大戟甲羟戊酸途径关键酶基因hmgr的克隆与分析

武汉植物学研究2007, 25(2) :123～126

J ou rna l of W uhan B otan ica l R esea rch

大戟甲羟戊酸途径关键酶基因hm gr 的克隆与分析

曹小迎, 蒋继宏

, 刘群, 戴传超, 陈凤美

121

(1. 徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室, 江苏徐州　221116; 2. , 南京　210097)

摘　要:通过比较6种植物8条甲羟戊酸途径关键酶32羟基232甲) 基因同源区域, 设计简并引物, 利用RT 2PCR 技术成功地从大戟(Euphorbia 。通过B lastP 比较, 所推断的大戟H M GR 蛋白序列与杜仲(心莲A ndrographis paniculata

(AAP14352) 、胡黄连Picrorhiza kurrooa () 、(AAU08214) 、海岛棉Gossypium barba 2dense (ABC71314) 、龙胆草(90%、86%、86%、92%、87%和88%。蛋

白质保守区hm gr 基因, 这是首次报道从药用植物大戟中克隆到甲羟。

关键词:大戟32232甲基戊二酰辅酶A 还原酶; 基因克隆

中图分类号:Q781　　　　　文献标识码:A 　　　　　文章编号:10002470X (2007) 0220123204

C lon i n g and Ana lysis of a cD NA Encod i n g Key Enzy m e Gene (hm gr )

of the M VA Pa thway i n M ed i c i n a l Pl an t Euphorbia pekinensis

CAO Xiao 2Ying , J I A NG J i 2Hong

, L I U Qun , DA I Chuan 2Chao , CHEN Feng 2Mei

121

(1. Xuzhou N or m al U niversity, Key Laboratory of B iotechnology forM edicinal Plant, Xuzhou, J iangsu 　221116, China;

2. College of L ife Sciences, N anjing N or m al U niversity, Nanjing 　210097, China )

Abstract:Based on the design of degenerated olig onucleotides according t o the conservative regi ons of

eight 32hydr oxy 232methylglutaryl 2CoA reductases fr om six p lants and t otal RNA extracted fr om Euphorbia pekinensis , a 458bp frag ment of hm gr was obtained using reverse transcri p ti on PCR strategy . Thr ough se 2quence analysis by B lastP online, the resulting p r otein showed high homol ogy t o 32hydr oxy 232methylgluta 2ryl 2Co A reductase, with 90%identificati on compared with Euco mm ia ul m oides (AAV54051) , 86%with A nd rog raphis pan icula ta (AAP14352) , 86%with P icrorhiza kurrooa (ABC74565) , 92%with Hevea bra 2siliensis (AAU08214) , 87%with Gossypium ba rbadense (ABC71314) and 88%with Gentiana lutea (BAE92730) . Deduced a m ino acid sequence were als o analyzed by PROSI TE, Clustal X and Phyl ogenic tree, and data p resent evidence f or the existence of 32hydr oxy 232methylglutaryl 2Co A reductase in E . peki 2nensis , which is the first report of the hm gr gene is olated fr om E . pekinensis . Key words:Euphorbia pekinensis ; 32hydr oxy 232methyl 2glutaryl 2coenzy me A reductase (H MGR ) ; Gene cl oning

　　许多植物萜类化合物(如抗肿瘤药物紫杉醇和抗疟药青蒿素) 都具有很好的药理活性, 为解决当前西药毒副作用及治疗癌症、艾滋病等疑难疾病提供了一条新的药物来源, 因此植物萜类化合物引起了人们浓厚的兴趣。随着植物基因工程的飞速发展, 植物萜类代谢途径的研究取得了突破性的进展, 人们通过对关键酶基因的分离克隆, 表达调控进而对萜类次生代谢的合成途径和调控机制有了更为深

[1, 2]

入的了解。现代研究认为萜类在植物体中的合

成是分为两部分的, 一部分是甲羟戊酸途径, 在细胞

[1]

质中进行, 产生倍半萜和三萜; 另一部分是非甲羟戊酸途径, 在细胞的质体中进行, 产生单萜、二萜

[2, 3]

和四萜。在甲羟戊酸途径中32羟基232甲基戊二酰辅酶A 还原酶(32hydr oxy 232methylglutaryl CoA re 2ductase, H MGR ) 是主要的关键酶之一。目前, hm gr

[4][5][6]

基因已先后从苹果、红豆杉及甜瓜等植物中得到分离克隆。

药用植物大戟(Euphorbia pekinensis ) 又名龙虎

　　　收稿日期:2006-10-19, 修回日期:2006-12-14。

　基金项目:徐州师范大学科研重点项目(04XLA14) 资助。　作者简介:曹小迎(1975-) , 女, 江苏通州人, 博士研究生, 主要从事药用植物生物技术的研究工作。　3通讯作者(E 2mail:jhjiang@xznu. edu . cn )

。

124武汉植物学研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第25卷

草、将军草、九头狮子等, 在植物分类学上属大戟科,

为多年生草本植物。全株含乳汁。现代医学研究发现, 药用植物大戟的根具有多种药理作用, 如致泻、利尿、降压等。临床一般用于治疗急、慢性肾炎水肿及晚期血吸虫病腹水或其他肝硬变腹水。研究发现, 药用植物大戟根含三萜类成分大戟甙、生物碱、大戟

[7]

色素体A 、B 、C, 另含树胶、树脂等。若能通过基因工程手段来调控萜类代谢途径的关键酶如H MGR 十分有意义的事件。但迄今为止, hm g r hm g r 基因, hm gr 基因的结构特征、分子进化以其生物学功能都是非常有意义的。我们首次克隆了药用植物大戟hm g r 基因的c DNA 片段, 并用生物信息学手段对其序列进行了分析。

锂溶液, 4℃存放过夜。第2天取出后15000×g 4℃离心30m in 。沉淀再用70%乙醇洗2次后溶于DEPC 水中, -80℃冰箱中保存, 备用。1. 3　引物的设计与合成引物的设计依据6种植物的8条H MGR s 保守序列设计(Genbank :CAU72145、C M 2、、AY352338、:5’2GG ][A /T/C]ATGGG [G/A]ATG AA /下游引物序列为:5’2AC [A /T/C]GT [A /C/G ]CC [A /C]ACCTCAAT NG A [A /T/G ]GGCAT 23’。由北京奥科生物技术有限公司合成。1. 4　c D NA 克隆及序列分析

以大戟总RNA 为模板, 用RACE 试剂盒(Cl on 2tech ) 并按试剂盒操作步骤反转录合成5’RACE c DNA , 以合成的5’RACE c DNA 为模板, 用两个上

1　材料与方法

1. 1　材料

大戟(Euphorbia pekinensis ) 原植物采自安徽省琅琊山森林公园, 经安徽师范大学生命科学学院周

守标教授鉴定。1. 2　总RNA 的提取

[8]

大戟总RNA 提取参照庄军平等报道的方法略加改动, 可以概括为:取1g 大戟的幼嫩叶片, 液氮速冻后研磨成粉末, 移入50mL 离心管。加入10mL 65℃预热的抽提缓冲液[2%(W /V) CT AB (十六烷基三甲基溴化铵) , 100mmol/LTris/HCl(pH 714) , 2mol/LNaCl, 25mmol/LE DT A (乙二胺四乙酸) , 2%(W /V) P VPP (交联聚乙烯吡咯烷酮) 和4%(V /V) β2巯基乙醇]。剧烈震荡1m in 后65℃温育10m in 。冷却至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1) , 混匀后于11000×g 4℃离心15m in 。取上

下游引物进行PCR 扩增。PCR 扩增体系为:50μL

体系中含2μL 5’RACE c DNA, 兼并引物各25pmol, dNTPs 10μmol, Ex PCR buffer 5μL, Ex Taq Poly me 2rase 5U 。PCR 反应条件为94℃3m in, 1个循环; 94℃1m in, 60℃1m in, 72℃2m in, 35个循环; 72℃10m in, 1个循环。用1%琼脂糖电泳分离PCR 产

物, 回收目的条带并纯化, pGE M 2T Easy 载体连接,

α大肠杆菌。在LB /AMP/I PTG/X2Gal 平转化DH5

板上筛选阳性克隆, 然后随机挑选经PCR 和Eco R Ⅰ酶切确认的重组质粒并测序, 测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成。将所测定的序列结果通过BLASTP 或BLASTX 搜索Nati onal Center f or B i otech 2nol ogy I nf or mati on (NCB I ) 的核苷酸和蛋白质数据库, 将所测序列通过Dna man 软件翻译成氨基酸序列并寻找最大读码框, 用Pr osite 软件在线分析该蛋白质的基本结构域, 并通过Clustal X 分析软件与其它植物hm gr 的氨基酸序列进行多重比较, 用MEG A 方法构建系统进化树。

清液, 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1) , 混匀后于11000×g 4℃离心15m in 。取上清液, 加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH 512) , -80℃沉淀1h 。取出后于11000×g 4℃离心15m in 。沉淀用3mol/L醋酸钠(pH 516)

2　结果与分析

2. 1　RNA 提取

淋洗后于15000×g 4℃离心10m in 。沉淀溶于500μL DEPC 水中。继续再用氯仿/异戊醇抽提一次。取上清液, 加入2倍体积的乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH 512) , -80℃沉淀1h 后离心, 用70%乙醇洗涤沉淀并溶于500μL DEPC (焦碳酸二乙酯) 水中, 然后再加入2/3体积的8mol/L氯化

大戟总RNA 的甲醛变性凝胶的电泳结果见图1, 从图1中可以清晰地看出r RNA 的2条条带(18S r RNA 、28S r RNA ) , 其中28S r RNA 条带的亮度大约为18S r RNA 的2倍, 说明总RNA 有良好的完整性。在紫外分光光度计上测得吸光值, A 260/A280比值为11996, 说明所提取的RNA 质量较好, 酚类、蛋白质和无机盐等杂质已基本排除。此RNA 提取方法适

　第2期　　　　　　　　　　　曹小迎等:大戟甲羟戊酸途径关键酶基因hm gr

的克隆与分析125

合于药用植物大戟总RNA 的抽提

。

表明目标片段为458bp, 基于该序列在NCB I 网站

上通过BLAST N 比较, 结果显示这条序列与橡胶树、南京椴、喜树等的hm gr 基因有很高的同源性, 说明扩增到的序列就是药用植物大戟的hm gr 基因序列。2. 3　推断的H M GR 蛋白的同源比较、功能域及结

1, 2:大戟总RNA

1, 2:Euphorbia pekinensis ’s t otal RNA

图1　总RNA 电泳Fig . 1　Total RNA gel electr ophoresis

2. 2　大戟hm gr 基因克隆与序列分析

用RT 2PCR 方法, 以大戟总增到一条约500bp () , 符合。, pGE MT_easy载体, , 抽提质粒, 验证转化子大小, 然后将分子量明显增大的重组质粒作为模板, 用原引物进行PCR 扩增, 验证重组质粒插入的片段的大小, 并进一步用酶切鉴定, 表明重组质粒中插入的片段为RT 2PCR 克隆得到的片段。

测序结果

构分析

B lastP H ia ul m oides (AAV54051) 、paniculata (AAP14352) 、胡黄连kurrooa (ABC74565) 、橡胶树Hevea bra 2siliensis (AAU08214) 、海岛棉Gossypium barbadense (ABC71314) 、龙胆草Gen tiana lu tea (BAE92730) 的一致性分别达到90%、86%、86%、92%、87%和88%。

用Pr osite 软件在线分析(htt p://us . expasy . org/p r osite /) , 发现所推断的大戟H MGR 蛋白具有H MGR 家族中的保守区域, 并发现了下列特征位

点:一个蛋白激酶C 磷酸化位点, 两个酪蛋白激酶II 磷酸化位点, 六个N 端豆蔻酰化位点(图3) 。同时分析了上面提到的不同来源H MGR 蛋白质序列的结构特点, 发现它们同样拥有这些结构特点。2. 4　推断的H M GR 蛋白的进化分析

从GenBank 上选取包括动物、植物、昆虫、真菌等20个来源不同的H MGR 蛋白序列, 与本研究所推断的大戟H MGR 蛋白序列分析。用MEG A3. 1软件按自展法(boostrap ) 运算1000次, 结果表明, H MGR 蛋白质具有明显的种族特异性, 大戟的H MGR 蛋白属于植物的分支中(图4) , 从图4中还

M:DNA 标记; 1. PCR 扩增产物

M:DNA marker (GeneRuler T M 1kb DNA ladder ) ; 1. PCR p r oducti on

图2　保守区片段扩增产物Fig . 2　Pr oduct of conservati on frag ment

可以看到植物、动物、昆虫与真菌在进化上有共同的

起源, 说明它们来源于共同的祖先

。

蛋白激酶C 磷酸化位点:38240SdK; 酪蛋白激酶II 磷酸化位点:1132116TqqD 、1282131T mmE; N 2肉豆蔻酰化位点:31236GIsg NY 、34239G NycS D 、88293GSav AG 、93298GSlgGF 、962101GGfnAH 、1142119G QdpAQ Pr oteinkinase C phos phorylati on site:38240SdK; Casein kinase II phos phorylati on site:1132116TqqD, 1282131T mmE; N 2myrist oylati on site:31236GIsg NY, 34239G NycS D, 88293GSav AG, 93298GSlgGF, 962101GGfnAH, 1142119G QdpAQ

图3　H M GR 蛋白Prosite 分析结果

Fig . 3　Analysis of H MGR deduced p r otein by p r osite

3　讨论

相对大戟属植物而言, 药用植物大戟化学成分

及分子生物学研究明显滞后。大戟属许多植物都具有抗癌、抗细菌、抗病毒等活性, 并且从这些植物中

分离出了二萜、三萜类化合物, 研究发现很多大戟属

植物的活性成分为萜类物质。大戟为多年生草本,

[9]

干燥根入药。孔令义等从大戟根中获得9个化合

[10]

物, 其中2个为三萜类化合物。W ang Jue 等研究发现大戟地上部分醇提物浓度在100μg/mL时对

126武汉植物学研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第25卷

图4　20个物种H M GR 蛋白在进化上的关系

Fig . 4　Phyl ogentic relati onshi p a mong HMGR p r oteins in 20different s pecies

杆细胞中组胺释放的抑制率为8713%, 对拟巨噬细

胞株RAW 26417中NO 产生的抑制率为5017%。除此之外对大戟的萜类化学成分及活性成分的研究几乎未见报道。对大戟萜类化合物的生物合成及其分子调控更是知之甚少。

近年来, 研究发现H MGR 是甲羟戊酸途径中的一个关键酶。32羟基232甲基戊二酸单酰辅酶A 在HMGR 的作用下生成甲羟戊酸(MVA ) 。由于该反应是一个不可逆过程, 因此H MGR 被认为是该合成

[11]

途径中第一个最关键的限速酶。H MGR 对细胞质中萜类物质的代谢起重要调控作用, 作为早期酶类, 它决定“碳流”的流向。利用转基因技术将hm g r 基因导入目标植物来提高有效成分的含量有许多成

[12]

功的报道。本文实验结果首次成功地从大戟中扩增出甲羟戊酸途径的关键酶基因hm gr , 通过同源性比较、保守性区域比较以及蛋白特征性位点分析, 发现与前人所报道的H MGR 蛋白特性非常相似, 因此可以推断克隆得到的片段就是药用植物大戟HMGR 的c DNA 片段。为从大戟中克隆H MGR 的全长基因进而通过基因工程手段提高大戟中的萜类化合物的研究和应用作了必要的前期准备。参考文献:

[1]　Ne wman J D, Chappell J. Is op renoid bi osynthesis in p lants:car 2

bon partiti oning within the cyt op las m ic pathway[J ].C rit R ev B io 2che m M ol B iol , 1999, 34:95.

[2]　Eisenreich W , Schwarz M , Cartayrade A, A rigoni D, Zenk M H,

Bacher A. The deoxyxylul ose phos phate pathway of ter penoid bi o 2synthesis in p lants and m icr oorganis m s[J ].Che m B iol , 1998, 5:R221.

[3]　L ichtenthaler H K . The 12deoxydxylul ose 252phos phate pathway of

is op renoid bi osynthesis in p lants [J ].A nnu R ev P lant Physiol Plant M ol B iol , 1999, 50:47.

[4]　Rupasinghe H P V, A l m quist K C, Paliyath G,Murr D P . Cl oning

of hm g1and hm g2c DNA s encoding 32hydr oxy 232methylglutaryl coenzy me A reductase and their exp ressi on and activity in relati on t o α2farnesene synthesis in app le [J ].Plant Physiol B ioche m , 2001, 39:933-947.

[5]　L iao Z H, Tan Q M , Chai Y R, et al . Cl oning and characterizati on

of the gene encoding HMG 2CoA reductase fr om Taxus m edia and its functi onal identificati on in yeast[J ].Functional Plant B iolo 2gy , 2004, 31:73-81.

[6]　Kat o 2Emori S, H igashi K, Hos oya K, H igashi K, Ezura H. Cl oning

and characterizati on of the gene encoding 32hydr oxy 232methylglu 2taryl coenzy me A reductase in mel on (Cucum is m elo L. reticula 2tus ) [J ].M ol Genet Geno m ics , 2001, 265:135-142.

[7]　中国药材公司. 药用植物资源志要[M].北京:科学出版社,

1994.

[8]　庄军平, 苏菁, 陈维信. 一种从香蕉果实提取高质量RNA 的

方法[J ].分子植物育种, 2006, 4(1) :143-146.

[9]　孔令义, 闵知大. 大戟根化学成分的研究[J ].药学学报,

1996, 31(7) :524-529.

[10]　W ang J,W ang N, Yao X S, Ishii R, Kitanaka S . I nhibit ory activity

of Chinese herbal medicines t oward hista m ine release fr om mast cells and nitric oxide p r oducti on by macr ophage 2like cell line, RAW 264. 7[J ].Journal of N atural M edicines , 2006, 60(1) :73-77.

[11]　Chappell J, B i oche m istry and molecular bi ol ogy of the is op renoid

bi osynthesis pathway in p lants[J ].A nn R ev Plant Physio P lant M ol , 1995, 46:521-547.

[12]　Shi m ada H, Kondo K, Fraser P D,M iura Y, Sait o T, M issawa N.

I ncreased car otenoid p r oducti on by the food yeast candida utilis thr ough metabolic engineering of the is op renoid pathway[J ], Appl Environ M icrobiol , 1998, 64(7) :2676-2680.