2010年第7期
CHINA PLANT PROTECTION 2010, Vol ．30．No ．
7
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!!! "
研究报告
（1. 吉林农业大学，吉林长春
摘要：离体抑菌实验表明，放线菌769对植物病原真菌具有广谱的抑制活性。不同种类病原菌对其敏感性有一定的差异。对水稻稻瘟病病菌、玉米大斑病病菌、高粱散黑穗病病菌、玉米穗腐病病菌、葱紫斑病病菌、番茄炭疽病病菌等16种植物病原真菌均有明显抑制效果。同时，首次对放线菌769的液体培养条件进行了探索，通过比浊法、测菌丝体干重法、抑菌圈直径等方法，测定了放线菌769的生长曲线。其在YEME 培养基中摇床振荡培养时的生长曲线，0～36h 为生长延迟期，36～84h 为对数生长期，84～108h 为稳定期，108h 以后为衰亡期。关键词：放线菌769；抑菌谱；液体培养；生长曲线中图分类号：S482.7
文献标识码：A
文章编号：1672-6820（2010）07-0005-05
ZHANG Hong -dan 1，2, DU Qian 2, ZHANG Zheng -kun 2, XU Wen -jing 2, CHEN Guang 1, LI Qi -yun 2
（1. Jilin Agricultural University ，Changchun Jilin, 130000，China; 2. Institute of Plant Protection ，Jilin Academy of A -
gricultural Sciences ，Changchun Jilin ，130124，China ）
Abstract:Based on experiments in vitro, actinomycin 769had inhibitory activity on plant pathogenic fungi with different sensibilities, and had significant inhibitory effect on 16plant pathogenic fungi species, such as Magonaporthe grisea and so on. Liquid culture of actinomycin 769was studied for the first time, and growth curve was determined by its nephelometery and the measurement of mycelium dry weight and bacteriostasis -diameter. The growth curve of shaking cultivation in YEME was lag phase in 0~36h ，log phase in 36~84h ，stationary phase in 84~108h and decline phase after 108h. Key words:actinomycin 769; inhibitory spectrum; liquid culture; growth curve
放线菌769由吉林省农科院专家1967年从公主岭土壤中分离筛选得到，经中国科学院微生物所阮继生研究员对其进行鉴定，并定名为不吸水链霉菌公主岭新变种（Streptomyces ahygroscopicus n . var .
gongzhulingensis Ruan et zhang ）。其所产生的抗生素
被称为公主岭霉素，是一种自然生物合成的混合制剂，也是我国目前仅有的正式登记的9种农用抗生素类杀菌剂之一。公主岭霉素的1个独特的优点是
收稿日期：2010-06-03作者简介：张红丹（1986-通讯作者：杜茜（1979-），女，硕士研究生，研究方向为微生物分子生物学。E -mail ：zhanghongdan . 0000@163. com
），女，硕士，河北宣化人，助理研究员，研究方向为生物农药。E -mail ：dqzjk@163. com 。李启云（1974-），男，博士，
研究员。研究方向为生物农药及微生物分子生物学。E -mail ：qyli@cjaas. com 。
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放线菌769抑菌谱及液体培养
生长曲线的测定
张红丹，杜
1，2
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茜，张正坤，徐文静，陈
222
光，李启云
12
130000；2. 吉林省农科院植物保护研究所，吉林长春130124）
Determination of actinomycin 769inhibitory spectrum
and liquid culture growth curve
对人、畜毒性低。在全国大面积应用过程中，未发现任何中毒事故，不污染粮食、土壤和环境，且使用成本低，很有推广价值[1]。
放线菌769的液体培养是进行放线菌769的基因组DNA 提取、遗传转化、原生质体制备以及基因克隆等遗传操作和菌种改良的基础。测定769的生长曲线，了解其生长规律，可以更有效地开发利用放线菌769。为此，笔者对放线菌769的抑菌谱、液体
·5·
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培养条件和生长、繁殖规律进行了研究，测定其生长曲线，为放线菌769的进一步开发利用奠定了重要的理论和实践基础。
1材料和方法1. 1
材料
1）菌株。以公主岭霉素产生菌769（实验室保
存）为试验菌株；以水稻稻瘟病病菌［Magnaporthe
grisea （Hebert ）Barrnov ］、大葱紫斑病病菌［Alternaria porri
（Ellis ）Cif ］、大豆灰斑病病菌（Cercospora
sojina Hara ）等病原真菌21个菌株（来自由本实验
室保存及吉林农业大学杨信东教授、高洁教授等惠赠，表1）为指示菌株。
2）培养基
液体培养基：
①胰胨豆汤（TSB ，下称）。组成成分：Oxoid 胰
胨豆汤粉（CM129）30. 0g 、蒸馏水1000ml 。
②YEME 培养基（下简称YEME ）。组成成分：Difco 酵母膏3. 0g 、Difco 蛋白胨5. 0g 、Oxoid 麦芽
膏3. 0g 、葡萄糖10. 0g 、蔗糖340. 0g 、蒸馏水1000ml 。高压灭菌后加入MgCl ·26H 2O （2. 5mol/L）
2ml/L。
③SDY 培养基（下简称SDY ）。组成成分：蛋白
胨2g 、酵母粉2g 、葡萄糖6g 、蒸馏水200ml 。pH
7. 0。
④769-1。组成成分：蛋白胨5g 、氯化钠5g 、葡
萄糖10g 、可溶性淀粉10g 。加水到1000ml 。
⑤769-2。组成成分：蛋白胨2g 、酵母粉1g 、牛
肉膏1g 、葡萄糖10g 、可溶性淀粉10g 。加水到
1000ml 。
固体培养基：
①PDA 。取去皮的马铃薯200g ，加900ml 自
来水，煮沸15～20min ，4层纱布过滤，滤液定容至
1000ml ，并在其中加入20g 葡萄糖，pH 自然，121℃灭菌。配制固体PDA 培养基时加入l . 7%的
琼脂。
②高氏1号培养基。组成成分：K 2HPO 40. 5g 、NaCl 0. 5g 、KNO 31g 、FeSO 4·7H 2O 0. 01g 、MgSO 4·7H 2O 0. 5g 、可溶性淀粉20g 、琼脂20g 、蒸馏水1000ml 。pH 7. 2～7. 4。
3）主要仪器。HZP -250型全温振荡培养箱（上
·6·
海精宏实验设备有限公司）、SHP -250型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、DHG -9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、
SW -CJ -2FD 型双人单面净化工作台（苏州净化设备
厂）、752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、XSZ -HY2型生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）。
1. 2方法
1. 2. 1
恢复培养。将在-70℃保存的菌种于冰浴中
溶解，然后用无菌接种环在高氏1号固体培养基中划线培养，于28℃恒温培养箱中培养10～13d ，使菌种复壮。
1. 2. 2抑菌谱测定。取已经培养好的病原菌菌落，加
入无菌水制成菌悬液。将菌悬液加到PDA 培养基中（55℃左右）摇匀，倒入无菌培养皿，冷却成平板。吸取公主岭霉素产生菌769发酵液10μl ，滴在平板中央。静止30min ，放入温箱，28℃下培养3～10d 。重复8次。用十字交叉法测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。
1. 2. 3最适液体培养基筛选。选用3种链霉菌常用
的液体培养基TSB 、YEME 、SDY 以及依照放线菌
769固体培养改良的液体培养基769-1、769-2，将直
径8mm 的菌饼分别接种到装有70ml 上述5种培养基的250ml 三角瓶中，置恒温摇床（28℃，180r/
min ）振荡培养72h 。取菌液30ml 于50ml 的离心
管中，12000r/min离心30min ，用0. 9%的生理盐水洗涤菌体2次，离心沉淀，并放入烘箱105℃下过夜，测定菌丝体的干重；取769培养液5μl 滴在涂有0. 1ml 浓度为106番茄炭疽杆菌的PDA 培养基的中心点，3～5d 后测量抑菌圈的直径。实验设3次重复。
1. 2. 4扩大培养及生长曲线测定。
1）菌丝生长量法：以YEME 培养基液体培养，
每12h 取样1次，分别测定菌丝体干重。以时间为横坐标，菌丝体干重为纵坐标绘制生长曲线。
2）菌液生物活性测定法：以YEME 培养基液体
培养，番茄炭疽杆菌为指示菌，每12h 取样1次，测定放线菌769的抑菌圈直径。以时间为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标绘制生长曲线。
3）比浊法：以YEME 为液体培养基，在培养条
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件不变的情况下，每隔12h 取样，以未接种的不同的差异程度，即放线菌769发酵液对所测定的
YEME 液体培养基校正752型紫外可见分光光度计
的零点，在波长600nm 处比色，测定菌液的OD600值（吸光光度值，下同）。以各时间点菌液的OD600为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制出放线菌769的生长曲线。
21种植物病原菌具有不同的抑制作用。其抑菌圈直
径平均值最高达53. 3mm ，最低为8. 0mm ，且对其中的16种病原菌抑菌圈直径在20mm 以上。按其在
α=0. 01水平上的差异显著性，可将其分为3组。其
中稻瘟病病菌、玉米大斑病病菌、高粱散黑穗病病菌与其他病原菌之间差异极显著，其抑菌圈直径均在
1. 322. 1
数据处理结果与分析
采用DPS V7. 05版数据处理系统，
Duncan 新复极差法对实验数据进行统计。
放线菌769对植物病原真菌的抑菌效果
从
45mm 以上，说明放线菌769发酵液对其抑制作用
最强。
2. 2筛选出最适液体培养基不同培养基培养条
放线菌769菌株对21种植物病原菌指示菌株的抑制效果（表1）来看，抑菌谱较广。这些病原菌分属于
件下菌丝生长量和生物活性测定结果如表2。依据统计学原理对数据进行分析，在1%差异显著性水平上，不同培养基培养的菌丝干重之间差异不显著，但以YEME 培养的菌丝生长量最大，达38. 09mg/
15属21种。在半知菌亚门、鞭毛菌亚门、子囊菌亚
门及担子菌亚门中均有分布。统计分析表明，各抑菌圈直径均值在5%显著及1%极显著水平上均有着
表1
序号
病原菌名称玉米弯孢病病菌高粱豹纹病病菌番茄早疫病病菌黄瓜黑星病病菌番茄叶霉病病菌烟草赤星病病菌葡萄霜霉病病菌葱紫斑病病菌玉米穗腐病病菌辣椒黑斑病病菌高粱散黑穗病病菌小麦赤霉病病菌玉米大斑病病菌大豆灰斑病病菌番茄炭疽病病菌番茄灰霉病病菌大豆霜霉病病菌稻瘟病病菌大豆根腐病病菌
ml ；不同培养条件下的生物活性，各培养基之间具有
放线菌769发酵液抑菌谱拉
丁
名
称
抑菌圈直径（mm ）
差异显著性
[***********][1**********]
Curvularia lunata (Walk)Boed. Gloeocercospora sorghi Bain. et Edg. Alternaria solani (Ell.Martin) Sor. Cladosporium cucumerinum Ell. et Arth. Fulvia fulva (Cooke)Ciferri
Alternaria longipes (Ell.et Ev.) Tisdale et Wadk. Plasmopara viticola (Berk.et Curt.) Berl et de Toni Alternaria porri (Ellis)Cif Gibberella zeae
Alternaria alternata (Fr.)Kerssl Sphacelotheca cruenta (Kuhn)Potter Fusarium graminearum Schw.
Exserohilium turcicum (Pass.)Leonay et Suggs Cercospora sojina Hara
Colletotrichum coccodes (Wallr.)Hughes Botrytis cinerea Pers.
Peronospora manschurica (Naum)Syd. Pyricularia grisea (Hebert)Barrnov Fusarium oxysporum Schlecht Pseudocercospora ellacapsella
24.9±0.4722.7±0.2322.7±0.2518.3±0.238.7±0.2918.2±0.1728.4±0.80127.0±0.3330.2±0.8930.6±0.7125.4±0.3948.1±1.2629.2±0.5148.9±0.5128.3±0.4130.1±0.7922.7±0.2620.5±0.3353.3±0.968.0±0.0011.3±0.398.0±0.008.0±0.00
f G g H g H i J k L i J de CDE e EF c CD c C f FG b B cd CD B B De DE c CD g H H I a A k L j K k L K L
2021
白菜白斑病病菌茄腐鐮刀病病菌
Cercosporella albo -macuoans (Ell.et Ev.) Sacc. Fusarinm solani
注：抑菌圈直径=均值±标准误。
·7·
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表2液体培养基
种类
不同培养条件下菌丝的生长量和生物活性
菌丝干重（mg/ml）
抑菌圈直径（mm ）
769-1769-2TSB YEME SDY
12.17±3.07a A 27.02±8.39a A 26.88±9.15a A 38.09±12.41a A 24.19±8.32a A
39.67±0.33b AB 43.33±0.88a A 33.00±1.53c C 43.00±0.58a A 36.67±1.20b BC
显著的差异，而又以YEME 及769-2的抑菌圈直径最大，分别为43. 00mm 和43. 33mm ，极显著高于其他培养条件。综合菌丝生长量和菌液生物学活性2项指标，YEME 为放线菌769液体培养的最佳培养基。
2. 32. 3. 1
测定出放线菌769生长曲线
放线菌769培养时间与菌体生长量的关系。
由于769菌体细胞进入新的环境需要一段时间的调节和适应，因此，开始时的0～36h 菌体处于生长的迟缓期（延滞期）。尔后，在36～84h 时间段内菌体干重开始以恒定的几何级数增长，菌体处于对数生长期。84h 时菌体生长量达到最大值，为16. 43mg/ml。此阶段菌体的形态、染色性、生理活性等都较典型，对外界环境因素的作用敏感。因此，进行遗传操作也多选用此时期的菌体。84h 后菌体生长趋于稳定，开始进入稳定期和衰亡期。84h 菌体干重处于下降趋势，这可能是由于菌量较小，称量操作存在一定的误差所致（图1，表3）。
到84h 时放线菌769菌体数目达到最高值，而颉颃作用在96h 时达到最大，从96h 后有下降趋势。但是，仍维持较高的颉颃能力。说明放线菌769产生抑菌活性物质是在其对数生长末期开始进入较高水平，在96h 时达到最高峰，随后进入稳定的较高水平的产放线菌活性物质的持续期。
综合以上的实验数据，放线菌769液体培养的生长曲线：0～36h 为迟缓期；36～84h 为对数期；84～
2. 3. 2放线菌769培养时间与产颉颃活性物质的关
系。在放线菌769培养过程中，每隔12h 取样测定其OD600值，测定结果如图2、表3。同时测定菌液对番茄炭疽病病菌的抑菌情况，测定结果如图3、表
3。随着放线菌769培养时间的延长，菌液的混浊度
逐渐加深。从12h 开始，菌液的抑菌作用逐渐增强，
108h 为稳定期；108h 后为衰亡期。2. 4
不同时间段放线菌769液体培养特征
从开
始起，每隔12h 取样用XSZ -HY2型生物显微镜观察菌丝体形态。结果表明，在YEME 培养36h 的孢子为卵圆形或圆形。培养60h 的孢子已长成菌丝体，并开始繁殖，大多数放线菌（如链霉菌属）生长到一定阶段，一部分气生菌丝形成孢子丝，孢子丝成熟便分化形成许多孢子，称为分生孢子。培养72h 的菌丝体已基本成熟，长出了很多孢子丝，并分化形成了许多孢子，此时菌丝体处在分裂的对数生长期。培养96h 后的769菌丝体圆形的孢子已经很少，
都已
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表3
菌体培养时间（h ）
放线菌769不同培养时间菌丝的生长量变化
菌体浑浊度（OD 值）
抑菌圈直径（mm ）
本研究用比浊法、称取菌丝体干重法、测抑菌圈直径等方法测定的放线菌769生长曲线和生物活性，变化趋势基本一致。研究结果表明，放线菌769生长的迟缓期为0～36h ，对数生长期为
菌丝干重（mg/ml）
[***********]8120
0.00±0.00d C 0.00±0.00d C 0.13±0.09d C 1.80±0.21d C 2.37±0.12cd C 7.37±1.23b BC 16.43±4.83a A 13.43±1.88a AB 11.00±0.75ab AB 13.87±0.96a AB
0.04±0.00g G 0.01±0.00g G 0.03±0.00g G 0.21±0.01f F 0.84±0.04e E 1.33±0.04d D 1.67±0.03c C 1.88±0.04b B 2.02±0.04a A 2.08±0.02a A
0.00±0.00e F 22.67±1.45d E 27.00±1.53c CD 26.67±0.67c D 30.33±0.33b BCD 31.67±0.33b B 32.00±1.15b B 37.33±0.67a A 30.67±0.88b BC 31.00±0.58b B
36～84h ，之后进入稳定期和衰退
期。在对细菌进行各种特性的比较研究时，这条曲线有助于选定生长状态一致的细菌，一般选择对数生长期末、稳定期初始阶段的细菌。因为，此阶段的细菌无论
长成了成熟的菌丝体，分裂已经几乎处于停滞状态，进入稳定期。
从生物学特性以及代谢活性上都是最典型的，这样就可使实验结果更可靠。在对放线菌769进行研究时，一般选取培养72～84h 的培养物。放线菌769生长比较缓慢，其液体培养基和培养条件的研究有待进一步改进，以缩短培养时间，更便于对放线菌769进行研究。
对放线菌769的育种工作目前主要集中在诱变育种和基因工程育种上。为了进一步提高放线菌
3讨论
放线菌769对多种植物病原真菌具有广谱的抑
制活性。不同病原菌种类对其敏感性有一定的差异。对水稻稻瘟病病菌、玉米大斑病病菌、高粱散黑穗病病菌、玉米穗腐病病菌、葱紫斑病病菌、番茄炭疽病病菌等16种植物病原真菌均有明显抑制效果，是1个很有发展前景的抗生素，可进一步研究作为广谱杀菌剂应用于农业生产。
生长曲线是细菌在培养中所表现出来的生长和繁殖的规律。同一种细菌在不同的培养条件下，其生长曲线和菌体活力也不同[2]。YEME 是放线菌769液体培养的最佳培养基，培养96h 菌液的生物活性最强，与769发酵培养的72h （未发表）有显著差异。
769的抑菌效果和产素能力，高产菌株的选育也应
是今后工作的重点。参考文献：
［1］［2］
胡吉成. 公主岭霉素的研究［M ］∥岳德荣主编. 胡吉成文集. 长春：吉林科学技术出版社，2006：395. 魏曦. 钩端螺旋体病学［M ］. 北京：人民卫生出版社，
1982：118～127，470～471.
∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥
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环球信息
本刊讯
技术推广服务中心与拜耳作物科学（中国）有限公司在北京共同签署了“科学安全用药防控农业病虫害”合作框架协议。协议内容包括水稻重大病虫害抗性监测与安全用药、柑橘黄龙病疫情传毒媒介———柑橘木虱防控应用技术、马铃薯和保护地蔬菜病虫害
。。。。
全国农业技术推广服务中心与拜耳作物科学
有限公司签署合作框架协议
2010年6月22日，农业部全国农业
全程解决方案等3个项目。协议的签署将有助于进一步普及和推广科学安全用药技术，有效防控病虫害，以期达到保障农业丰收、农产品质量安全、农民增收、环境保护的目的。全国农业技术推广服务中心副主任钟天润与拜耳作物科学大中华区国家经理戴思成先生代表双方在合作协议书上签字。
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（1. 吉林农业大学，吉林长春
摘要：离体抑菌实验表明，放线菌769对植物病原真菌具有广谱的抑制活性。不同种类病原菌对其敏感性有一定的差异。对水稻稻瘟病病菌、玉米大斑病病菌、高粱散黑穗病病菌、玉米穗腐病病菌、葱紫斑病病菌、番茄炭疽病病菌等16种植物病原真菌均有明显抑制效果。同时，首次对放线菌769的液体培养条件进行了探索，通过比浊法、测菌丝体干重法、抑菌圈直径等方法，测定了放线菌769的生长曲线。其在YEME 培养基中摇床振荡培养时的生长曲线，0～36h 为生长延迟期，36～84h 为对数生长期，84～108h 为稳定期，108h 以后为衰亡期。关键词：放线菌769；抑菌谱；液体培养；生长曲线中图分类号：S482.7
文献标识码：A
文章编号：1672-6820（2010）07-0005-05
ZHANG Hong -dan 1，2, DU Qian 2, ZHANG Zheng -kun 2, XU Wen -jing 2, CHEN Guang 1, LI Qi -yun 2
（1. Jilin Agricultural University ，Changchun Jilin, 130000，China; 2. Institute of Plant Protection ，Jilin Academy of A -
gricultural Sciences ，Changchun Jilin ，130124，China ）
Abstract:Based on experiments in vitro, actinomycin 769had inhibitory activity on plant pathogenic fungi with different sensibilities, and had significant inhibitory effect on 16plant pathogenic fungi species, such as Magonaporthe grisea and so on. Liquid culture of actinomycin 769was studied for the first time, and growth curve was determined by its nephelometery and the measurement of mycelium dry weight and bacteriostasis -diameter. The growth curve of shaking cultivation in YEME was lag phase in 0~36h ，log phase in 36~84h ，stationary phase in 84~108h and decline phase after 108h. Key words:actinomycin 769; inhibitory spectrum; liquid culture; growth curve
放线菌769由吉林省农科院专家1967年从公主岭土壤中分离筛选得到，经中国科学院微生物所阮继生研究员对其进行鉴定，并定名为不吸水链霉菌公主岭新变种（Streptomyces ahygroscopicus n . var .
gongzhulingensis Ruan et zhang ）。其所产生的抗生素
被称为公主岭霉素，是一种自然生物合成的混合制剂，也是我国目前仅有的正式登记的9种农用抗生素类杀菌剂之一。公主岭霉素的1个独特的优点是
收稿日期：2010-06-03作者简介：张红丹（1986-通讯作者：杜茜（1979-），女，硕士研究生，研究方向为微生物分子生物学。E -mail ：zhanghongdan . 0000@163. com
），女，硕士，河北宣化人，助理研究员，研究方向为生物农药。E -mail ：dqzjk@163. com 。李启云（1974-），男，博士，
研究员。研究方向为生物农药及微生物分子生物学。E -mail ：qyli@cjaas. com 。
!!!"
放线菌769抑菌谱及液体培养
生长曲线的测定
张红丹，杜
1，2
! ! ! "
茜，张正坤，徐文静，陈
222
光，李启云
12
130000；2. 吉林省农科院植物保护研究所，吉林长春130124）
Determination of actinomycin 769inhibitory spectrum
and liquid culture growth curve
对人、畜毒性低。在全国大面积应用过程中，未发现任何中毒事故，不污染粮食、土壤和环境，且使用成本低，很有推广价值[1]。
放线菌769的液体培养是进行放线菌769的基因组DNA 提取、遗传转化、原生质体制备以及基因克隆等遗传操作和菌种改良的基础。测定769的生长曲线，了解其生长规律，可以更有效地开发利用放线菌769。为此，笔者对放线菌769的抑菌谱、液体
·5·
2010年第7期
CHINA PLANT PROTECTION 2010, Vol ．30．No ．
7
培养条件和生长、繁殖规律进行了研究，测定其生长曲线，为放线菌769的进一步开发利用奠定了重要的理论和实践基础。
1材料和方法1. 1
材料
1）菌株。以公主岭霉素产生菌769（实验室保
存）为试验菌株；以水稻稻瘟病病菌［Magnaporthe
grisea （Hebert ）Barrnov ］、大葱紫斑病病菌［Alternaria porri
（Ellis ）Cif ］、大豆灰斑病病菌（Cercospora
sojina Hara ）等病原真菌21个菌株（来自由本实验
室保存及吉林农业大学杨信东教授、高洁教授等惠赠，表1）为指示菌株。
2）培养基
液体培养基：
①胰胨豆汤（TSB ，下称）。组成成分：Oxoid 胰
胨豆汤粉（CM129）30. 0g 、蒸馏水1000ml 。
②YEME 培养基（下简称YEME ）。组成成分：Difco 酵母膏3. 0g 、Difco 蛋白胨5. 0g 、Oxoid 麦芽
膏3. 0g 、葡萄糖10. 0g 、蔗糖340. 0g 、蒸馏水1000ml 。高压灭菌后加入MgCl ·26H 2O （2. 5mol/L）
2ml/L。
③SDY 培养基（下简称SDY ）。组成成分：蛋白
胨2g 、酵母粉2g 、葡萄糖6g 、蒸馏水200ml 。pH
7. 0。
④769-1。组成成分：蛋白胨5g 、氯化钠5g 、葡
萄糖10g 、可溶性淀粉10g 。加水到1000ml 。
⑤769-2。组成成分：蛋白胨2g 、酵母粉1g 、牛
肉膏1g 、葡萄糖10g 、可溶性淀粉10g 。加水到
1000ml 。
固体培养基：
①PDA 。取去皮的马铃薯200g ，加900ml 自
来水，煮沸15～20min ，4层纱布过滤，滤液定容至
1000ml ，并在其中加入20g 葡萄糖，pH 自然，121℃灭菌。配制固体PDA 培养基时加入l . 7%的
琼脂。
②高氏1号培养基。组成成分：K 2HPO 40. 5g 、NaCl 0. 5g 、KNO 31g 、FeSO 4·7H 2O 0. 01g 、MgSO 4·7H 2O 0. 5g 、可溶性淀粉20g 、琼脂20g 、蒸馏水1000ml 。pH 7. 2～7. 4。
3）主要仪器。HZP -250型全温振荡培养箱（上
·6·
海精宏实验设备有限公司）、SHP -250型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、DHG -9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、
SW -CJ -2FD 型双人单面净化工作台（苏州净化设备
厂）、752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、XSZ -HY2型生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）。
1. 2方法
1. 2. 1
恢复培养。将在-70℃保存的菌种于冰浴中
溶解，然后用无菌接种环在高氏1号固体培养基中划线培养，于28℃恒温培养箱中培养10～13d ，使菌种复壮。
1. 2. 2抑菌谱测定。取已经培养好的病原菌菌落，加
入无菌水制成菌悬液。将菌悬液加到PDA 培养基中（55℃左右）摇匀，倒入无菌培养皿，冷却成平板。吸取公主岭霉素产生菌769发酵液10μl ，滴在平板中央。静止30min ，放入温箱，28℃下培养3～10d 。重复8次。用十字交叉法测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。
1. 2. 3最适液体培养基筛选。选用3种链霉菌常用
的液体培养基TSB 、YEME 、SDY 以及依照放线菌
769固体培养改良的液体培养基769-1、769-2，将直
径8mm 的菌饼分别接种到装有70ml 上述5种培养基的250ml 三角瓶中，置恒温摇床（28℃，180r/
min ）振荡培养72h 。取菌液30ml 于50ml 的离心
管中，12000r/min离心30min ，用0. 9%的生理盐水洗涤菌体2次，离心沉淀，并放入烘箱105℃下过夜，测定菌丝体的干重；取769培养液5μl 滴在涂有0. 1ml 浓度为106番茄炭疽杆菌的PDA 培养基的中心点，3～5d 后测量抑菌圈的直径。实验设3次重复。
1. 2. 4扩大培养及生长曲线测定。
1）菌丝生长量法：以YEME 培养基液体培养，
每12h 取样1次，分别测定菌丝体干重。以时间为横坐标，菌丝体干重为纵坐标绘制生长曲线。
2）菌液生物活性测定法：以YEME 培养基液体
培养，番茄炭疽杆菌为指示菌，每12h 取样1次，测定放线菌769的抑菌圈直径。以时间为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标绘制生长曲线。
3）比浊法：以YEME 为液体培养基，在培养条
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件不变的情况下，每隔12h 取样，以未接种的不同的差异程度，即放线菌769发酵液对所测定的
YEME 液体培养基校正752型紫外可见分光光度计
的零点，在波长600nm 处比色，测定菌液的OD600值（吸光光度值，下同）。以各时间点菌液的OD600为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制出放线菌769的生长曲线。
21种植物病原菌具有不同的抑制作用。其抑菌圈直
径平均值最高达53. 3mm ，最低为8. 0mm ，且对其中的16种病原菌抑菌圈直径在20mm 以上。按其在
α=0. 01水平上的差异显著性，可将其分为3组。其
中稻瘟病病菌、玉米大斑病病菌、高粱散黑穗病病菌与其他病原菌之间差异极显著，其抑菌圈直径均在
1. 322. 1
数据处理结果与分析
采用DPS V7. 05版数据处理系统，
Duncan 新复极差法对实验数据进行统计。
放线菌769对植物病原真菌的抑菌效果
从
45mm 以上，说明放线菌769发酵液对其抑制作用
最强。
2. 2筛选出最适液体培养基不同培养基培养条
放线菌769菌株对21种植物病原菌指示菌株的抑制效果（表1）来看，抑菌谱较广。这些病原菌分属于
件下菌丝生长量和生物活性测定结果如表2。依据统计学原理对数据进行分析，在1%差异显著性水平上，不同培养基培养的菌丝干重之间差异不显著，但以YEME 培养的菌丝生长量最大，达38. 09mg/
15属21种。在半知菌亚门、鞭毛菌亚门、子囊菌亚
门及担子菌亚门中均有分布。统计分析表明，各抑菌圈直径均值在5%显著及1%极显著水平上均有着
表1
序号
病原菌名称玉米弯孢病病菌高粱豹纹病病菌番茄早疫病病菌黄瓜黑星病病菌番茄叶霉病病菌烟草赤星病病菌葡萄霜霉病病菌葱紫斑病病菌玉米穗腐病病菌辣椒黑斑病病菌高粱散黑穗病病菌小麦赤霉病病菌玉米大斑病病菌大豆灰斑病病菌番茄炭疽病病菌番茄灰霉病病菌大豆霜霉病病菌稻瘟病病菌大豆根腐病病菌
ml ；不同培养条件下的生物活性，各培养基之间具有
放线菌769发酵液抑菌谱拉
丁
名
称
抑菌圈直径（mm ）
差异显著性
[***********][1**********]
Curvularia lunata (Walk)Boed. Gloeocercospora sorghi Bain. et Edg. Alternaria solani (Ell.Martin) Sor. Cladosporium cucumerinum Ell. et Arth. Fulvia fulva (Cooke)Ciferri
Alternaria longipes (Ell.et Ev.) Tisdale et Wadk. Plasmopara viticola (Berk.et Curt.) Berl et de Toni Alternaria porri (Ellis)Cif Gibberella zeae
Alternaria alternata (Fr.)Kerssl Sphacelotheca cruenta (Kuhn)Potter Fusarium graminearum Schw.
Exserohilium turcicum (Pass.)Leonay et Suggs Cercospora sojina Hara
Colletotrichum coccodes (Wallr.)Hughes Botrytis cinerea Pers.
Peronospora manschurica (Naum)Syd. Pyricularia grisea (Hebert)Barrnov Fusarium oxysporum Schlecht Pseudocercospora ellacapsella
24.9±0.4722.7±0.2322.7±0.2518.3±0.238.7±0.2918.2±0.1728.4±0.80127.0±0.3330.2±0.8930.6±0.7125.4±0.3948.1±1.2629.2±0.5148.9±0.5128.3±0.4130.1±0.7922.7±0.2620.5±0.3353.3±0.968.0±0.0011.3±0.398.0±0.008.0±0.00
f G g H g H i J k L i J de CDE e EF c CD c C f FG b B cd CD B B De DE c CD g H H I a A k L j K k L K L
2021
白菜白斑病病菌茄腐鐮刀病病菌
Cercosporella albo -macuoans (Ell.et Ev.) Sacc. Fusarinm solani
注：抑菌圈直径=均值±标准误。
·7·
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表2液体培养基
种类
不同培养条件下菌丝的生长量和生物活性
菌丝干重（mg/ml）
抑菌圈直径（mm ）
769-1769-2TSB YEME SDY
12.17±3.07a A 27.02±8.39a A 26.88±9.15a A 38.09±12.41a A 24.19±8.32a A
39.67±0.33b AB 43.33±0.88a A 33.00±1.53c C 43.00±0.58a A 36.67±1.20b BC
显著的差异，而又以YEME 及769-2的抑菌圈直径最大，分别为43. 00mm 和43. 33mm ，极显著高于其他培养条件。综合菌丝生长量和菌液生物学活性2项指标，YEME 为放线菌769液体培养的最佳培养基。
2. 32. 3. 1
测定出放线菌769生长曲线
放线菌769培养时间与菌体生长量的关系。
由于769菌体细胞进入新的环境需要一段时间的调节和适应，因此，开始时的0～36h 菌体处于生长的迟缓期（延滞期）。尔后，在36～84h 时间段内菌体干重开始以恒定的几何级数增长，菌体处于对数生长期。84h 时菌体生长量达到最大值，为16. 43mg/ml。此阶段菌体的形态、染色性、生理活性等都较典型，对外界环境因素的作用敏感。因此，进行遗传操作也多选用此时期的菌体。84h 后菌体生长趋于稳定，开始进入稳定期和衰亡期。84h 菌体干重处于下降趋势，这可能是由于菌量较小，称量操作存在一定的误差所致（图1，表3）。
到84h 时放线菌769菌体数目达到最高值，而颉颃作用在96h 时达到最大，从96h 后有下降趋势。但是，仍维持较高的颉颃能力。说明放线菌769产生抑菌活性物质是在其对数生长末期开始进入较高水平，在96h 时达到最高峰，随后进入稳定的较高水平的产放线菌活性物质的持续期。
综合以上的实验数据，放线菌769液体培养的生长曲线：0～36h 为迟缓期；36～84h 为对数期；84～
2. 3. 2放线菌769培养时间与产颉颃活性物质的关
系。在放线菌769培养过程中，每隔12h 取样测定其OD600值，测定结果如图2、表3。同时测定菌液对番茄炭疽病病菌的抑菌情况，测定结果如图3、表
3。随着放线菌769培养时间的延长，菌液的混浊度
逐渐加深。从12h 开始，菌液的抑菌作用逐渐增强，
108h 为稳定期；108h 后为衰亡期。2. 4
不同时间段放线菌769液体培养特征
从开
始起，每隔12h 取样用XSZ -HY2型生物显微镜观察菌丝体形态。结果表明，在YEME 培养36h 的孢子为卵圆形或圆形。培养60h 的孢子已长成菌丝体，并开始繁殖，大多数放线菌（如链霉菌属）生长到一定阶段，一部分气生菌丝形成孢子丝，孢子丝成熟便分化形成许多孢子，称为分生孢子。培养72h 的菌丝体已基本成熟，长出了很多孢子丝，并分化形成了许多孢子，此时菌丝体处在分裂的对数生长期。培养96h 后的769菌丝体圆形的孢子已经很少，
都已
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表3
菌体培养时间（h ）
放线菌769不同培养时间菌丝的生长量变化
菌体浑浊度（OD 值）
抑菌圈直径（mm ）
本研究用比浊法、称取菌丝体干重法、测抑菌圈直径等方法测定的放线菌769生长曲线和生物活性，变化趋势基本一致。研究结果表明，放线菌769生长的迟缓期为0～36h ，对数生长期为
菌丝干重（mg/ml）
[***********]8120
0.00±0.00d C 0.00±0.00d C 0.13±0.09d C 1.80±0.21d C 2.37±0.12cd C 7.37±1.23b BC 16.43±4.83a A 13.43±1.88a AB 11.00±0.75ab AB 13.87±0.96a AB
0.04±0.00g G 0.01±0.00g G 0.03±0.00g G 0.21±0.01f F 0.84±0.04e E 1.33±0.04d D 1.67±0.03c C 1.88±0.04b B 2.02±0.04a A 2.08±0.02a A
0.00±0.00e F 22.67±1.45d E 27.00±1.53c CD 26.67±0.67c D 30.33±0.33b BCD 31.67±0.33b B 32.00±1.15b B 37.33±0.67a A 30.67±0.88b BC 31.00±0.58b B
36～84h ，之后进入稳定期和衰退
期。在对细菌进行各种特性的比较研究时，这条曲线有助于选定生长状态一致的细菌，一般选择对数生长期末、稳定期初始阶段的细菌。因为，此阶段的细菌无论
长成了成熟的菌丝体，分裂已经几乎处于停滞状态，进入稳定期。
从生物学特性以及代谢活性上都是最典型的，这样就可使实验结果更可靠。在对放线菌769进行研究时，一般选取培养72～84h 的培养物。放线菌769生长比较缓慢，其液体培养基和培养条件的研究有待进一步改进，以缩短培养时间，更便于对放线菌769进行研究。
对放线菌769的育种工作目前主要集中在诱变育种和基因工程育种上。为了进一步提高放线菌
3讨论
放线菌769对多种植物病原真菌具有广谱的抑
制活性。不同病原菌种类对其敏感性有一定的差异。对水稻稻瘟病病菌、玉米大斑病病菌、高粱散黑穗病病菌、玉米穗腐病病菌、葱紫斑病病菌、番茄炭疽病病菌等16种植物病原真菌均有明显抑制效果，是1个很有发展前景的抗生素，可进一步研究作为广谱杀菌剂应用于农业生产。
生长曲线是细菌在培养中所表现出来的生长和繁殖的规律。同一种细菌在不同的培养条件下，其生长曲线和菌体活力也不同[2]。YEME 是放线菌769液体培养的最佳培养基，培养96h 菌液的生物活性最强，与769发酵培养的72h （未发表）有显著差异。
769的抑菌效果和产素能力，高产菌株的选育也应
是今后工作的重点。参考文献：
［1］［2］
胡吉成. 公主岭霉素的研究［M ］∥岳德荣主编. 胡吉成文集. 长春：吉林科学技术出版社，2006：395. 魏曦. 钩端螺旋体病学［M ］. 北京：人民卫生出版社，
1982：118～127，470～471.
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环球信息
本刊讯
技术推广服务中心与拜耳作物科学（中国）有限公司在北京共同签署了“科学安全用药防控农业病虫害”合作框架协议。协议内容包括水稻重大病虫害抗性监测与安全用药、柑橘黄龙病疫情传毒媒介———柑橘木虱防控应用技术、马铃薯和保护地蔬菜病虫害
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全国农业技术推广服务中心与拜耳作物科学
有限公司签署合作框架协议
2010年6月22日，农业部全国农业
全程解决方案等3个项目。协议的签署将有助于进一步普及和推广科学安全用药技术，有效防控病虫害，以期达到保障农业丰收、农产品质量安全、农民增收、环境保护的目的。全国农业技术推广服务中心副主任钟天润与拜耳作物科学大中华区国家经理戴思成先生代表双方在合作协议书上签字。
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