NK 细胞：NaturalKiller Cell，自然杀伤细胞是T 细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，机体天然免疫系统的核心细胞，不需预先致敏可迅速活化，具备强大的抗感染、抗肿瘤等功能。自然杀伤细胞表面有许多受体感应器，这些受体分为“激活”和“抑制”两种。当它在人体内捕获1个可疑细胞后，2种受体将传回不同的信号，如果是病变细胞，“激活”信号大大增强，免疫细胞的“杀手本能”将被激活，从而杀死病变细胞；反之，如果捕获的是一个健康细胞，“抑制”信号将占主导地位，该细胞将会被释放。（英国帝国理工学院）
采用蛋白（IL-21等）和抗体组合，高效激活扩增NK 细胞扩增培养专利技术，采集外周血50ml 或5.0×107个单核细胞，14-17天NK 细胞扩增10000倍以上，NK细胞纯度[CD16（+）+CD56（+）]≥80%，获得大于5.0×109个NK 细胞，且可冻存、复苏使用。美国急性髓细胞性白血病(AML)正在进行III 期临床试验，其它类肿瘤治疗已进入临床I\II期，国内外动物实验及临床试验已初步说明其
作为药物或三类医疗技术应用的安全性。
一、合作机构：
1、致力于治疗和预防类免疫系统疾病细胞类新药研发的科研机构；
2、致力于提高器官移植等抗排异技术应用的医院及科研机构；
3、致力于肿瘤生物治疗创新技术应用的医院及科研机构；
4、致力于病毒引起的疾病预防和治疗的新药研究机构；
5、致力于应用NK 细胞检测为基础的基因诊断技术科研机构；
1、硬件设备适应性强，培养过程操作简便，风险小，综合培养成本低；
2、外周血用量少（25-50ml)，培养获得的NK 细胞活性及纯度高；
3、培养获得NK 细胞扩增倍数高，活性强、产量大，应用面广；
4、两套制备工艺路线供选择，适合科学研究及医疗技术应用；
1、两套制备工艺供合作方免费选择使用（自体血浆/胎牛血清)；
2、为合作方提供免费培训服务，合作方现场技术复制和质量确认；
3、长期技术支持服务；
4、科研项目联合申报支持；
5、NK科研细胞制备供应；
6、协助合作方申报国家三类医疗技术；
四、制备过程使用主要设备
六、
培养过程使用的主要耗材
NK 细胞制备操作规程
1. 目的
为规范技术人员NK 细胞制备操作，特制订本管理制度。
2. 适用范围
本制度适用于所有技术人员。
3. 职责
3.1生产部经理和主管负责本制度的执行和监督。
3.2生产部的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作。
4. 操作流程
4.1抽取患者外周血50ml，将采集的血样转入50ml 离心管，离心2000r,10min（湘仪台式低速离心机L-550）。
4.2离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血清于新的50ml 离心管，盖好离心管盖于40℃水浴锅中孵育30Min。
4.4孵育结束后，再1400r(340G)离心10min,吸取上清于新的离心管保存4℃备用。
4.5用移液管将下层的血细胞与生理盐水1:1混匀，按1：1将悬液缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管（注意：不要打乱液面分界保持液面分层明显）。
4.6将离心机的升速与降速调至最低，400g离心30min；离心结束后，用5ml 移液管吸取中间白膜层于新的50ml 离心管，并用生理盐水洗涤离心两次，以去除多余血细胞。
4.7根据计数结果调整细胞浓度，充分混匀后按1-2x106/ml密度接种于T75培养瓶（NK细胞培养液+200IU/mlIL-2+80IU/ml庆大+NK扩增试剂）置于37℃,5%二氧化碳培养箱培养。
4.8当细胞生长到第三天离心换液（340G,10min ），培养:NK 细胞培养液+200IU/mlTL004+80IU/ml庆大
4.9以后4-6天每天镜检观察，根据细胞悬液颜色添加培养液，每次添加应为总体积的三分之一左右。
4.10第七天计数，当细胞量大于6x107时，则需加入扩增试剂，如细胞数量在3-6x107时，则长至第八天在添加NK 扩增培养试剂，加液时使总细胞浓度保持在1-1.5x106cell/ml。
4.11当培养液体积大于150ml 或细胞数量大于1.5x108时则需转移至培养袋培养（气泡尽量排空，以免影响细胞生长）。
4.12第8-11天每天镜检观察计数，根据细胞悬液颜色加培养液。第12-14天观察需加液时，细胞浓度需保持在2x106cell/ml。
4.13当细胞达到所需剂量时，即可离心收集细胞待用。
4.14将完成好的细胞悬液封好，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确保无误，贴上标签，填好详细实验记录并签名后，送病区进行回输。
质量控制
根据《中国生物制品》规程要求，对医学血液生物制品成品质量控制一般应该从成品的安全性、有效性和稳定性三方面考虑。根据本实验室的实际情况，现制定以下有关体细胞免疫治疗项目的质量控制管理标准试行草案，并在今后的工作中，不断总结经验，进一步完善质量控制管理标准。
一、实验室环境的管理
生物治疗实验室是符合生物制品要求的局部100级、工作区1000级、整体10000级的空气层流净化实验室。
1、每天监控实验室内空气的层流过滤风速改变、气压的稳定性、空调机的运转、湿度、温度等。
2、实验室每天保持1次紫外线消毒，时间设定在早上8：30~9：00。
3、保持实验室整齐清洁，实验结束后及时清理实验用品，并按细胞治疗GMP 实验室的管理制度中有关规定处理医疗废物废液。
5、每周大清洁一次（包括门、窗、天花板、地板、墙壁、仪器表面、桌椅柜里外等）。
6、定期（建议每周）进行一次实验室空气的细菌培养检测，将检测结果归档保存。
7、每年请生物工程公司协助检测实验室层流系统机器仪表运作情况、空气粒子浓度及滤网尘埃积聚情况，及时更换滤网。
二、试剂材料的管理
1、细胞培养用的基础培养基分别为RPMI 1640及GT-T551/GT-561培养液必须是符合临床使用标准，有质量合格证的产品。
2、使用的血清必须是病人自体血清或血浆或胎牛血清，不含外源因子：细菌、真菌、支原体、病毒、内毒素等。
3、分离淋巴细胞用的Ficoll 溶液必须使用符合医学生物制品要求的合格产品。
4、IL-2等细胞因子必须使用国家药监局批准的正式用于临床、有质量合格证、具有有效批准文号的产品。
5、抗生素使用合格在有效期范围内的注射用硫酸庆大霉素，工作浓度为80IU/ml。
6、抗凝剂使用注射用肝素钠。
7、生理盐水均为注射用0.9%生理盐水。
三、消耗材料的管理
所有用于细胞培养的培养瓶、离心管、玻璃瓶等均为符合生物制品要求，不含致热源的一次性产品；其余耗材如玻璃毛细吸管、胶塞均应严格专人浸泡、清洗、烘干和包装送本院供应科高压消毒后才能使用。工作人员每次启用物品应严格核对消毒日期，不得使用超过消毒
有效日期的器皿物品；未启用的消毒品超过有效期必须重新消毒，方可使用。
四、仪器管理
用于生产制备用的仪器如超净工作台、离心机、CO2培养箱、显微镜应指定专人管理，定期检修、清洁和消毒。
1、超净工作台必须保持无菌状态，每天保持2次紫外线消毒，物品放置要整齐，方便操作；实验结束后用75%医用酒精擦拭。
2、CO2培养箱定期紫外线消毒，托盘用75%医用酒精擦拭，盆内放灭菌水。上海泽平生物技术有限公司
联系人:刘先生
电话:[1**********]
Email ：[email protected]
NK 细胞：NaturalKiller Cell，自然杀伤细胞是T 细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，机体天然免疫系统的核心细胞，不需预先致敏可迅速活化，具备强大的抗感染、抗肿瘤等功能。自然杀伤细胞表面有许多受体感应器，这些受体分为“激活”和“抑制”两种。当它在人体内捕获1个可疑细胞后，2种受体将传回不同的信号，如果是病变细胞，“激活”信号大大增强，免疫细胞的“杀手本能”将被激活，从而杀死病变细胞；反之，如果捕获的是一个健康细胞，“抑制”信号将占主导地位，该细胞将会被释放。（英国帝国理工学院）
采用蛋白（IL-21等）和抗体组合，高效激活扩增NK 细胞扩增培养专利技术，采集外周血50ml 或5.0×107个单核细胞，14-17天NK 细胞扩增10000倍以上，NK细胞纯度[CD16（+）+CD56（+）]≥80%，获得大于5.0×109个NK 细胞，且可冻存、复苏使用。美国急性髓细胞性白血病(AML)正在进行III 期临床试验，其它类肿瘤治疗已进入临床I\II期，国内外动物实验及临床试验已初步说明其
作为药物或三类医疗技术应用的安全性。
一、合作机构：
1、致力于治疗和预防类免疫系统疾病细胞类新药研发的科研机构；
2、致力于提高器官移植等抗排异技术应用的医院及科研机构；
3、致力于肿瘤生物治疗创新技术应用的医院及科研机构；
4、致力于病毒引起的疾病预防和治疗的新药研究机构；
5、致力于应用NK 细胞检测为基础的基因诊断技术科研机构；
1、硬件设备适应性强，培养过程操作简便，风险小，综合培养成本低；
2、外周血用量少（25-50ml)，培养获得的NK 细胞活性及纯度高；
3、培养获得NK 细胞扩增倍数高，活性强、产量大，应用面广；
4、两套制备工艺路线供选择，适合科学研究及医疗技术应用；
1、两套制备工艺供合作方免费选择使用（自体血浆/胎牛血清)；
2、为合作方提供免费培训服务，合作方现场技术复制和质量确认；
3、长期技术支持服务；
4、科研项目联合申报支持；
5、NK科研细胞制备供应；
6、协助合作方申报国家三类医疗技术；
四、制备过程使用主要设备
六、
培养过程使用的主要耗材
NK 细胞制备操作规程
1. 目的
为规范技术人员NK 细胞制备操作，特制订本管理制度。
2. 适用范围
本制度适用于所有技术人员。
3. 职责
3.1生产部经理和主管负责本制度的执行和监督。
3.2生产部的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作。
4. 操作流程
4.1抽取患者外周血50ml，将采集的血样转入50ml 离心管，离心2000r,10min（湘仪台式低速离心机L-550）。
4.2离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血清于新的50ml 离心管，盖好离心管盖于40℃水浴锅中孵育30Min。
4.4孵育结束后，再1400r(340G)离心10min,吸取上清于新的离心管保存4℃备用。
4.5用移液管将下层的血细胞与生理盐水1:1混匀，按1：1将悬液缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管（注意：不要打乱液面分界保持液面分层明显）。
4.6将离心机的升速与降速调至最低，400g离心30min；离心结束后，用5ml 移液管吸取中间白膜层于新的50ml 离心管，并用生理盐水洗涤离心两次，以去除多余血细胞。
4.7根据计数结果调整细胞浓度，充分混匀后按1-2x106/ml密度接种于T75培养瓶（NK细胞培养液+200IU/mlIL-2+80IU/ml庆大+NK扩增试剂）置于37℃,5%二氧化碳培养箱培养。
4.8当细胞生长到第三天离心换液（340G,10min ），培养:NK 细胞培养液+200IU/mlTL004+80IU/ml庆大
4.9以后4-6天每天镜检观察，根据细胞悬液颜色添加培养液，每次添加应为总体积的三分之一左右。
4.10第七天计数，当细胞量大于6x107时，则需加入扩增试剂，如细胞数量在3-6x107时，则长至第八天在添加NK 扩增培养试剂，加液时使总细胞浓度保持在1-1.5x106cell/ml。
4.11当培养液体积大于150ml 或细胞数量大于1.5x108时则需转移至培养袋培养（气泡尽量排空，以免影响细胞生长）。
4.12第8-11天每天镜检观察计数，根据细胞悬液颜色加培养液。第12-14天观察需加液时，细胞浓度需保持在2x106cell/ml。
4.13当细胞达到所需剂量时，即可离心收集细胞待用。
4.14将完成好的细胞悬液封好，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确保无误，贴上标签，填好详细实验记录并签名后，送病区进行回输。
质量控制
根据《中国生物制品》规程要求，对医学血液生物制品成品质量控制一般应该从成品的安全性、有效性和稳定性三方面考虑。根据本实验室的实际情况，现制定以下有关体细胞免疫治疗项目的质量控制管理标准试行草案，并在今后的工作中，不断总结经验，进一步完善质量控制管理标准。
一、实验室环境的管理
生物治疗实验室是符合生物制品要求的局部100级、工作区1000级、整体10000级的空气层流净化实验室。
1、每天监控实验室内空气的层流过滤风速改变、气压的稳定性、空调机的运转、湿度、温度等。
2、实验室每天保持1次紫外线消毒，时间设定在早上8：30~9：00。
3、保持实验室整齐清洁，实验结束后及时清理实验用品，并按细胞治疗GMP 实验室的管理制度中有关规定处理医疗废物废液。
5、每周大清洁一次（包括门、窗、天花板、地板、墙壁、仪器表面、桌椅柜里外等）。
6、定期（建议每周）进行一次实验室空气的细菌培养检测，将检测结果归档保存。
7、每年请生物工程公司协助检测实验室层流系统机器仪表运作情况、空气粒子浓度及滤网尘埃积聚情况，及时更换滤网。
二、试剂材料的管理
1、细胞培养用的基础培养基分别为RPMI 1640及GT-T551/GT-561培养液必须是符合临床使用标准，有质量合格证的产品。
2、使用的血清必须是病人自体血清或血浆或胎牛血清，不含外源因子：细菌、真菌、支原体、病毒、内毒素等。
3、分离淋巴细胞用的Ficoll 溶液必须使用符合医学生物制品要求的合格产品。
4、IL-2等细胞因子必须使用国家药监局批准的正式用于临床、有质量合格证、具有有效批准文号的产品。
5、抗生素使用合格在有效期范围内的注射用硫酸庆大霉素，工作浓度为80IU/ml。
6、抗凝剂使用注射用肝素钠。
7、生理盐水均为注射用0.9%生理盐水。
三、消耗材料的管理
所有用于细胞培养的培养瓶、离心管、玻璃瓶等均为符合生物制品要求，不含致热源的一次性产品；其余耗材如玻璃毛细吸管、胶塞均应严格专人浸泡、清洗、烘干和包装送本院供应科高压消毒后才能使用。工作人员每次启用物品应严格核对消毒日期，不得使用超过消毒
有效日期的器皿物品；未启用的消毒品超过有效期必须重新消毒，方可使用。
四、仪器管理
用于生产制备用的仪器如超净工作台、离心机、CO2培养箱、显微镜应指定专人管理，定期检修、清洁和消毒。
1、超净工作台必须保持无菌状态，每天保持2次紫外线消毒，物品放置要整齐，方便操作；实验结束后用75%医用酒精擦拭。
2、CO2培养箱定期紫外线消毒，托盘用75%医用酒精擦拭，盆内放灭菌水。上海泽平生物技术有限公司
联系人:刘先生
电话:[1**********]
Email ：[email protected]