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B66
DB32/T食品中副溶血性弧菌K 抗原、H 抗原免疫
磁珠富集增菌检验方法
连云港市产品质量监督检验所 发布
DB32/T -2010 前 言
本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的检验和鉴定。
本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。
本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。
本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。
本标准主要起草人:
本标准于2008年 月首次发布。
食品中副溶血性弧菌K 抗原、H 抗原免疫磁珠富集增菌检验方法
1 范围
本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫磁珠富集检验。
本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。
本标准检出限为 20CFU/g
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的
修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T
20001.4-2001 标准编写规定
实验原理
利用免疫学原理,采用副溶血性弧菌K 抗血清或H 抗血清(H 抗血清对海洋弧菌非特异
性结合)交联包被在磁珠表面制备成免疫磁珠,当免疫磁珠遇到菌体抗原产生结合,抗原
抗体结合完成后再施加外来磁场,使得免疫磁珠贴与试管壁不被洗脱。然后将磁场消除,
磁珠自然落入试管底部,采用非金属接种环或采用加样器将结合菌体的免疫磁珠接种到选
择性增菌液中增菌或划线与选择性平板分离培养。
3 设备与材料
3.1 低温冷冻高速离心机。
3.2 电动试管振荡器。
3.3 精密恒温水浴箱。
3.4 永磁架
3.5 天平(0.1g )
3.6 拍打式均质器
3.7 冰箱
3.8 全支消毒自动加液器(带滤头)
3.9 非金属接种环
4 试剂及培养基
4.1 Dynabeads M-280 磁珠(日本DYNAL 社产)或其他牌号的磁珠
4.2 副溶血性弧菌K 抗血清
4.3 副溶血性弧菌H 抗血清
4.4 羊抗兔Ig (G)
4.5 LS弧菌选择性显色琼脂 见附录A
4.6 35g/L氯化钠碱性DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液 见附录A
4.7 EDC solution 液:500mg EDC in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min
4.8 NHS solution 液:250mg NHS in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min
注:EDC 与 NHS 必须现用现配。
4.9 保存液:硼酸缓冲体系,0.005M 硼酸,pH9.0,0.05w/w %Tween20,0.02w/v%NaN3,
0.1w/v%BSA
4.10 BST溶液:硼酸缓冲体系,0.005M 硼酸,0.05 w/w%Tween20
4.11 MEST洗液:10mM MES,pH5.0,0.05 w/w% Tween 20
实 验 流 程
5免疫磁珠的交联制备:
5.1 将2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中
5.2 向管中加入500uL MEST(10mM MES,pH5.0,0.05 w/w%Tween 20)对磁粒子进行洗
涤3次(结合磁分离操作)。
5.3 加入EDC 与NHS 各2.5mg ,调整最后反应体积为500uL ,旋转器上旋转,37℃恒温,
0.5小时。
5.4 活化后,用上述的MEST 洗涤除去未反应的活化剂,再换管(去除管壁上可能吸附的
活化剂),再洗涤2遍。
5.5 再用BST 液洗涤两遍后,再分散到BST 中。
5.6 向每管中加入抗血清300 uL ,调整最后反应体积为500uL ,进行偶联,4℃,20小时。
5.7 用BST 液洗涤四次(第一次需换管,一定要洗涤干净,每次洗涤时要将磁珠重悬吹
散)。
5.8 500μL 保存液重悬偶联好抗体的磁珠。
5.9 采用DYNAL 社产 Dynabeads M-280 磁珠时用下列方法处理:
5.9.1取羊抗兔 Ig (G)0.5ml,加1ml(PBS-Tween) 液混匀。
5.9.1离心4000rpm/min,2min, 弃去上清液(PBS-Tween )。
5.9.3加PBS-Tween 液1ml 使磁珠重新分散悬浮其中。
5.9.4加副溶血性弧菌K 免疫血清1ml ,4℃垂直于水平面、轻缓旋转振荡18h 。
5.9.5上磁,吸取液体并弃去。
5.9.6消磁,用1ml 洗液清洗,重复5.9.5步骤。
5.9.7将洗净5次后的免疫磁珠放4℃冰箱备用。
6 样品制备
6.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min 或在2~5℃不超过18 h解冻。若不能及时检
验, 应放于—15℃左右保存;非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验, 若不能及时
检验, 应置于6~10℃冰箱保存, 在24 h内检验。
6.2 取样:以无菌操作进行。
6.2.1 鱼类:取鱼体不同部位。
6.2.2贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉;如为带壳贝类, 则应先在清洁的流水中洗刷净外
壳, 然后以无菌操作打开贝壳, 取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。
6.2.3甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。
6.3 以无菌操作称取50 g检样放于均质袋中, 以灭菌剪刀充分剪碎。
5.4 加0.45%氯化钠稀释水150mL, 拍打均质15min, 如无均质器, 则应以剪刀尽量剪碎, 并
充分振荡。
6.5 吸取5ml 样液加入选择性增菌液中37℃培养8h 。
7实 验
7.1 将1ml 增菌液加到含有50ul 免疫磁珠小管中,室温垂直轻缓旋转振荡20min 。
7.2 上磁架,用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。
7.3 加1ml 洗液复混后同前操作。
7.4 清洗4~5次后,加100ul PBS-Tween液使免疫磁珠和目标混匀备用。
7.5 用塑料接种环划线接种到LS 显色培养基或增菌液中培养36℃24h 。
7.6 直接样品吸附富集法:
7.6.1 吸取样品均质液5ml, 放入含有2mg 免疫磁珠试管中,室温垂直轻缓旋转振荡20min 。
7.6.2上磁架,用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。
7.6.3加1ml 洗液复混后同前操作,用洗液清洗悬浮磁珠3次。
7.6.4用0.45%氯化钠溶液1.0ml 悬浮磁珠备检。
8 增菌培养和分离
8.1 将免疫磁珠备检液吸取0.5ml 接种到3.5%氯化钠DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液中, 于
37℃进行选择性适时增菌培养。
8.2 将免疫磁珠备检液用非金属接种环划线与LS 选择性显色培养基或等效的弧菌选择性
培养基上37℃培养18~24 h。
6.5 副溶血性弧菌在LS 平板上的典型菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润、粉红色带晕菌落, 直
径2~4mm 。TCBS 为绿色圆形中心突起菌落,菌落表面湿润,直径2~4mm 。在梅里埃显色培养基上为粉红色菌落,菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润,直径2~4mm 。在科玛嘉
显色培养基上为紫红色菌落,菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润,直径2~4mm 。
附录A
培养基及试剂
A.1 LS 培养基
A.1.1成份
硫代硫酸钠8.5g
枸橼酸钠8.0g
十二烷基硫酸钠0.2g
胆酸盐5.0g
蛋白胨5.0g
酵母膏1.0g
磷酸铁0.01g
EDTA0.2g
0.5%阿拉伯糖
0.25%葡萄糖醛酸盐
0.1%硫酸铵
0.1%霉菌浸膏
甜菜碱0.125%
丙酮酸钠0.125%
亚碲酸钾0.1%
超氧化物歧化酶0.125%
DMEM 液体25%
TWEEN-801ml
胆酸钠0.5%
多粘菌素B100IU /ml
青霉素4000单位
林可霉素0.15g
生物素0.1g
N 甲基伞酮0.1%
Cacl 2 0.2%
硝基唑兰 0.01%
头孢硝噻吩0.01%
琼脂1.7%
用纯水定容到1000ml
PH7.6
A1.2将除抗生素、硝基唑兰、头孢硝噻吩、超氧化物歧化酶、生物素、DMEM (细胞培
养基成品)外的组分溶入950ml 水中, 微热溶解后115℃灭菌15min ,当温度降到
50℃时加入过滤灭菌的抗生素、硝基唑兰、头孢硝噻吩、超氧化物歧化酶、生物
素、DMEM 液50ml, 趁热铺平板。平板冷却凝固后4℃备用。
A2 35g/L氯化钠碱性DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液
A2.1成份
蛋白胨5.0g
酵母膏1.0g
磷酸铁0.01g
EDTA0.2g
0.5%阿拉伯糖
0.25%葡萄糖醛酸盐
0.1%硫酸铵
0.1%霉菌浸膏
甜菜碱0.125%
丙酮酸钠0.125%
亚碲酸钾0.1%
超氧化物歧化酶0.125%
DMEM 液体25%
TWEEN-80 1ml
胆酸钠0.5%
多粘菌素B100IU /ml
青霉素4000单位
林可霉素0.15g
生物素0.1g
陈海水调到1000ml
PH7.6-7.8
A2.2将除抗生素、DMEM 、超氧化物歧化酶、生物素以外的组份配制溶解到950ml 陈海水中
高压115℃灭菌15min ,当温度降到50℃加入过滤除菌的抗生素、DMEM 、超氧化物歧化酶、生物素混合溶液50ml, 摇匀分装到30ml 细胞瓶中室温备用。
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DB32/T食品中副溶血性弧菌K 抗原、H 抗原免疫
磁珠富集增菌检验方法
连云港市产品质量监督检验所 发布
DB32/T -2010 前 言
本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的检验和鉴定。
本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。
本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。
本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。
本标准主要起草人:
本标准于2008年 月首次发布。
食品中副溶血性弧菌K 抗原、H 抗原免疫磁珠富集增菌检验方法
1 范围
本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫磁珠富集检验。
本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。
本标准检出限为 20CFU/g
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的
修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T
20001.4-2001 标准编写规定
实验原理
利用免疫学原理,采用副溶血性弧菌K 抗血清或H 抗血清(H 抗血清对海洋弧菌非特异
性结合)交联包被在磁珠表面制备成免疫磁珠,当免疫磁珠遇到菌体抗原产生结合,抗原
抗体结合完成后再施加外来磁场,使得免疫磁珠贴与试管壁不被洗脱。然后将磁场消除,
磁珠自然落入试管底部,采用非金属接种环或采用加样器将结合菌体的免疫磁珠接种到选
择性增菌液中增菌或划线与选择性平板分离培养。
3 设备与材料
3.1 低温冷冻高速离心机。
3.2 电动试管振荡器。
3.3 精密恒温水浴箱。
3.4 永磁架
3.5 天平(0.1g )
3.6 拍打式均质器
3.7 冰箱
3.8 全支消毒自动加液器(带滤头)
3.9 非金属接种环
4 试剂及培养基
4.1 Dynabeads M-280 磁珠(日本DYNAL 社产)或其他牌号的磁珠
4.2 副溶血性弧菌K 抗血清
4.3 副溶血性弧菌H 抗血清
4.4 羊抗兔Ig (G)
4.5 LS弧菌选择性显色琼脂 见附录A
4.6 35g/L氯化钠碱性DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液 见附录A
4.7 EDC solution 液:500mg EDC in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min
4.8 NHS solution 液:250mg NHS in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min
注:EDC 与 NHS 必须现用现配。
4.9 保存液:硼酸缓冲体系,0.005M 硼酸,pH9.0,0.05w/w %Tween20,0.02w/v%NaN3,
0.1w/v%BSA
4.10 BST溶液:硼酸缓冲体系,0.005M 硼酸,0.05 w/w%Tween20
4.11 MEST洗液:10mM MES,pH5.0,0.05 w/w% Tween 20
实 验 流 程
5免疫磁珠的交联制备:
5.1 将2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中
5.2 向管中加入500uL MEST(10mM MES,pH5.0,0.05 w/w%Tween 20)对磁粒子进行洗
涤3次(结合磁分离操作)。
5.3 加入EDC 与NHS 各2.5mg ,调整最后反应体积为500uL ,旋转器上旋转,37℃恒温,
0.5小时。
5.4 活化后,用上述的MEST 洗涤除去未反应的活化剂,再换管(去除管壁上可能吸附的
活化剂),再洗涤2遍。
5.5 再用BST 液洗涤两遍后,再分散到BST 中。
5.6 向每管中加入抗血清300 uL ,调整最后反应体积为500uL ,进行偶联,4℃,20小时。
5.7 用BST 液洗涤四次(第一次需换管,一定要洗涤干净,每次洗涤时要将磁珠重悬吹
散)。
5.8 500μL 保存液重悬偶联好抗体的磁珠。
5.9 采用DYNAL 社产 Dynabeads M-280 磁珠时用下列方法处理:
5.9.1取羊抗兔 Ig (G)0.5ml,加1ml(PBS-Tween) 液混匀。
5.9.1离心4000rpm/min,2min, 弃去上清液(PBS-Tween )。
5.9.3加PBS-Tween 液1ml 使磁珠重新分散悬浮其中。
5.9.4加副溶血性弧菌K 免疫血清1ml ,4℃垂直于水平面、轻缓旋转振荡18h 。
5.9.5上磁,吸取液体并弃去。
5.9.6消磁,用1ml 洗液清洗,重复5.9.5步骤。
5.9.7将洗净5次后的免疫磁珠放4℃冰箱备用。
6 样品制备
6.1 冷冻样品应在45℃以下不超过15min 或在2~5℃不超过18 h解冻。若不能及时检
验, 应放于—15℃左右保存;非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验, 若不能及时
检验, 应置于6~10℃冰箱保存, 在24 h内检验。
6.2 取样:以无菌操作进行。
6.2.1 鱼类:取鱼体不同部位。
6.2.2贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉;如为带壳贝类, 则应先在清洁的流水中洗刷净外
壳, 然后以无菌操作打开贝壳, 取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。
6.2.3甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。
6.3 以无菌操作称取50 g检样放于均质袋中, 以灭菌剪刀充分剪碎。
5.4 加0.45%氯化钠稀释水150mL, 拍打均质15min, 如无均质器, 则应以剪刀尽量剪碎, 并
充分振荡。
6.5 吸取5ml 样液加入选择性增菌液中37℃培养8h 。
7实 验
7.1 将1ml 增菌液加到含有50ul 免疫磁珠小管中,室温垂直轻缓旋转振荡20min 。
7.2 上磁架,用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。
7.3 加1ml 洗液复混后同前操作。
7.4 清洗4~5次后,加100ul PBS-Tween液使免疫磁珠和目标混匀备用。
7.5 用塑料接种环划线接种到LS 显色培养基或增菌液中培养36℃24h 。
7.6 直接样品吸附富集法:
7.6.1 吸取样品均质液5ml, 放入含有2mg 免疫磁珠试管中,室温垂直轻缓旋转振荡20min 。
7.6.2上磁架,用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。
7.6.3加1ml 洗液复混后同前操作,用洗液清洗悬浮磁珠3次。
7.6.4用0.45%氯化钠溶液1.0ml 悬浮磁珠备检。
8 增菌培养和分离
8.1 将免疫磁珠备检液吸取0.5ml 接种到3.5%氯化钠DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液中, 于
37℃进行选择性适时增菌培养。
8.2 将免疫磁珠备检液用非金属接种环划线与LS 选择性显色培养基或等效的弧菌选择性
培养基上37℃培养18~24 h。
6.5 副溶血性弧菌在LS 平板上的典型菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润、粉红色带晕菌落, 直
径2~4mm 。TCBS 为绿色圆形中心突起菌落,菌落表面湿润,直径2~4mm 。在梅里埃显色培养基上为粉红色菌落,菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润,直径2~4mm 。在科玛嘉
显色培养基上为紫红色菌落,菌落呈圆形, 边缘整齐、湿润,直径2~4mm 。
附录A
培养基及试剂
A.1 LS 培养基
A.1.1成份
硫代硫酸钠8.5g
枸橼酸钠8.0g
十二烷基硫酸钠0.2g
胆酸盐5.0g
蛋白胨5.0g
酵母膏1.0g
磷酸铁0.01g
EDTA0.2g
0.5%阿拉伯糖
0.25%葡萄糖醛酸盐
0.1%硫酸铵
0.1%霉菌浸膏
甜菜碱0.125%
丙酮酸钠0.125%
亚碲酸钾0.1%
超氧化物歧化酶0.125%
DMEM 液体25%
TWEEN-801ml
胆酸钠0.5%
多粘菌素B100IU /ml
青霉素4000单位
林可霉素0.15g
生物素0.1g
N 甲基伞酮0.1%
Cacl 2 0.2%
硝基唑兰 0.01%
头孢硝噻吩0.01%
琼脂1.7%
用纯水定容到1000ml
PH7.6
A1.2将除抗生素、硝基唑兰、头孢硝噻吩、超氧化物歧化酶、生物素、DMEM (细胞培
养基成品)外的组分溶入950ml 水中, 微热溶解后115℃灭菌15min ,当温度降到
50℃时加入过滤灭菌的抗生素、硝基唑兰、头孢硝噻吩、超氧化物歧化酶、生物
素、DMEM 液50ml, 趁热铺平板。平板冷却凝固后4℃备用。
A2 35g/L氯化钠碱性DMEM 多粘菌素链霉菌增菌液
A2.1成份
蛋白胨5.0g
酵母膏1.0g
磷酸铁0.01g
EDTA0.2g
0.5%阿拉伯糖
0.25%葡萄糖醛酸盐
0.1%硫酸铵
0.1%霉菌浸膏
甜菜碱0.125%
丙酮酸钠0.125%
亚碲酸钾0.1%
超氧化物歧化酶0.125%
DMEM 液体25%
TWEEN-80 1ml
胆酸钠0.5%
多粘菌素B100IU /ml
青霉素4000单位
林可霉素0.15g
生物素0.1g
陈海水调到1000ml
PH7.6-7.8
A2.2将除抗生素、DMEM 、超氧化物歧化酶、生物素以外的组份配制溶解到950ml 陈海水中
高压115℃灭菌15min ,当温度降到50℃加入过滤除菌的抗生素、DMEM 、超氧化物歧化酶、生物素混合溶液50ml, 摇匀分装到30ml 细胞瓶中室温备用。