·1582·现代中西医结合杂志Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2010May , 19(13)
水蛭的抗凝血作用研究
瞿新艳
(江苏省靖江市人民医院, 江苏靖江214500
)
[摘要] 目的 研究水蛭的抗凝血作用。方法 观察水蛭提取物对小鼠凝血、出血时间和家兔离体血浆复钙时间的影响, 测定提取物中游离氨基酸的量。结果 水蛭提取物能延长小鼠凝血、出血时间和家兔离体血浆复钙时间。游离氨基酸测定结果表明, 提取物中含有丰富的氨基酸。结论 水蛭提取物所含的游离氨基酸可能是其抗凝血作用的有效成分。
[关键词] 水蛭; 抗凝血作用; 氨基酸
[中图分类号] R0937. 2 [文献标识码] A [文章编号] 1008-8849(2010) 13-1582-02
Study on anti -throm bin function of medicinal leech
Q u Xiny an
(The People ' s Hospital of Jingjiang , Jingjiang 214500, Jiangsu , China )
Abstract :Objective It is to study the anti -thrombin effect of medicinal leech . Methods T he effect of medicinal leech ex -traction o n clotting time and bleeding time of mice and plasm recalcifica tio n time of rabbits in vitro were o vserced , and the quantity of free amino acid in the ex tration were determined . Results Ex tration of medicinal leech could increased clo tting time and bleeding time in mice and plasm recalcification time of rabbits in vitro . T he results of free aminoacid determination thowed that there w as affluent aminoacid in the ex tration . C onclusion Free aminoacid in medicinal leech may be its effective ing redient w hich has anti -thrombin function .
Key words :leech ; anti -thrombin ; aminoacid
宽体金线蛭Whitmania pigra W hitman (又名蚂蟥) 为蚂蟥属Whitmania 动物, 是民间水蛭品种之一, 分布于河北、山东、安徽、江苏、江西、湖北、湖南等地, 药用部位为干燥虫体, 具有活血化瘀的功效。目前已知水蛭中的抗凝成分主要为一些小分子肽类, 其中以欧洲医用水蛭中所含有的水蛭素研究最为透彻。但是, 我国广泛分布的2种不吸血的水蛭宽体金线蛭和柳叶蚂蟥W . acranulata , 其活性成分研究一直未见报道, 尤其是作为我国水蛭商品主流的宽体金线蛭, 其活性成分目前仍不清楚, 其干燥虫体入药的作用机制更是未知。笔者认为水蛭提取物的有效成分可能是降解产物或小分子化合物, 所以本实验对水蛭提取物的抗凝血活性和游离氨基酸的量进行了研究。1 实验资料
1. 1 仪器 日立835型氨基酸自动分析仪(日本) , 离心机(白洋离心机厂) 。
1. 2 药品与试剂 水蛭由湖南省长沙药材公司提供, 经鉴定为宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman 的干燥体; 氯化钙为上海通亚精细化工厂生产; 枸橼酸钠为北京化工厂生产; 阿司匹林为北京双桥制药公司生产。
1. 3 实验动物 ICR 雄性小鼠50只, 体质量18～20g ; 家兔1只, 体质量2. 4kg 。均由北京大学医学部实验中心提供。
[作者简介] 瞿新艳(1975—), 女, 中药师, 主要从事药剂科工作及中药学研究。
1. 4 水蛭提取物的制备 宽体金线蛭加20倍量水浸泡12h , 煎煮2次(2h 和1. 5h ) , 减压浓缩, 浓缩液加石油醚萃取3次, 水相经离心(4000r /min ) 20min 后浓缩至浸膏, 浸膏加95%乙醇加热回流提取, 滤过, 回收乙醇得醇溶部分。1. 5 水蛭提取物对小鼠凝血时间的影响 ICR 小鼠40只, 随机分为给药组和对照组, 以人20g /d 生药量折算[1], 分别腹腔注射水蛭提取物(0. 30, 0. 55, 1. 10g /kg ) 和等体积蒸馏水, 连续给药3d , 于末次给药75min 后用毛细玻管法测定凝血时间。
1. 6 水蛭提取物对小鼠出血时间的影响 ICR 小鼠30只, 随机分为给药组、阿司匹林组和对照组, 分别给予水蛭提取物(0. 55g /kg ) 、阿司匹林羧甲基纤维素混悬液(10mg /kg ) 和等体积蒸馏水, 连续给药3d 。参照文献[2]方法, 将小鼠置于固定器中, 使其尾部垂直, 末次给药后75min , 在距尾尖5mm 处剪断, 从血自行流出后计时, 每隔30s 用滤纸吸去血, 直至滤纸吸时无血(血液自然停止) 即为出血时间。
1. 7 水蛭提取物对家兔血浆复钙时间的影响 家兔静脉取血4. 5mL , 迅速加入装有38g /L 枸橼酸钠抗凝剂0. 5mL 的离心管中, 混匀后离心(1000r /min ) 10min , 分离血浆置冰浴备用。取试管5支, 每管加入血浆和生理盐水各0. 1m L , 随即放入37℃水浴温育1min , 然后各加入2. 8g /L CaCl 2溶液0. 1mL , 混匀, 加入时开动秒表, 每隔10s 缓慢倾斜试管1次。记录自加入CaCl 2至纤维蛋白形成, 即液面不动所需时, 。
现代中西医结合杂志Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2010May , 19(13) 成不同质量浓度的水蛭提取物0. 1mL , 按相同方法求出提取物组血浆复钙时间。
1. 8 水蛭提取物中游离氨基酸测定
1. 8. 1 样品液的制备 取水蛭提取物干燥, 精密称量, 定容至1mL 。再将样品溶液和磺基水杨酸以1∶1混匀, 离心(10000r /min ) 15min , 取上清液直接上机测试。
1. 8. 2 样品测定 采用日立835型氨基酸自动分析仪, 分析柱为2. 6mm ×150mm 不锈钢柱, 2619型磺酸型的强酸性阳离子交换树脂(日立株式会社) , 柱温53℃,体积流量0. 225m L /min , 压力80～130kg /cm 2, 循环时间70min ; 茚三酮体积流量0. 3m L /min , 压力15～35kg /cm 2。缓冲液改变次数5, 标准浓度3nmol /L , 氮气压力0. 28kg /cm 2。2 结 果
2. 1 水蛭提取物对小鼠凝血时间的影响 水蛭提取物0. 30, 0. 55, 1. 10g /kg 剂量组凝血时间分别为(119±5) s 、(137±6) s 、(148±9) s 、(101±3) s , 水蛭提取物各组与对照组比较均有显著性差异(P 均
2. 2 水蛭提取物对小鼠出血时间的影响 水蛭提取物组、阿司匹林组和对照组出血时间分别为(12. 3±2. 1) min 、(7. 8±2. 4) min 和(5. 7±1. 9) min , 前2组与对照组比较均有显著性差异(P 均
2. 3 水蛭提取物对家兔离体血浆复钙时间的影响 水蛭提取物能明显延长家兔离体血浆复钙时间, 并随着其质量浓度的升高而呈现明显的量效关系, 见表1。
表1 各组家兔离体血浆复钙时间比较(x ±s , n =10)
组别
剂量/(g /L )
20
水蛭提取物组
4080
对照组
-血浆复钙时间/s
121±8292±12①392±13①112±5
·1583·
表2 水蛭提取物中游离氨基酸成分分析
氨基酸丝氨酸谷氨酸缬氨酸苯丙氨酸赖氨酸色氨酸异亮氨基酸组氨酸甘氨酸蛋氨酸
质量分数/%
0. 8420. 5621. 401. 751. 510. 2112. 420. 3420. 6150. 766
氨基酸精氨酸脯氨酸丙氨酸牛磺酸天冬氨酸γ-氨基丁酸亮氨酸酪氨酸苏氨酸总氨基酸
质量分数/%
0. 9121. 273. 30. 380. 1730. 1964. 920. 3391. 0923
重高血压病[4]; 苯丙氨酸能预防某些有高血压病家族史“易感者”发病, 降低心血管疾病的发病率, 还可对抗自由基, 防治缺血-再灌注损伤[5]; 精氨酸是人体半必需氨基酸, 可通过L -Ag r -NO 途径扩张血管、抑制血小板聚集, 减少氧自由基损伤, 用于治疗缺血性心脏病、高血压、肺动脉高压症、动脉粥样硬化等疾病[6]。
综上所述, 本研究的起始材料为水蛭的干燥药材, 与以往文献报道中所用的新鲜水蛭或唾液不同, 这说明水蛭中所含的抗凝血物质不一定只存在于新鲜唾液中, 而应该是体内本身所含有的, 并且其性质应该相对比较稳定, 这样才能在经过干燥和长期的储存后保持良好活性。推测水蛭提取物中所含有的游离氨基酸可能是水蛭抗凝血作用的主要有效成分。本实验所用的不含活性纤溶酶的提取物具有抗凝血活性, 且含有丰富的游离氨基酸, 所以推断其氨基酸可能是临床上实际发挥抗凝血疗效的物质。
[
参
考
文
献]
[1] Chen XD , Tian DF , Liu HP , et al . An Investigation to the effect to
Pheretima decoction on bleeding time and blood cl otting tim e in healthy young people [J ]. J Tradit Chin M ed Univ Hunnan , 2003, 23(2) :10-11
[2] Tang SS , Teng D , W ang XH . Pharmacodynamics of Agacutin :a
thrombin -lkie enz yme from Agkistrodon acutus [J ]. Acta Acad M ed Xuzhou , 2005, 25(4) :308-312
[3] Lin YZ , Lin XY , Wan FD , et al . The preparation and biological ac -tivity of hydrol ysate of sw ine brain [J ]. Amino Acids Biotic Re -sou r , 1999, 21(3) :5-8
[4] Tian JB , Jia XB , Yang ZH , et al . Application , production and mar -ket expectation of L -Lys ine [J ]. Amino Acids Biotic Res our , 2004, 26(1) :44-46
[5] Peng KY , J in XR . Effects of cysteine and phenylalanine on pul -monary circulation and cerebral blood flow in chronic hypoxic rats [J ]. Chin J Appl Physiol , 1996, 12(2) :153-156
[6] Zhang JF , Gao LR , Lin QH . Effects of treatment of cardiovascul ar
diseases [J ]. J Cardiovas c Pulmon Dis , 1994, 13(2) :125-127
[收稿日期] 2009-11-10
注:①与对照组比较, P
2. 4 水蛭提取物中游离氨基酸成分分析 水蛭提取物含有19种游离氨基酸, 其中有人体所必需的8种氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸) , 游离氨基酸总量占提取物的23%。见表2。3 讨 论
本实验结果表明, 水蛭提取物可明显延长小鼠凝血、出血时间及家兔离体血浆复钙时间, 提示水蛭提取物能抑制内源性凝血系统, 具有抗凝血作用。水蛭提取物含有19种游离氨基酸, 总量占23%。游离的谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、和组氨酸或是神经递质或是递质的前体物质, 且质量分数最高的几种氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脑内的能源物质, 上述物质易通过血脑屏障, 具有促进神经细胞更新、调节神经递质代谢、维护神经功能及抗脑组织缺氧等作用。另外量较高的苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸在心血管方面也有重要的作用[3], 赖氨酸是优良的血栓预防剂, 与蛋氨酸合用能抑制
·1582·现代中西医结合杂志Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2010May , 19(13)
水蛭的抗凝血作用研究
瞿新艳
(江苏省靖江市人民医院, 江苏靖江214500
)
[摘要] 目的 研究水蛭的抗凝血作用。方法 观察水蛭提取物对小鼠凝血、出血时间和家兔离体血浆复钙时间的影响, 测定提取物中游离氨基酸的量。结果 水蛭提取物能延长小鼠凝血、出血时间和家兔离体血浆复钙时间。游离氨基酸测定结果表明, 提取物中含有丰富的氨基酸。结论 水蛭提取物所含的游离氨基酸可能是其抗凝血作用的有效成分。
[关键词] 水蛭; 抗凝血作用; 氨基酸
[中图分类号] R0937. 2 [文献标识码] A [文章编号] 1008-8849(2010) 13-1582-02
Study on anti -throm bin function of medicinal leech
Q u Xiny an
(The People ' s Hospital of Jingjiang , Jingjiang 214500, Jiangsu , China )
Abstract :Objective It is to study the anti -thrombin effect of medicinal leech . Methods T he effect of medicinal leech ex -traction o n clotting time and bleeding time of mice and plasm recalcifica tio n time of rabbits in vitro were o vserced , and the quantity of free amino acid in the ex tration were determined . Results Ex tration of medicinal leech could increased clo tting time and bleeding time in mice and plasm recalcification time of rabbits in vitro . T he results of free aminoacid determination thowed that there w as affluent aminoacid in the ex tration . C onclusion Free aminoacid in medicinal leech may be its effective ing redient w hich has anti -thrombin function .
Key words :leech ; anti -thrombin ; aminoacid
宽体金线蛭Whitmania pigra W hitman (又名蚂蟥) 为蚂蟥属Whitmania 动物, 是民间水蛭品种之一, 分布于河北、山东、安徽、江苏、江西、湖北、湖南等地, 药用部位为干燥虫体, 具有活血化瘀的功效。目前已知水蛭中的抗凝成分主要为一些小分子肽类, 其中以欧洲医用水蛭中所含有的水蛭素研究最为透彻。但是, 我国广泛分布的2种不吸血的水蛭宽体金线蛭和柳叶蚂蟥W . acranulata , 其活性成分研究一直未见报道, 尤其是作为我国水蛭商品主流的宽体金线蛭, 其活性成分目前仍不清楚, 其干燥虫体入药的作用机制更是未知。笔者认为水蛭提取物的有效成分可能是降解产物或小分子化合物, 所以本实验对水蛭提取物的抗凝血活性和游离氨基酸的量进行了研究。1 实验资料
1. 1 仪器 日立835型氨基酸自动分析仪(日本) , 离心机(白洋离心机厂) 。
1. 2 药品与试剂 水蛭由湖南省长沙药材公司提供, 经鉴定为宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman 的干燥体; 氯化钙为上海通亚精细化工厂生产; 枸橼酸钠为北京化工厂生产; 阿司匹林为北京双桥制药公司生产。
1. 3 实验动物 ICR 雄性小鼠50只, 体质量18～20g ; 家兔1只, 体质量2. 4kg 。均由北京大学医学部实验中心提供。
[作者简介] 瞿新艳(1975—), 女, 中药师, 主要从事药剂科工作及中药学研究。
1. 4 水蛭提取物的制备 宽体金线蛭加20倍量水浸泡12h , 煎煮2次(2h 和1. 5h ) , 减压浓缩, 浓缩液加石油醚萃取3次, 水相经离心(4000r /min ) 20min 后浓缩至浸膏, 浸膏加95%乙醇加热回流提取, 滤过, 回收乙醇得醇溶部分。1. 5 水蛭提取物对小鼠凝血时间的影响 ICR 小鼠40只, 随机分为给药组和对照组, 以人20g /d 生药量折算[1], 分别腹腔注射水蛭提取物(0. 30, 0. 55, 1. 10g /kg ) 和等体积蒸馏水, 连续给药3d , 于末次给药75min 后用毛细玻管法测定凝血时间。
1. 6 水蛭提取物对小鼠出血时间的影响 ICR 小鼠30只, 随机分为给药组、阿司匹林组和对照组, 分别给予水蛭提取物(0. 55g /kg ) 、阿司匹林羧甲基纤维素混悬液(10mg /kg ) 和等体积蒸馏水, 连续给药3d 。参照文献[2]方法, 将小鼠置于固定器中, 使其尾部垂直, 末次给药后75min , 在距尾尖5mm 处剪断, 从血自行流出后计时, 每隔30s 用滤纸吸去血, 直至滤纸吸时无血(血液自然停止) 即为出血时间。
1. 7 水蛭提取物对家兔血浆复钙时间的影响 家兔静脉取血4. 5mL , 迅速加入装有38g /L 枸橼酸钠抗凝剂0. 5mL 的离心管中, 混匀后离心(1000r /min ) 10min , 分离血浆置冰浴备用。取试管5支, 每管加入血浆和生理盐水各0. 1m L , 随即放入37℃水浴温育1min , 然后各加入2. 8g /L CaCl 2溶液0. 1mL , 混匀, 加入时开动秒表, 每隔10s 缓慢倾斜试管1次。记录自加入CaCl 2至纤维蛋白形成, 即液面不动所需时, 。
现代中西医结合杂志Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2010May , 19(13) 成不同质量浓度的水蛭提取物0. 1mL , 按相同方法求出提取物组血浆复钙时间。
1. 8 水蛭提取物中游离氨基酸测定
1. 8. 1 样品液的制备 取水蛭提取物干燥, 精密称量, 定容至1mL 。再将样品溶液和磺基水杨酸以1∶1混匀, 离心(10000r /min ) 15min , 取上清液直接上机测试。
1. 8. 2 样品测定 采用日立835型氨基酸自动分析仪, 分析柱为2. 6mm ×150mm 不锈钢柱, 2619型磺酸型的强酸性阳离子交换树脂(日立株式会社) , 柱温53℃,体积流量0. 225m L /min , 压力80～130kg /cm 2, 循环时间70min ; 茚三酮体积流量0. 3m L /min , 压力15～35kg /cm 2。缓冲液改变次数5, 标准浓度3nmol /L , 氮气压力0. 28kg /cm 2。2 结 果
2. 1 水蛭提取物对小鼠凝血时间的影响 水蛭提取物0. 30, 0. 55, 1. 10g /kg 剂量组凝血时间分别为(119±5) s 、(137±6) s 、(148±9) s 、(101±3) s , 水蛭提取物各组与对照组比较均有显著性差异(P 均
2. 2 水蛭提取物对小鼠出血时间的影响 水蛭提取物组、阿司匹林组和对照组出血时间分别为(12. 3±2. 1) min 、(7. 8±2. 4) min 和(5. 7±1. 9) min , 前2组与对照组比较均有显著性差异(P 均
2. 3 水蛭提取物对家兔离体血浆复钙时间的影响 水蛭提取物能明显延长家兔离体血浆复钙时间, 并随着其质量浓度的升高而呈现明显的量效关系, 见表1。
表1 各组家兔离体血浆复钙时间比较(x ±s , n =10)
组别
剂量/(g /L )
20
水蛭提取物组
4080
对照组
-血浆复钙时间/s
121±8292±12①392±13①112±5
·1583·
表2 水蛭提取物中游离氨基酸成分分析
氨基酸丝氨酸谷氨酸缬氨酸苯丙氨酸赖氨酸色氨酸异亮氨基酸组氨酸甘氨酸蛋氨酸
质量分数/%
0. 8420. 5621. 401. 751. 510. 2112. 420. 3420. 6150. 766
氨基酸精氨酸脯氨酸丙氨酸牛磺酸天冬氨酸γ-氨基丁酸亮氨酸酪氨酸苏氨酸总氨基酸
质量分数/%
0. 9121. 273. 30. 380. 1730. 1964. 920. 3391. 0923
重高血压病[4]; 苯丙氨酸能预防某些有高血压病家族史“易感者”发病, 降低心血管疾病的发病率, 还可对抗自由基, 防治缺血-再灌注损伤[5]; 精氨酸是人体半必需氨基酸, 可通过L -Ag r -NO 途径扩张血管、抑制血小板聚集, 减少氧自由基损伤, 用于治疗缺血性心脏病、高血压、肺动脉高压症、动脉粥样硬化等疾病[6]。
综上所述, 本研究的起始材料为水蛭的干燥药材, 与以往文献报道中所用的新鲜水蛭或唾液不同, 这说明水蛭中所含的抗凝血物质不一定只存在于新鲜唾液中, 而应该是体内本身所含有的, 并且其性质应该相对比较稳定, 这样才能在经过干燥和长期的储存后保持良好活性。推测水蛭提取物中所含有的游离氨基酸可能是水蛭抗凝血作用的主要有效成分。本实验所用的不含活性纤溶酶的提取物具有抗凝血活性, 且含有丰富的游离氨基酸, 所以推断其氨基酸可能是临床上实际发挥抗凝血疗效的物质。
[
参
考
文
献]
[1] Chen XD , Tian DF , Liu HP , et al . An Investigation to the effect to
Pheretima decoction on bleeding time and blood cl otting tim e in healthy young people [J ]. J Tradit Chin M ed Univ Hunnan , 2003, 23(2) :10-11
[2] Tang SS , Teng D , W ang XH . Pharmacodynamics of Agacutin :a
thrombin -lkie enz yme from Agkistrodon acutus [J ]. Acta Acad M ed Xuzhou , 2005, 25(4) :308-312
[3] Lin YZ , Lin XY , Wan FD , et al . The preparation and biological ac -tivity of hydrol ysate of sw ine brain [J ]. Amino Acids Biotic Re -sou r , 1999, 21(3) :5-8
[4] Tian JB , Jia XB , Yang ZH , et al . Application , production and mar -ket expectation of L -Lys ine [J ]. Amino Acids Biotic Res our , 2004, 26(1) :44-46
[5] Peng KY , J in XR . Effects of cysteine and phenylalanine on pul -monary circulation and cerebral blood flow in chronic hypoxic rats [J ]. Chin J Appl Physiol , 1996, 12(2) :153-156
[6] Zhang JF , Gao LR , Lin QH . Effects of treatment of cardiovascul ar
diseases [J ]. J Cardiovas c Pulmon Dis , 1994, 13(2) :125-127
[收稿日期] 2009-11-10
注:①与对照组比较, P
2. 4 水蛭提取物中游离氨基酸成分分析 水蛭提取物含有19种游离氨基酸, 其中有人体所必需的8种氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸) , 游离氨基酸总量占提取物的23%。见表2。3 讨 论
本实验结果表明, 水蛭提取物可明显延长小鼠凝血、出血时间及家兔离体血浆复钙时间, 提示水蛭提取物能抑制内源性凝血系统, 具有抗凝血作用。水蛭提取物含有19种游离氨基酸, 总量占23%。游离的谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、和组氨酸或是神经递质或是递质的前体物质, 且质量分数最高的几种氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脑内的能源物质, 上述物质易通过血脑屏障, 具有促进神经细胞更新、调节神经递质代谢、维护神经功能及抗脑组织缺氧等作用。另外量较高的苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸在心血管方面也有重要的作用[3], 赖氨酸是优良的血栓预防剂, 与蛋氨酸合用能抑制