实验五：蛋黄中卵磷脂的提取、纯化与鉴定
一、实验目的
⏹ 掌握从鲜鸡蛋中提取卵磷脂的方法与原理。
⏹ 卵磷脂鉴定的方法与原理。
⏹ 加深了解磷脂类物质的结构和性质。
二、实验内容
磷脂是一类含有磷酸的脂类，机体中主要含有两大类磷脂，由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂（phosphoglyceride ）；由神经鞘氨醇构成的磷脂，称为鞘磷脂（sphingolipid ）。其结构具有由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）构成的亲水头（hydrophilic head）和由脂肪酸链构成的疏水尾（hydrophobic tail ）。在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧。磷脂是重要的两亲物质，它们是生物膜的重要组分、乳化剂和表面活性剂。 磷脂依照氨基醇的不同可分：（1）磷脂酰胆碱（卵磷脂）（PC ），分布：植物主要有大豆等，动物主要有脑、精液、肾上腺、红细胞，蛋卵黄（8-10%）。其主要作用是控制肝脂代谢，防止脂肪肝的形成；（2）、磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）（PE ），参与血液凝结；（3）、磷脂酰丝氨酸（PS ）；（4）、 磷脂酰肌醇（PI ）；（5）、 磷脂酰甘油（PG ）；（6）、二磷脂酰甘油（心磷脂）。
蛋黄磷脂属动物胚胎磷脂，含有大量的胆固醇和甘油三酯及许多人体不可缺少的营养物质和微量元素。卵磷脂是生命的基础物质，人类生命自始至终都离不开它的滋养和保护。卵磷脂存在于每个细胞之中，更多的是集中在脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官。卵磷脂也被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒，这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用，而不会使血浆中的胆固醇增加。
三、实验原理、方法和手段
原理一：卵磷脂是生物体组织细胞的重要成分，主要存在于大豆等植物组织以及动物的肝、脑、脾、心、卵等组织中，尤其在蛋黄中含量较多(10%左右) 。卵磷脂和脑磷脂均溶于乙醚而不溶于丙酮，利用此性质可将其与中性脂肪分离开；卵磷脂能溶于乙醇而脑磷脂不溶，利用此性质又可将卵磷脂和脑磷脂分离。
原理二：卵磷脂为白色，当与空气接触后，其所含不饱和脂肪酸会被氧化而使卵磷脂呈黄褐色。卵磷脂被碱水解后可分解为脂肪酸盐、甘油、胆碱和磷酸盐。甘油与硫酸氢钾共热，可生成具有特殊臭味的丙烯醛；磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵作用，生成黄色的磷钼酸沉淀；胆碱在碱的进一步作用下生成无色且具有氨和鱼腥气味的三甲胺。这样通过对分解产物的检验可以对卵磷脂进行鉴定。
四、实验组织运行要求
根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
五、实验条件
1、实验材料：鲜鸡蛋
2、仪器与器皿：蛋清分离器、恒温水浴锅、蒸发皿（每组一个）、漏斗（每组一个）、铁架台、磁力搅拌器（每组一个）、天平、25mL 量筒（每组一个）、100mL 量筒（每组一个）、干燥试管（每组四支）、玻棒2支、小烧杯大小各2个。
3、试剂：95％乙醇（每组50mL ）、乙醚（每组20mL ）、丙酮（每组30mL ）、ZnCl 2、无水乙醇（每组40mL ）、滤纸（2张）、10%氢氧化钠（每组30mL ）、3% 溴的四氯化碳溶液（每组10mL ）、红色石蕊试纸（每组二张）、3%溴的四氯化碳溶液（每组10mL ）、硫酸氢钾（每组10mL ）、钼酸铵溶液（每组10mL, 钼酸铵试剂将6g 钼酸铵溶于15mL 蒸馏水中，加入5mL 浓氨水，另外将24mL 浓硝酸溶于46mL 的蒸馏水中，两者混合静置一天后再用。）。
六、实验步骤
1）、卵磷脂的提取
方法一、蛋黄10g 放入洁净的带塞三角瓶中，加入95%乙醇40ml ，搅拌15min 后，静置15min ；然后加入10ml 的乙醚，搅拌15 min后，静置15min ；过滤；滤渣进行二次提取，加入乙醇与乙醚(体积比为3：1) 的混合液30ml ，搅拌、静置一定时间；第二次过滤，合并二次滤液，加热浓缩至少量，加入一定量丙酮除杂，卵磷脂即沉淀出来，即得到卵磷脂粗品。
方法二、称取10g 蛋黄于小烧杯中，加入温热的95%乙醇30mL ，边加边搅拌均匀，冷却后过滤。如滤液仍然混浊，可再次过滤至滤液透明。将滤液置于蒸发皿内，于水浴锅中蒸干（或用加热套蒸干，温度可设140℃左右），所得干物即为卵磷脂。
（为了减少或尽可能不用乙醚，实验采用方法二）
2）、卵磷脂的纯化
取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl 2水溶液，室温搅拌0.5h ；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌1h ，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。
3）、卵磷脂的溶解性试验
卵磷脂的溶解性：取干燥试管，加入少许卵磷脂，再加入5mL 乙醚，用玻棒搅动使卵磷脂溶解，逐滴加入丙酮3～5mL ，观察实验现象。
4）、卵磷脂的鉴定
4.1 三甲胺的检验
取干燥试管一支，加入少量提取的卵磷脂以及2～5mL 10%氢氧化钠溶液，放入水浴中加热15min ，在管口放一片红色石蕊试纸，观察颜色有无变化，并嗅其气味。将加热过的溶
液过滤，滤液供下面检验。
4.2 不饱和性检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液，再加入1～2滴3% 溴的四氯化碳溶液，振摇试管，观察有何现象产生。
4.3 磷酸的检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液和5～10滴95%乙醇溶液，然后再加入5~10滴钼酸铵试剂，观察现象；最后将试管放入热水浴中加热5～10min ，观察有何变化。
4.4 甘油的检验
取干净试管一支，加入少许卵磷脂和0.2g 硫酸氢钾，用试管夹夹住并先在小火上略微加热，使卵磷脂和硫酸氢钾混熔，然后再集中加热，待有水蒸气放出时，嗅有何气味产生。
七、思考题与作业
1) 卵磷酯的用途？
2）医药工业中制备卵磷酯的方法？
3）本实验有哪些步骤可以改进？
4）文字与照片记录实验过程的重要性？
5）通风橱的重要性？（可以不作答）
八、实验报告
按规范格式写出实验报告（实验顺序、名称、姓名、学号、实验目的、原理、步骤、实验结果与记录、思考题、注意事项）
记录本实验实验条件、过程和实验现象。
九、注意事项
1）注意安全：本实验中的乙醚、丙酮及乙醇均为易燃药品。氯化锌具腐蚀性。
2）实验过程要细致，培养耐心。
实验五：蛋黄中卵磷脂的提取、纯化与鉴定
一、实验目的
⏹ 掌握从鲜鸡蛋中提取卵磷脂的方法与原理。
⏹ 卵磷脂鉴定的方法与原理。
⏹ 加深了解磷脂类物质的结构和性质。
二、实验内容
磷脂是一类含有磷酸的脂类，机体中主要含有两大类磷脂，由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂（phosphoglyceride ）；由神经鞘氨醇构成的磷脂，称为鞘磷脂（sphingolipid ）。其结构具有由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）构成的亲水头（hydrophilic head）和由脂肪酸链构成的疏水尾（hydrophobic tail ）。在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧。磷脂是重要的两亲物质，它们是生物膜的重要组分、乳化剂和表面活性剂。 磷脂依照氨基醇的不同可分：（1）磷脂酰胆碱（卵磷脂）（PC ），分布：植物主要有大豆等，动物主要有脑、精液、肾上腺、红细胞，蛋卵黄（8-10%）。其主要作用是控制肝脂代谢，防止脂肪肝的形成；（2）、磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）（PE ），参与血液凝结；（3）、磷脂酰丝氨酸（PS ）；（4）、 磷脂酰肌醇（PI ）；（5）、 磷脂酰甘油（PG ）；（6）、二磷脂酰甘油（心磷脂）。
蛋黄磷脂属动物胚胎磷脂，含有大量的胆固醇和甘油三酯及许多人体不可缺少的营养物质和微量元素。卵磷脂是生命的基础物质，人类生命自始至终都离不开它的滋养和保护。卵磷脂存在于每个细胞之中，更多的是集中在脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官。卵磷脂也被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒，这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用，而不会使血浆中的胆固醇增加。
三、实验原理、方法和手段
原理一：卵磷脂是生物体组织细胞的重要成分，主要存在于大豆等植物组织以及动物的肝、脑、脾、心、卵等组织中，尤其在蛋黄中含量较多(10%左右) 。卵磷脂和脑磷脂均溶于乙醚而不溶于丙酮，利用此性质可将其与中性脂肪分离开；卵磷脂能溶于乙醇而脑磷脂不溶，利用此性质又可将卵磷脂和脑磷脂分离。
原理二：卵磷脂为白色，当与空气接触后，其所含不饱和脂肪酸会被氧化而使卵磷脂呈黄褐色。卵磷脂被碱水解后可分解为脂肪酸盐、甘油、胆碱和磷酸盐。甘油与硫酸氢钾共热，可生成具有特殊臭味的丙烯醛；磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵作用，生成黄色的磷钼酸沉淀；胆碱在碱的进一步作用下生成无色且具有氨和鱼腥气味的三甲胺。这样通过对分解产物的检验可以对卵磷脂进行鉴定。
四、实验组织运行要求
根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
五、实验条件
1、实验材料：鲜鸡蛋
2、仪器与器皿：蛋清分离器、恒温水浴锅、蒸发皿（每组一个）、漏斗（每组一个）、铁架台、磁力搅拌器（每组一个）、天平、25mL 量筒（每组一个）、100mL 量筒（每组一个）、干燥试管（每组四支）、玻棒2支、小烧杯大小各2个。
3、试剂：95％乙醇（每组50mL ）、乙醚（每组20mL ）、丙酮（每组30mL ）、ZnCl 2、无水乙醇（每组40mL ）、滤纸（2张）、10%氢氧化钠（每组30mL ）、3% 溴的四氯化碳溶液（每组10mL ）、红色石蕊试纸（每组二张）、3%溴的四氯化碳溶液（每组10mL ）、硫酸氢钾（每组10mL ）、钼酸铵溶液（每组10mL, 钼酸铵试剂将6g 钼酸铵溶于15mL 蒸馏水中，加入5mL 浓氨水，另外将24mL 浓硝酸溶于46mL 的蒸馏水中，两者混合静置一天后再用。）。
六、实验步骤
1）、卵磷脂的提取
方法一、蛋黄10g 放入洁净的带塞三角瓶中，加入95%乙醇40ml ，搅拌15min 后，静置15min ；然后加入10ml 的乙醚，搅拌15 min后，静置15min ；过滤；滤渣进行二次提取，加入乙醇与乙醚(体积比为3：1) 的混合液30ml ，搅拌、静置一定时间；第二次过滤，合并二次滤液，加热浓缩至少量，加入一定量丙酮除杂，卵磷脂即沉淀出来，即得到卵磷脂粗品。
方法二、称取10g 蛋黄于小烧杯中，加入温热的95%乙醇30mL ，边加边搅拌均匀，冷却后过滤。如滤液仍然混浊，可再次过滤至滤液透明。将滤液置于蒸发皿内，于水浴锅中蒸干（或用加热套蒸干，温度可设140℃左右），所得干物即为卵磷脂。
（为了减少或尽可能不用乙醚，实验采用方法二）
2）、卵磷脂的纯化
取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl 2水溶液，室温搅拌0.5h ；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌1h ，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。
3）、卵磷脂的溶解性试验
卵磷脂的溶解性：取干燥试管，加入少许卵磷脂，再加入5mL 乙醚，用玻棒搅动使卵磷脂溶解，逐滴加入丙酮3～5mL ，观察实验现象。
4）、卵磷脂的鉴定
4.1 三甲胺的检验
取干燥试管一支，加入少量提取的卵磷脂以及2～5mL 10%氢氧化钠溶液，放入水浴中加热15min ，在管口放一片红色石蕊试纸，观察颜色有无变化，并嗅其气味。将加热过的溶
液过滤，滤液供下面检验。
4.2 不饱和性检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液，再加入1～2滴3% 溴的四氯化碳溶液，振摇试管，观察有何现象产生。
4.3 磷酸的检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液和5～10滴95%乙醇溶液，然后再加入5~10滴钼酸铵试剂，观察现象；最后将试管放入热水浴中加热5～10min ，观察有何变化。
4.4 甘油的检验
取干净试管一支，加入少许卵磷脂和0.2g 硫酸氢钾，用试管夹夹住并先在小火上略微加热，使卵磷脂和硫酸氢钾混熔，然后再集中加热，待有水蒸气放出时，嗅有何气味产生。
七、思考题与作业
1) 卵磷酯的用途？
2）医药工业中制备卵磷酯的方法？
3）本实验有哪些步骤可以改进？
4）文字与照片记录实验过程的重要性？
5）通风橱的重要性？（可以不作答）
八、实验报告
按规范格式写出实验报告（实验顺序、名称、姓名、学号、实验目的、原理、步骤、实验结果与记录、思考题、注意事项）
记录本实验实验条件、过程和实验现象。
九、注意事项
1）注意安全：本实验中的乙醚、丙酮及乙醇均为易燃药品。氯化锌具腐蚀性。
2）实验过程要细致，培养耐心。