关系研究
ACE 包括N 和C 两个同源区域, 每个区域包含一个结合Zn2 +的活性位点,Zn2 +结合位点是ACE 催化反应的活性基团所在部位, 同时Zn2 +、Cl-是维持ACE 活性所必需的。1977年Ondetti 等[8]根据竞争性抑制剂和ACE 活性结合位点的关系建立模型假说, 这个模型成为解释ACE 作用机理的经典模型, 第一个临床口服高效降压药卡托普利就是根据这个原理开发出来的。1982年Cushman 等[9]和Ondetti 等[10]进一步改进此模型。在此基础上, 研究者开发了一系列ACE 抑制剂降压药和食品源保健品。目前国内外批准使用的ACE 抑制剂降压药己有十几种, 还有7种ACE 抑制剂降压药处于临床前和临床Ⅰ、Ⅱ期阶段。
由于人工合成的降压药物在降压的同时产生高血钾症、肾功能可逆性下降、咳嗽和血管水肿等多种副作用, 药食同源的ACE 抑制肽成为降压药物研究的新热点。ACE 抑制肽是一种重要的ACE 抑制剂, 属于竞争性抑制剂, 即它们对ACE 活性区域的亲和力比血管紧张素Ⅰ或舒缓激肽强, 能够与血管紧张素Ⅰ或缓激肽竞争ACE, 与ACE 结合后抑制其活性, 且不易从ACE 结合区释放, 阻碍ACE 催化水解舒缓激肽成为失活片段和ACE 催化Ang Ⅰ向Ang Ⅱ转化的生化反应过程, 起到降压作用。为了开发高效ACE 抑制肽, 在确定ACE 结构和ACE 抑制肽的作用机理后, 人们把研究的重点转向ACE 抑制肽的结构和生物活性的关系。
研究表明,ACE 抑制肽的相对分子质量比较小, 大多数活性肽仅包含2~12个氨基酸残基, 有利于人体直接高效吸收利用。Li 等[11]认为ACE 抑制肽的C 末端三肽的氨基酸种类是影响其活性的重要因素,C 末端三肽含有疏水性氨基酸或芳香族氨基酸的ACE 抑制肽活性更高;Cheung 等[12]发现活性较强的ACE 抑制肽C 端氨基酸一般为具环状结构的芳香族氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等) 或脯氨酸;N 端为长链或具支链的疏水氨基酸(如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等) 或碱性氨基酸可以提高肽的抑制活性, 而N 端为脯氨酸能够降低肽的抑制活性。小肽的构效关系表明C 端含有赖氨酸或精氨酸的ACE 抑制肽活性高, 因为赖氨酸或精
氨酸侧链上的胍或ε-氨基上的正电荷对ACE 抑制活性起着重要作用[11,13]。目前, 对ACE 抑制肽的构效关系的分析还处于初级阶段, 尚需要进一步深入研究。
现有ACE 抑制肽的构效关系大多以定性描述为主，而且大多研究基本上都是围绕肽链长度和氨基酸序列两方面对活性的影响来展开。1977年，Ondett 等［14］在对ACE 的结构进行了深入研究的基础上首次提出了ACE 与底物作用的模型; 随后，Cushman 等［15］和Ondetti 等［16］对该模型进行了补充和完善(见图2) ，指出ACE 活性中心存在S1、S1＇、S2＇三个必需结合位点，均具有较强的疏水性，底物C 末端三肽氨基酸残基或抑制剂的相应基团能分别与ACE 的3个必需结合位点作用; 若底物C 末端倒数第三位为芳香族氨基酸时与活性部位S1亲和力较大; 若倒数第二位为丙氨酸时与部位S1＇亲和力大，而为脯氨酸时较小; 当C 末端为脯氨酸时与S2＇亲和力较大，为谷氨酸时较小。此外，ACE 分子末端带有的正电荷能与底物C 末端氨基酸羧基的负电荷形成离子键; 在部位S1和S1＇之间存在一个Zn2+，能与C 末端第二位肽键的羰基络合，使该羰基更具亲电性而易被水解; 在S1＇和S2＇之间还存在一个活性部位X-H ，它能以氢键形式与底物末端肽键相结合。除了这3个必需结合位点外，ACE 中还存在多个辅助结合位点，它们能与长肽的近N 端氨基酸残基结合从而提高与底物的结合能力。当然，一旦ACE 中的这些活性位点被抑制剂所结合将直接导致酶的失活。在该模型的指导下，人们成功地合成了一系列活性很强的ACE 抑制剂。
随着研究的深入，越来越多的证据表明ACE 抑制肽仅局限于那些相对分子
质量较小的肽(2～15肽) ，且C 末端三肽对ACE 的抑制活性发挥着至关重要的作用，当3个位置都为疏水性氨基酸时有利于与ACE 的竞争性结合［17］。现已发现许多C 末端为芳香族氨基酸(Trp、Tyr 和Phe) 或Pro 而N 末端为支链氨基酸(Val及Ile) 的二肽或三肽具有较强的ACE 抑制活性，如VF(IC50=53μmol/L)、IW(IC
50=2.0μmol/L)、IY(IC50=3.8μmol/L)、IVY(IC50=0.48μmol/L)、IYP(IC50
［14,18,19］=61μmol/L)、VMP(IC50=29μmol/L)等，但C 末端若为二羧基氨基酸(如
Glu) 或Pro 位于C 末端倒数第二位和N 末端时活性很弱，如GE(IC
50=5，400μmol/L)、PG(IC50=17，000μmol/L)等。进一步的研究表明，二肽或三肽的构效关系的结果并不适用于长肽，这从顺次延长短肽的C 端或N 端所引起的活性变化中可以得到证明［20,21］:如在二肽YP(IC50=890μmol/L)的N 端延长肽链得到一系列长肽:LYP(IC50=6.6μmol/L)、GLYP(IC50=190μmol/L)、YGLYP(IC50=260μmol/L)、DYGLYP(IC50=62μmol/L);或从C 端延长三肽IKP(IC50=1.7μmol/L)得到IKPLNY(IC50=43μmol/L)，延长VLP(IC50=320μmol/L)得到VLPIP(IC50=31μmol/L)、VLPIPQ(IC50=5，300μmol/L)，肽链延长后活性并没有一致的变化趋势，由此说明抑制肽与ACE 的作用并不局限于C 末端三肽序列，N 端氨基酸也能影响肽与ACE 的亲合。同时有研究指出，肽C 末端氨基酸
［22，为Arg 或Lys 时，其侧链上的胍基或ε-氨基对ACE 抑制活性也有着很大的贡献
23］，然而也有些肽并不符合这一规律。最近还有研究者［24］发现某些ACE 抑制肽即使不改变其肽链长度和肽链两端的氨基酸序列，仅仅对肽链中间的个别氨基酸加以变动也能导致其活性发生很大的改变; 甚至有些肽与传统的ACE 抑制肽模型完全不符，但也表现出很强的ACE 抑制活性，如Matsui 等用碱性蛋白酶水解沙丁鱼蛋白获得的ACE 抑制肽主要由酸性氨基酸组成，疏水性氨基酸含量却很低。综合以上文献报道发现，目前针对寡肽ACE 抑制活性的定性构效关系的研究并不透彻，特别在解释四肽以上的ACE 抑制肽的活性机理时仍存在很多问题，这有待于进一步的研究。
1.2.3 ACE抑制肽定量构效关系研究
定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Re-lationship，QSAR) 是指在测量或计算得到一系列化合物的特性参数基础上，采用数学方程将这些参数与化合物的生物活性相关联，用以研究、预测化合物的理化性质对其生物活性的影响
［25］。相对于构效关系的定性描述，QSAR 无疑具有量效关系明确、提供信息丰富准确、对未知化合物活性预测能力更强等优点。QSAR 研究最初作为定量药物设计的一个研究分支，是为了适应合理设计生物活性分子的需要而发展起来的。近年来，随着方法学与计算机技术的飞速发展，使得QSAR 研究迅速提高到一个新的水平。鉴于QSAR 研究在活性分子的活性预测及结构设计中的重要作用，目前已被引入到ACE 抑制肽的研究领域。Hellberg S 等［26］对实验测定的20个天然氨基酸的29种物化参数进行主成分分析提取出涉及分子亲水性、立体大小和电荷性质的主要信息，并用Z 标度(Z-scales)进行表征(包含3个Z 值); 其中，Z1主要和氨基酸的亲水性有关，Z2同氨基酸的立体形状大小有关，Z3同氨基酸的电性参数有关。随后将该描述符用于构建58个经典血管紧张素转化酶抑制二肽的QSAR 模型，经过偏最小二乘法(partial leastsquares ，PLS) 分析后得到2个潜隐变量。实验结果证明该模型的拟合和预测能力都较好。不足的是，Z-scales 描述符忽略了多肽类似物的空间构象信息。
Cocchi M 等［27］利用t 分值(t scores) 和PLS 方法得到含1个潜隐变量的58
个ACE 抑制二肽的QSAR 模型，tscores 是20种氨基酸的相互作用能，由6种探针模拟不同官能团相互作用经GRID 程序计算和主成分分析得到，依据侧链电性使氨基酸得到很好的分类，并且体现了肽的三维结构性质。与Z-scales 相比，尽管模型的拟合能力有所下降，但对ACE 抑制肽的QSAR 研究不失为一种新的思路。
Collantes E R等［28］应用分子模拟软件搭建氨基酸的初始结构，然后进行构
象分析、能量优化和量子化学计算得出氨基酸的各向同性表面积(isotropicsurface area ，ISA) 和电荷指数(electronic charge in-dex，ECI) 值。ISA 近似地表示侧链基团的疏水性，同时与氨基酸分子的体积有关;ECI 表示氨基酸侧链基团的极性，同时能反应侧链和受体之间的偶极作用。采用ISA-ECI 描述符和PLS 算法得到含2个潜隐变量的58个ACE 抑制二肽QSAR 模型，效果良好。ISA-ECI 描述符的优点是描述符个数少、来源简单，且它们的计算值均来自氨基酸的三维结构，易于分析与解释多肽的QSAR 模型。ISA-ECI 与Z 标度结构描述符相比，有更大的自由度，并易于扩展到非天然的氨基酸和肽的拟似物。
Zaliani A等[29]在计算机上模建20种天然氨基酸分子，并进行能量优化和量
化计算等，得到一系列MS-WHIM scores(Molecular Surfaces-Weighted Holis-
tic Invariant Molecular)氨基酸结构描述符。第1个指数与静电势有关，体现氨基酸残基电荷的正负性和侧链的芳香族/脂肪族的结构信息; 第2个指数受负静电势的影响; 第3个指数主要与它们的正电性和线性的侧链有关。将该描述符用于58个ACE 抑制二肽QSAR 模型的建立，经PLS 分析后得到含2个潜隐变量的模型，结果表明用MS-WHIM 结构描述符建立的多肽QSAR 模型的预测能力较强，而且该结构描述符既可用于延伸的侧链构象也可用于天然氨基酸的旋转异构体。不足的是，采用MS-WHIM 结构描述符建立的QSAR 模型，表征的物理意义并不明确，无法对影响活性的因素进行准确提炼。李志良[30]等认为在知晓配基与受体相互作用模式前提下可建立一种较可靠的定量构效关系模型，从而克服了传统做法中仅根据样本集分子自身信息来构建预测模型的某些弊端。该思路为采用遗传算法筛选虚拟受体结合靶点及相互作用模式，结合偏最小二乘潜因多元建模技术，通过交互检验均方根误差(RMSCV)作适应度评价函数筛选变化位点和受体残基，完成种群进化以最优个体为最终确定模型，得到一种新颖QSAR 方法，即基于功能肽/蛋白质作用模式的遗传虚拟筛选(GVSPPC)。该法成功解决了大多数情况下受体结构未知而难以了解的配基与之结合方式的难题。运用58个ACE 抑制二肽数据对GVSPPC 加以检验，结果表明GVSPPC 得到了优于大多数传统方法的QSAR 模型结果，重要的是，该模型的物理意义明确，能较好解释配基与受体间的作用机理。由此不难看出，国内外对ACE 抑制肽的定量构效关系研究已进行了多种尝试，但基本都停留在二维定量构效关系研究的层面上，研究的重点也都是基于肽的结构描述与不同的建模方法运用上; 且研究对象仅局限于ACE 抑制二肽，没有建立更长的抑制肽的QSAR 模型。这可能归因于:①对三肽及更长肽的结构描述存在引入变量多，参数处理复杂等问题; ②目前ACE 抑制肽活性值多来源于体外实验，长肽经人体消化后可能会水解为短肽，此时的活性值可能与体外实验有出入; ③长肽在立体空间中存在较大的柔性，同时ACE 结构本身也是三维的，二维定量构效关系研究难以涉及分子空间构象的变化。因此ACE 抑制肽定量构效关系下一步的研究重点应针对长肽分子展开包括三维、四维甚至五维的多维定量构效关系研究，以彻底阐明ACE 抑制肽的作用机制。
参考文献
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1.1.2高血压病的防治方法
轻度高血压病一般不需要药物治疗，通过改善生活方式来治疗，如限制食盐（
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（Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI ）、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB ）及α受体阻滞剂。另外我国也有一些复方制剂及中药制剂在使用。
1.2 降压肽及其作用机制
1.2.1 ACE对血压的调节作用
ACE 是一种金属二肽羧肽酶, 由一个糖蛋白和一条多肽单链复合而成。相对分子质量大约在170 kD左右, 广泛分布于体内各组织中。人体的升压系统肾素血管紧张素系统(renial angioten-sin system,RAS) 和降压系统激肽释放酶激肽系统(kallikrein-kinin system,KKS) 在血压调节及心血管功能方面扮演着重要角色。ACE 通过对RAS 系统和KKS 系统的调控达到调节血压的作用(图1) 。
图1 ACE 在血压调节中的作用
Fig.1 Role of ACE in blood pressure accommodation
在RAS 系统中:血管紧张素原在肾素的作用下水解,C 端失去Leu, 转化为血管紧张素Ⅰ(AngⅠ),Ang Ⅰ在ACE 的作用下水解, C-端失去His-Leu, 转化为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 。Ang Ⅱ一方面可以使小动脉、血管平滑肌收缩, 增加周边
血管阻力, 引起血压迅速增高; 另一方面能够刺激醛固酮分泌, 促进人体肾脏对Na+、K+的吸收, 减少肾血流量, 引起钠储量和血容量的增加, 导致血压升高。在KKS 系统中:激肽原在激肽释放酶的作用下水解, 转化为缓激肽, 缓激肽可通过
血管内皮细胞释放NO 及合成前列腺素而使血管舒张, 使血压下降。然而在ACE 的作用下, 舒缓激肽C 端失去Phe-Arg, 转化为缓释肽1-7, 失去降压功能, 导致血压升高。因此, 通过抑制ACE, 使Ang Ⅰ无法转化为具有强升压作用的Ang Ⅱ, 同时保持具有血管舒张作用缓激肽的生物活性, 是降压最重要的途径。
1.2.2 ACE抑制肽定量构效关系研究
ACE 包括N 和C 两个同源区域, 每个区域包含一个结合Zn2 +的活性位点,Zn2 +结合位点是ACE 催化反应的活性基团所在部位, 同时Zn2 +、Cl-是维持ACE 活性所必需的。1977年Ondetti 等[8]根据竞争性抑制剂和ACE 活性结合位点的关系建立模型假说, 这个模型成为解释ACE 作用机理的经典模型, 第一个临床口服高效降压药卡托普利就是根据这个原理开发出来的。1982年Cushman 等[9]和Ondetti 等[10]进一步改进此模型。在此基础上, 研究者开发了一系列ACE 抑制剂降压药和食品源保健品。目前国内外批准使用的ACE 抑制剂降压药己有十几种, 还有7种ACE 抑制剂降压药处于临床前和临床Ⅰ、Ⅱ期阶段。
由于人工合成的降压药物在降压的同时产生高血钾症、肾功能可逆性下降、咳嗽和血管水肿等多种副作用, 药食同源的ACE 抑制肽成为降压药物研究的新热点。ACE 抑制肽是一种重要的ACE 抑制剂, 属于竞争性抑制剂, 即它们对ACE 活性区域的亲和力比血管紧张素Ⅰ或舒缓激肽强, 能够与血管紧张素Ⅰ或缓激肽竞争ACE, 与ACE 结合后抑制其活性, 且不易从ACE 结合区释放, 阻碍ACE 催化水解舒缓激肽成为失活片段和ACE 催化Ang Ⅰ向Ang Ⅱ转化的生化反应过程, 起到降压作用。为了开发高效ACE 抑制肽, 在确定ACE 结构和ACE 抑制肽的作用机理后, 人们把研究的重点转向ACE 抑制肽的结构和生物活性的关系。
研究表明,ACE 抑制肽的相对分子质量比较小, 大多数活性肽仅包含2~12个氨基酸残基, 有利于人体直接高效吸收利用。Li 等[11]认为ACE 抑制肽的C 末端三肽的氨基酸种类是影响其活性的重要因素,C 末端三肽含有疏水性氨基酸或芳香族氨基酸的ACE 抑制肽活性更高;Cheung 等[12]发现活性较强的ACE 抑制肽C 端氨基酸一般为具环状结构的芳香族氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等) 或脯氨酸;N 端为长链或具支链的疏水氨基酸(如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等) 或碱性氨基酸可以提高肽的抑制活性, 而N 端为脯氨酸能够降低肽的抑制活性。小肽的构效关系表明C 端含有赖氨酸或精氨酸的ACE 抑制肽活性高, 因为赖氨酸或精
氨酸侧链上的胍或ε-氨基上的正电荷对ACE 抑制活性起着重要作用[11,13]。目前, 对ACE 抑制肽的构效关系的分析还处于初级阶段, 尚需要进一步深入研究。
现有ACE 抑制肽的构效关系大多以定性描述为主，而且大多研究基本上都是围绕肽链长度和氨基酸序列两方面对活性的影响来展开。1977年，Ondett 等［14］在对ACE 的结构进行了深入研究的基础上首次提出了ACE 与底物作用的模型; 随后，Cushman 等［15］和Ondetti 等［16］对该模型进行了补充和完善(见图2) ，指出ACE 活性中心存在S1、S1＇、S2＇三个必需结合位点，均具有较强的疏水性，底物C 末端三肽氨基酸残基或抑制剂的相应基团能分别与ACE 的3个必需结合位点作用; 若底物C 末端倒数第三位为芳香族氨基酸时与活性部位S1亲和力较大; 若倒数第二位为丙氨酸时与部位S1＇亲和力大，而为脯氨酸时较小; 当C 末端为脯氨酸时与S2＇亲和力较大，为谷氨酸时较小。此外，ACE 分子末端带有的正电荷能与底物C 末端氨基酸羧基的负电荷形成离子键; 在部位S1和S1＇之间存在一个Zn2+，能与C 末端第二位肽键的羰基络合，使该羰基更具亲电性而易被水解; 在S1＇和S2＇之间还存在一个活性部位X-H ，它能以氢键形式与底物末端肽键相结合。除了这3个必需结合位点外，ACE 中还存在多个辅助结合位点，它们能与长肽的近N 端氨基酸残基结合从而提高与底物的结合能力。当然，一旦ACE 中的这些活性位点被抑制剂所结合将直接导致酶的失活。在该模型的指导下，人们成功地合成了一系列活性很强的ACE 抑制剂。
随着研究的深入，越来越多的证据表明ACE 抑制肽仅局限于那些相对分子
质量较小的肽(2～15肽) ，且C 末端三肽对ACE 的抑制活性发挥着至关重要的作用，当3个位置都为疏水性氨基酸时有利于与ACE 的竞争性结合［17］。现已发现许多C 末端为芳香族氨基酸(Trp、Tyr 和Phe) 或Pro 而N 末端为支链氨基酸(Val及Ile) 的二肽或三肽具有较强的ACE 抑制活性，如VF(IC50=53μmol/L)、IW(IC
50=2.0μmol/L)、IY(IC50=3.8μmol/L)、IVY(IC50=0.48μmol/L)、IYP(IC50
［14,18,19］=61μmol/L)、VMP(IC50=29μmol/L)等，但C 末端若为二羧基氨基酸(如
Glu) 或Pro 位于C 末端倒数第二位和N 末端时活性很弱，如GE(IC
50=5，400μmol/L)、PG(IC50=17，000μmol/L)等。进一步的研究表明，二肽或三肽的构效关系的结果并不适用于长肽，这从顺次延长短肽的C 端或N 端所引起的活性变化中可以得到证明［20,21］:如在二肽YP(IC50=890μmol/L)的N 端延长肽链得到一系列长肽:LYP(IC50=6.6μmol/L)、GLYP(IC50=190μmol/L)、YGLYP(IC50=260μmol/L)、DYGLYP(IC50=62μmol/L);或从C 端延长三肽IKP(IC50=1.7μmol/L)得到IKPLNY(IC50=43μmol/L)，延长VLP(IC50=320μmol/L)得到VLPIP(IC50=31μmol/L)、VLPIPQ(IC50=5，300μmol/L)，肽链延长后活性并没有一致的变化趋势，由此说明抑制肽与ACE 的作用并不局限于C 末端三肽序列，N 端氨基酸也能影响肽与ACE 的亲合。同时有研究指出，肽C 末端氨基酸
［22，为Arg 或Lys 时，其侧链上的胍基或ε-氨基对ACE 抑制活性也有着很大的贡献
23］，然而也有些肽并不符合这一规律。最近还有研究者［24］发现某些ACE 抑制肽即使不改变其肽链长度和肽链两端的氨基酸序列，仅仅对肽链中间的个别氨基酸加以变动也能导致其活性发生很大的改变; 甚至有些肽与传统的ACE 抑制肽模型完全不符，但也表现出很强的ACE 抑制活性，如Matsui 等用碱性蛋白酶水解沙丁鱼蛋白获得的ACE 抑制肽主要由酸性氨基酸组成，疏水性氨基酸含量却很低。综合以上文献报道发现，目前针对寡肽ACE 抑制活性的定性构效关系的研究并不透彻，特别在解释四肽以上的ACE 抑制肽的活性机理时仍存在很多问题，这有待于进一步的研究。
1.2.3 ACE抑制肽定量构效关系研究
定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Re-lationship，QSAR) 是指在测量或计算得到一系列化合物的特性参数基础上，采用数学方程将这些参数与化合物的生物活性相关联，用以研究、预测化合物的理化性质对其生物活性的影响
［25］。相对于构效关系的定性描述，QSAR 无疑具有量效关系明确、提供信息丰富准确、对未知化合物活性预测能力更强等优点。QSAR 研究最初作为定量药物设计的一个研究分支，是为了适应合理设计生物活性分子的需要而发展起来的。近年来，随着方法学与计算机技术的飞速发展，使得QSAR 研究迅速提高到一个新的水平。鉴于QSAR 研究在活性分子的活性预测及结构设计中的重要作用，目前已被引入到ACE 抑制肽的研究领域。Hellberg S 等［26］对实验测定的20个天然氨基酸的29种物化参数进行主成分分析提取出涉及分子亲水性、立体大小和电荷性质的主要信息，并用Z 标度(Z-scales)进行表征(包含3个Z 值); 其中，Z1主要和氨基酸的亲水性有关，Z2同氨基酸的立体形状大小有关，Z3同氨基酸的电性参数有关。随后将该描述符用于构建58个经典血管紧张素转化酶抑制二肽的QSAR 模型，经过偏最小二乘法(partial leastsquares ，PLS) 分析后得到2个潜隐变量。实验结果证明该模型的拟合和预测能力都较好。不足的是，Z-scales 描述符忽略了多肽类似物的空间构象信息。
Cocchi M 等［27］利用t 分值(t scores) 和PLS 方法得到含1个潜隐变量的58
个ACE 抑制二肽的QSAR 模型，tscores 是20种氨基酸的相互作用能，由6种探针模拟不同官能团相互作用经GRID 程序计算和主成分分析得到，依据侧链电性使氨基酸得到很好的分类，并且体现了肽的三维结构性质。与Z-scales 相比，尽管模型的拟合能力有所下降，但对ACE 抑制肽的QSAR 研究不失为一种新的思路。
Collantes E R等［28］应用分子模拟软件搭建氨基酸的初始结构，然后进行构
象分析、能量优化和量子化学计算得出氨基酸的各向同性表面积(isotropicsurface area ，ISA) 和电荷指数(electronic charge in-dex，ECI) 值。ISA 近似地表示侧链基团的疏水性，同时与氨基酸分子的体积有关;ECI 表示氨基酸侧链基团的极性，同时能反应侧链和受体之间的偶极作用。采用ISA-ECI 描述符和PLS 算法得到含2个潜隐变量的58个ACE 抑制二肽QSAR 模型，效果良好。ISA-ECI 描述符的优点是描述符个数少、来源简单，且它们的计算值均来自氨基酸的三维结构，易于分析与解释多肽的QSAR 模型。ISA-ECI 与Z 标度结构描述符相比，有更大的自由度，并易于扩展到非天然的氨基酸和肽的拟似物。
Zaliani A等[29]在计算机上模建20种天然氨基酸分子，并进行能量优化和量
化计算等，得到一系列MS-WHIM scores(Molecular Surfaces-Weighted Holis-
tic Invariant Molecular)氨基酸结构描述符。第1个指数与静电势有关，体现氨基酸残基电荷的正负性和侧链的芳香族/脂肪族的结构信息; 第2个指数受负静电势的影响; 第3个指数主要与它们的正电性和线性的侧链有关。将该描述符用于58个ACE 抑制二肽QSAR 模型的建立，经PLS 分析后得到含2个潜隐变量的模型，结果表明用MS-WHIM 结构描述符建立的多肽QSAR 模型的预测能力较强，而且该结构描述符既可用于延伸的侧链构象也可用于天然氨基酸的旋转异构体。不足的是，采用MS-WHIM 结构描述符建立的QSAR 模型，表征的物理意义并不明确，无法对影响活性的因素进行准确提炼。李志良[30]等认为在知晓配基与受体相互作用模式前提下可建立一种较可靠的定量构效关系模型，从而克服了传统做法中仅根据样本集分子自身信息来构建预测模型的某些弊端。该思路为采用遗传算法筛选虚拟受体结合靶点及相互作用模式，结合偏最小二乘潜因多元建模技术，通过交互检验均方根误差(RMSCV)作适应度评价函数筛选变化位点和受体残基，完成种群进化以最优个体为最终确定模型，得到一种新颖QSAR 方法，即基于功能肽/蛋白质作用模式的遗传虚拟筛选(GVSPPC)。该法成功解决了大多数情况下受体结构未知而难以了解的配基与之结合方式的难题。运用58个ACE 抑制二肽数据对GVSPPC 加以检验，结果表明GVSPPC 得到了优于大多数传统方法的QSAR 模型结果，重要的是，该模型的物理意义明确，能较好解释配基与受体间的作用机理。由此不难看出，国内外对ACE 抑制肽的定量构效关系研究已进行了多种尝试，但基本都停留在二维定量构效关系研究的层面上，研究的重点也都是基于肽的结构描述与不同的建模方法运用上; 且研究对象仅局限于ACE 抑制二肽，没有建立更长的抑制肽的QSAR 模型。这可能归因于:①对三肽及更长肽的结构描述存在引入变量多，参数处理复杂等问题; ②目前ACE 抑制肽活性值多来源于体外实验，长肽经人体消化后可能会水解为短肽，此时的活性值可能与体外实验有出入; ③长肽在立体空间中存在较大的柔性，同时ACE 结构本身也是三维的，二维定量构效关系研究难以涉及分子空间构象的变化。因此ACE 抑制肽定量构效关系下一步的研究重点应针对长肽分子展开包括三维、四维甚至五维的多维定量构效关系研究，以彻底阐明ACE 抑制肽的作用机制。
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