第４７卷第１期２００８年１月
农 药
AGROCHEMICALS
Vol. 47, No. 1Jan. 2008
综述农药人工抗原合成方法的设计与优选
贲亚琍１，２，朱德锐１，刘德立１，３
（１．华中师范大学 生命科学学院，武汉 ４３００７９； ２．江汉大学， 武汉 ４３００１６；
３．农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉 ４３００７９）
摘要：农药人工抗原的合成直接影响后期制备抗体的质量，对于建立农药分子特异、灵敏的免疫分析方法具有关键性作用。 综述了国内外农药人工抗原合成过程中的农药分子半抗原的设计原则、合成方法，人工抗原的设计、优选及影响因素等方面的研究进展。 并对农药残留免疫分析技术存在的问题和应用前景进行了讨论。
关键词：农药；人工抗原；合成方法；设计；优选
中图分类号：ＴＱ４６０．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００６－０４１３（２００８）０１－００１０－０５
Design and Selection of Synthesis Methods of Artificial
Antigens for Pesticides
BEN Ya-li 1,2, ZHU De-rui1, LIU De-li1,3
(1.College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China; 2.Jianghan University, Wuhan 430016, China;
3.Key Laboratory of Pesticide & Chemical Biology, Ministry of Education, Wuhan 430079, China)
Abstract: The synthesis on artificial antigens of pesticides directly influences the quality of the antibodies, and iscritical in the format of particular and sensitive immunology assay. The progress of the principle and synthesis
methods of haptens were introduced in this paper. Furthermore, the design and selection of synthesis methods ofartificial antigens and the influencing factors of the synthesis of haptens were introduced. Some questions and the newperspective of the immunoassay for pesticide residues were also discussed.Key words: pesticides; artificial antigens; synthesis methods; design; selection
农药残留已成为近年来威胁百姓餐桌安全的“隐形杀手”，而且殃及农产品出口，且有愈演愈烈之势。传统的农药残留分析方法包括气相色谱、液相色谱、质谱、薄层层析等，这些方法需要复杂昂贵的仪器，而且需要经过繁琐的前处理，专门的操作人员，很难达到快速、简便的现场检测要求。 酶免疫分析是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用原理有机结合起来的一种免疫分析技术，是一种简便、灵敏、经济的快速检测方法，在现场筛选和大量样本的快速监测中显示其独特的优势。 大多数农药是小分子物质（分子质量小于１ ０００），本身不具有诱导产生抗体的能力，必须设法先将农药小分子与载体蛋白质偶联制备出农药人工完全抗原，这是农药酶免疫分析的关键所在，如合适中间体、活性官能团引入位点的选择、半抗原产物的分离纯化、偶联臂的长短、半抗原与载体分子的偶联比等
［１］
从中获得了一些规律。
１ 半抗原的分子设计与合成
选定农药待测物后，如果待测物本身具有活性基团（－ＣＯＯＨ，－ＮＨ２，－ＯＨ等），一部分可直接与大分子载体（常用蛋白质）进行偶联或通过连接臂与载体偶联，制备人工抗原；对于待测物本身没有可直接与载体共价连接的基团，或虽有活性基团但这些基团对维系待测物的免疫特性和特征结构十分重要，或直接与大分子载体连接后半抗原的特征结构易受载体的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别等这些情况，则必须根据分析的目的和免疫学理论，重新设计、合成模拟原待测物的半抗原。 半抗原设计的总体原则：在尽可能保留原待测物特征结构的前提下，在适当的位置引入合适的连接臂和活性基团。 此外，农药分子的自身结构应有一定的复杂性，如具有分支结构、苯环或杂环结构等高免疫活性的基团，否则难以产生抗体或产生的抗体效价较低。 有研究报道，如果半抗原分子具有苯环则制备抗体的成功率为１／３，而不含苯环则成功率为１／１１［２］。
。
因此，农药人工抗原的分子设计、合成以及农药人工抗原的优选将直接影响能否制备出高质量的抗体。 本文对国内外农药人工抗原合成中的相关难点进行了综述，
收稿日期：２００７－０９－１２，修返日期：２００７－１０－１８基金项目：湖北省自然科学基金资助（Ｎｏ．２００６ＡＢＡ１９７）
作者简介：贲亚琍（１９６６－），女，黑龙江人，副教授，博士生，主要研究方向为农药生物化学。 Ｅ－ｍａｉｌ ：ｂ＿ｙ＿ｌ＠ｊｈｕｎ．ｅｄｕ．ｃｎ。通讯作者：刘德立，男，华中师范大学生命科学学院教授。
第１期
１．１ 直接对农药分子的原药进行衍生化图１ 毒死蜱人工抗原的合成路线
利用待测物现有结构，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团。 １）对其分子进行改造使分子内产生羧基基团。 见图１，农药毒死蜱人工抗原的合成就是在它的吡啶环上第６位Ｃｌ原子易通过亲核取代反应被取代，从而引入羧基基团［３］。 通过Ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ Ｏｘｉｍｅ（ＭＩＬＯ）肟羟基与琥珀酸酐反应，合成了半抗原ＭＩＬＯ－５－琥珀酰半酯［４］，氯菊酯结构中靠近三元环的双键可以通过氧化为羧酸。 禾草灵结构中含有羧酸甲酯，氟虫腈的结构中含有－ＣＮ，
均可通过水解引入－ＣＯＯＨ［５－６］
。 ２）对其分子进行
改造使分子内产生氨基基团。 有机磷类农药如对硫磷［７］、甲基对硫磷［８－９］（见图２）、杀螟硫磷［１０］、拟除虫菊酯其苯环结构中均有－ＮＯ２，
可通过还原为－ＮＨ２后直接偶联。图２ 甲基对硫磷半抗原的合成
１．２ 利用农药分子降解产物或中间产物合成半抗原
克百威半抗原的合成中，先用呋喃酚作为反应原料和光气反应得２，３－二氢－２，２－二甲基－７－苯并呋喃基氯甲酸酯，然后利用４－氨基丁酸和６－氨基己酸和该产物反应得到了克百威的两种活性半抗原：ＢＦＮＨ和ＢＦＮＢ［１１］
（见图３）。
１１
对硫磷半抗原的合成中，以对硫磷的自然降解产物中的一类主要产物—对氨基对硫磷作为半抗原，运用人工方法把对硫磷降解为氨基对硫磷，使硝基变为氨基［１２］。 杀菌剂丁苯吗啉［１３］的代谢产物丁苯吗啉酸可直接用于偶联。 也可用结构类似物作先导物，对其进行改造，得到需要的半抗原，如在哒螨灵半抗原合成中，用哒螨灵的结构类似物半琥珀酸胆固醇为先导物合成含有活性基团的半抗原［１４］。
从农药分子生产过程的中间产物中选取化合物合成半抗原。 如用有机磷农药中间产物二乙基硫代磷和对甲基
苯丁酸为原料，经水解、酯化作用合成了半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］硫代磷酸酯［１５］。
１．３ 由原料重新合成半抗原
在合成过程中选择适当步骤用一个有反应功能团的分子参与反应，从而合成出有反应功能团的半抗原分子。如三唑磷半抗原的合成，是以三氯硫磷、苯唑醇、巯基丙酸为原料，通过３步反应合成三唑磷半抗原６－［Ｏ－乙基－Ｏ－（１－苯基－１，２，４－三唑－３－基）硫代磷酰胺基］己酸（Ш）［１６］，其合成路线见图４。
１２农 药 AGROCHEMICALS第４７卷
叉反应，因此设计的“簇半抗原”中必须含有有机磷农药的母核。
陈林等选用有机磷农药中毒性大、数量多、使用广泛的Ｏ，Ｏ－二乙基硫代磷酸基团为母核，合成了簇半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］硫代磷酸酯［１５］（见图５）。 薛小平等合成了两种有机磷农药“簇半抗原”［１９］
，但对于“簇半抗原”与“簇抗体”的关系还没有弄清楚，所得抗体效价和亲和力不高。 国外报道这方面的研究起步较早，如Ｂａｎｋｓ等相继合成几种有机磷农药“簇半抗原”，并制备出“簇多克隆抗体”，其中有的“簇多克隆抗体”已经应用于有机磷农药多残留的检测中，但有的抗体检测限较高，亲和力不够［２０－２１］。 目前理想的“簇抗原”的结构还处于探索阶段，与“簇抗体”的关系还需进一步研究。
图５ 簇半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］
硫代磷酸酯的合成
１．５ 半抗原中特征基团的保护
为了保护待测物的特征结构部分和官能团，在待测物衍生化制备半抗原时对某些活性基团进行选择性保护和去保护是常用的合成手段。 如上述半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］硫代磷酸酯（ＰＳＥ）的合成中［１５］，就是用对甲氧基苯丁酸与４８％氢溴酸反应生成４－（４－羟基苯基）丁酸，然后与叔丁基二甲基氯硅烷反应形成硅烷酯以保护羧基，再与二乙基硫代磷酰氯发生酯化反应，最后加入适量盐酸，水解脱去保护基团即可得到目标产物。
２ 人工抗原的合成与优选
２．１ 连接臂的选择
现已公认一定长度的间隔臂的引入可使半抗原突出于载体表面，易为机体免疫系统识别，使产生针对半抗原的抗体的可能性增加。 在选择间隔臂时应注意以下几点：一是太长的间隔臂会因氢键或疏水作用导致半抗原分子发生折叠，反而使半抗原与载体蛋白靠近，导致载体蛋白屏蔽其特征基团；
而太短的间隔臂会因载体的空间位阻影响
免疫系统对半抗原的识别。 因此，一些研究者认为最佳的间隔臂是中等尺度，即３￣６碳原子［２２］，但是这种观点还有待进一步证实。 二是不要用吸电子基团或杂环作间隔臂，间隔臂应为非极性。
２．２ 载体的选择
现在一般均选择蛋白质作为大分子载体，常见的有牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、鸡卵清蛋白（ＯＶＡ）、钥孔血蓝蛋白（ＫＬＨ）、兔血清白蛋白（ＲＳＡ）、人血清白蛋白（ＨＳＡ）等。 目前，用的最多的是牛血清白蛋白（ＢＳＡ），因为其物化性质稳定、不易变性、价廉易得，而且其赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的ｐＨ和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂（如吡啶、ＤＭＦ等）的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态。 近年来，也有报道用人工合成多聚肽（常用多聚赖氨酸ＰＬＬ）为载体，其优点是可增加半抗原的免疫原性。
２．３ 半抗原与载体的偶联
有的半抗原中含有较长的直链可直接与载体偶联，大多数的半抗原是通过连接臂与载体偶联，这首先涉及到半抗原分子上偶联部位的选择。
Ａ ：吡啶环上α－Ｃｌ Ｂ ：咪唑环上亚胺基Ｈ Ｃ ：－ＮＯ２可以被还原成－ＮＨ２
图６ 吡虫啉人工抗原合成的活性位点示意图偶联点的选择：一般情况下，农药分子中有多个可供选择的偶联点，不同的偶联点导致分子空间结构不同，暴露的抗原决定簇也不同，因此，制备的人工抗原产生的抗体效价及亲和力也都有差别。 朱国念等［２３］在吡虫啉人工抗原的合成与鉴定中通过对吡虫啉分子结构的分析，发现其分子中有３个活性位点（见图６箭头所示），其中Ａ：吡啶环上α－Ｃｌ易通过亲核取代反应被取代，而且Ｃｌ原子属于分子识别的远端，能使吡虫啉的抗原决定簇充分的暴露在外端，提高抗体的识别能力；Ｂ：咪唑环上亚胺基Ｈ原子，由于受＝Ｎ－ＮＯ２基团吸电子效应的影响，
易于发生取代反应；Ｃ：－ＮＯ２可以被还原成－ＮＨ２，可与载体蛋白直接进行偶联。 Ｌｅｅ等［２４］从上图所示的Ｂ、Ｃ位点入手，分别引入了一个４碳的连接臂，合成了两种半抗原，并制备了多克隆抗体。 但从位点Ｃ入手合成的半抗原所产生的抗体特异性很差，几乎不能识别吡虫啉；由位点Ｂ合成的半抗原所产生的抗体则具较强的特异性。 Ｗａｎａｔａｂｅ等［２５］由α－Ｃｌ原子位点合成了带－ＣＯＯＨ的半抗原并获得了单克隆抗体，其检测灵敏度较高。 异丙隆半抗原的制备及鉴定中，可以通过４种方法在异丙隆分子上引入活性基团［１８］。
可见，
“簇抗原”
第１期贲亚琍，等： 农药人工抗原合成方法的设计与优选
１３
偶联点的正确选择对合成高质量的农药分子半抗原是十分最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后通过比较筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。
偶联方法的选择：常用的连接方法主要包括以下几种：１）通过羧基连接的混合酸酐法和碳二亚胺（ＥＤＣ、ＤＤＣ）法；２）通过羟基连接的琥珀酸酐法；３）通过醛基连接的戊二醛法；４）通过酚基连接的重氮化法；５）通过氨基连接的Ｍａｎｎｉｃｈ反应和丙烯酸法；６）通过酮基连接的氨基氧乙酸法等。
偶联比的选择：偶联比（每分子载体上所连接半抗原的平均数目，又称为结合比）对抗体的生成有一定的影响，适宜的结合比有助于提高抗体的亲和力和选择性。 不同待测物，不同载体其最佳结合比可能不同。 现在一般通过调节半抗原与载体的摩尔比、反应的ｐＨ值、温度、离子强度等来控制结合比。 半抗原结合比过高或过低均会影响抗体的生成，有人认为以３￣４５为宜，也有人认为以５￣１５左右为宜，过高结合比抗原易导致动物免疫麻痹。
最理想的情况是设计、组合出多套方案，如在半抗原成的半抗原与多种载体相结合，采用不同的投料比，控制反应条件，最终得到不同性质、不同结合比的人工抗原，同时进行免疫试验，以达到优化筛选的目的。
半抗原与载体偶联后所得的人工抗原必须进行纯化，以除去未反应的半抗原小分子、盐类及其它小分子杂质。 现在最常用的方法是透析和凝胶层析。 透析一般纯化较为彻底、操作相对所需时间较长（通常需２ ｄ以上），
简单。 凝胶层析所需时间较短，但操作相对复杂，需要对流出组分进行跟踪分析，以确定目标组分。
对纯化后人工抗原进行鉴定，一方面是定性判断半抗原与载体是否偶联成功；另一方面是定量测定结合比和蛋白质含量等。 判断是否偶联成功最常用的为紫外扫描法，如果人工抗原的紫外吸收特征兼具有或不同于原半抗原和载体蛋白的紫外吸收特征，则可初步判断偶联成功。结合比的测定可以采用紫外分光光度法、标记抗原示踪法、元素分析法和红外光谱法等方法。 常用农药人工抗原的分子设计、合成与优选归纳见表１。
重要的。 如果一个农药分子内有多个不同的偶联点时，的设计中从不同位置引入不同性质、长度的连接臂，所合
２．４ 人工抗原的筛选、纯化和鉴定
表１ 常用农药分子人工抗原合成与优选归纳
农药毒死蜱三唑磷吡虫啉克百威ＭＩＬＯ西维因甲胺磷速灭威氟虫腈异丙隆甲基对硫磷
半抗原合成方法由原药衍生化合成由原料重新合成由原药衍生化合成由原药降解产物合成由原药衍生化合成由原药降解产物合成由结构类似物合成由原药降解产物合成由结构类似物合成由原药衍生化合成由原药衍生化合成
载体ＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＫＬＨＨＳＡＯＶＡＲＳＡ
偶联方法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法重氮化法戊二醛法异氰酸酯法混合酸酐法碳二亚胺法
连接臂３个碳原子６个碳原子３个碳原子６个碳原子４个碳原子６个碳原子３个碳原子３个碳原子无连接臂６个碳原子苯环５个碳原子苯环１０个碳原子４个碳原子
４６∶１３８∶１１２∶１１８∶１２∶１２∶１２６∶１１６∶１２３∶１偶联比３９∶１２３∶１３２∶１１０∶１
相关文献
［３］［１６］［２３］［１１］［４］［２６］［２７］［２８］［６］［１８］［８］
３ 问题与展望
能否制备稳定并具有免疫原性的半抗原是农药人工抗原分子合成的前提和关键。 农药结构类型复杂，对每一种农药半抗原合成要经过仔细设计，既要保留农药分子的基本结构特征，又要使其能够很好的与载体蛋白结合，往往要设计多个目标分子进行优化选择，不仅工作量大、周期长、成本高，而且许多设计的目标分子还难于合成。虽然人们在半抗原和人工抗原合成设计方面积累了一些经验，但有关半抗原结构、人工抗原结构与结合比及其免疫活性的关系尚未深入研究，致使筛选到高活性的免疫抗原比较困难。 克服这一难点可以通过下列５种途径：１）引入
组合化学设计和生物活性高通量筛选技术，建立不同农药结构与活性关系的评价模型，进一步提高筛选效率和命中率。 ２）簇半抗原的设计是国内外残留分析的一种新趋势，理想“簇抗原”的研究工作可大力推进农药人工抗原合成的发展。 ３）从农药分子的共性结构上设计引入活性基团，为一大类农药分子人工抗原的合成提供了可行性。 例如：甲氧基ＣＨ３Ｏ－是大多数有机磷类农药的共性结构，如果能直接在农药分子上通过ＣＨ３Ｏ－引入活性基团，含有ＣＨ３Ｏ－的有机磷类农药大多可以用这种方法引入活性基团。 以有机磷类农药乐果为例，可设计用通入ＨＣｌ的方法去掉ＣＨ３Ｏ－连上ＯＨ－基团，再加入催化剂ＤＣＣ－ＤＭＡＰ［２９］催化
１４农 药 AGROCHEMICALS 第４７卷
与Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ的酯化反应，连上带有４个碳原子连接臂 也可以参照选择性去甲基反的活性基团Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＯＯ－。
应［３０－３１］等方法去掉ＣＨ３Ｏ－基团。 ４）借鉴已合成的半抗原的方法，在结构类似的农药分子上引入活性基团，合成新的半抗原。 例如：呋喃丹与西维因水解后断裂部位相同，可参照西维因半抗原合成方法从呋喃丹水解产物呋喃酚入手制备半抗原。 异丙威、仲丁威等半抗原也可以用这种方法合成。 ５）酶联免疫吸附分析技术的提高。 如常规物理吸附包被抗体或抗原，包被蛋白量低，均一性和牢固性差，影响方法的精密度，尤其对固相抗体竞争法测定样品中含量甚微的半抗原，灵敏度和准确性很难达到满意结果。 共价键结合包被有无可比拟的优点，方法简便，高吸附力，牢固性好。 因此，共价键结合包被有望取代物理吸附方法。
目前，国内在此方面的研究开展较少，如果能够加快研究步伐，借助生物学技术和有机合成技术的结合，伴随着分子生物学、结构生物学技术的发展，人们对于抗原抗体相互作用的研究将进入微观层面，将深入地了解半抗原物质与抗体结合的作用原理，从而使找到半抗原结构与抗体质量的关系变为可能，相信在不久的将来，我国农药人工抗原的合成及酶免疫测定技术将有一个较大的发展。
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责任编辑：赵平
第４７卷第１期２００８年１月
农 药
AGROCHEMICALS
Vol. 47, No. 1Jan. 2008
综述农药人工抗原合成方法的设计与优选
贲亚琍１，２，朱德锐１，刘德立１，３
（１．华中师范大学 生命科学学院，武汉 ４３００７９； ２．江汉大学， 武汉 ４３００１６；
３．农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉 ４３００７９）
摘要：农药人工抗原的合成直接影响后期制备抗体的质量，对于建立农药分子特异、灵敏的免疫分析方法具有关键性作用。 综述了国内外农药人工抗原合成过程中的农药分子半抗原的设计原则、合成方法，人工抗原的设计、优选及影响因素等方面的研究进展。 并对农药残留免疫分析技术存在的问题和应用前景进行了讨论。
关键词：农药；人工抗原；合成方法；设计；优选
中图分类号：ＴＱ４６０．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００６－０４１３（２００８）０１－００１０－０５
Design and Selection of Synthesis Methods of Artificial
Antigens for Pesticides
BEN Ya-li 1,2, ZHU De-rui1, LIU De-li1,3
(1.College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China; 2.Jianghan University, Wuhan 430016, China;
3.Key Laboratory of Pesticide & Chemical Biology, Ministry of Education, Wuhan 430079, China)
Abstract: The synthesis on artificial antigens of pesticides directly influences the quality of the antibodies, and iscritical in the format of particular and sensitive immunology assay. The progress of the principle and synthesis
methods of haptens were introduced in this paper. Furthermore, the design and selection of synthesis methods ofartificial antigens and the influencing factors of the synthesis of haptens were introduced. Some questions and the newperspective of the immunoassay for pesticide residues were also discussed.Key words: pesticides; artificial antigens; synthesis methods; design; selection
农药残留已成为近年来威胁百姓餐桌安全的“隐形杀手”，而且殃及农产品出口，且有愈演愈烈之势。传统的农药残留分析方法包括气相色谱、液相色谱、质谱、薄层层析等，这些方法需要复杂昂贵的仪器，而且需要经过繁琐的前处理，专门的操作人员，很难达到快速、简便的现场检测要求。 酶免疫分析是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用原理有机结合起来的一种免疫分析技术，是一种简便、灵敏、经济的快速检测方法，在现场筛选和大量样本的快速监测中显示其独特的优势。 大多数农药是小分子物质（分子质量小于１ ０００），本身不具有诱导产生抗体的能力，必须设法先将农药小分子与载体蛋白质偶联制备出农药人工完全抗原，这是农药酶免疫分析的关键所在，如合适中间体、活性官能团引入位点的选择、半抗原产物的分离纯化、偶联臂的长短、半抗原与载体分子的偶联比等
［１］
从中获得了一些规律。
１ 半抗原的分子设计与合成
选定农药待测物后，如果待测物本身具有活性基团（－ＣＯＯＨ，－ＮＨ２，－ＯＨ等），一部分可直接与大分子载体（常用蛋白质）进行偶联或通过连接臂与载体偶联，制备人工抗原；对于待测物本身没有可直接与载体共价连接的基团，或虽有活性基团但这些基团对维系待测物的免疫特性和特征结构十分重要，或直接与大分子载体连接后半抗原的特征结构易受载体的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别等这些情况，则必须根据分析的目的和免疫学理论，重新设计、合成模拟原待测物的半抗原。 半抗原设计的总体原则：在尽可能保留原待测物特征结构的前提下，在适当的位置引入合适的连接臂和活性基团。 此外，农药分子的自身结构应有一定的复杂性，如具有分支结构、苯环或杂环结构等高免疫活性的基团，否则难以产生抗体或产生的抗体效价较低。 有研究报道，如果半抗原分子具有苯环则制备抗体的成功率为１／３，而不含苯环则成功率为１／１１［２］。
。
因此，农药人工抗原的分子设计、合成以及农药人工抗原的优选将直接影响能否制备出高质量的抗体。 本文对国内外农药人工抗原合成中的相关难点进行了综述，
收稿日期：２００７－０９－１２，修返日期：２００７－１０－１８基金项目：湖北省自然科学基金资助（Ｎｏ．２００６ＡＢＡ１９７）
作者简介：贲亚琍（１９６６－），女，黑龙江人，副教授，博士生，主要研究方向为农药生物化学。 Ｅ－ｍａｉｌ ：ｂ＿ｙ＿ｌ＠ｊｈｕｎ．ｅｄｕ．ｃｎ。通讯作者：刘德立，男，华中师范大学生命科学学院教授。
第１期
１．１ 直接对农药分子的原药进行衍生化图１ 毒死蜱人工抗原的合成路线
利用待测物现有结构，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团。 １）对其分子进行改造使分子内产生羧基基团。 见图１，农药毒死蜱人工抗原的合成就是在它的吡啶环上第６位Ｃｌ原子易通过亲核取代反应被取代，从而引入羧基基团［３］。 通过Ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ Ｏｘｉｍｅ（ＭＩＬＯ）肟羟基与琥珀酸酐反应，合成了半抗原ＭＩＬＯ－５－琥珀酰半酯［４］，氯菊酯结构中靠近三元环的双键可以通过氧化为羧酸。 禾草灵结构中含有羧酸甲酯，氟虫腈的结构中含有－ＣＮ，
均可通过水解引入－ＣＯＯＨ［５－６］
。 ２）对其分子进行
改造使分子内产生氨基基团。 有机磷类农药如对硫磷［７］、甲基对硫磷［８－９］（见图２）、杀螟硫磷［１０］、拟除虫菊酯其苯环结构中均有－ＮＯ２，
可通过还原为－ＮＨ２后直接偶联。图２ 甲基对硫磷半抗原的合成
１．２ 利用农药分子降解产物或中间产物合成半抗原
克百威半抗原的合成中，先用呋喃酚作为反应原料和光气反应得２，３－二氢－２，２－二甲基－７－苯并呋喃基氯甲酸酯，然后利用４－氨基丁酸和６－氨基己酸和该产物反应得到了克百威的两种活性半抗原：ＢＦＮＨ和ＢＦＮＢ［１１］
（见图３）。
１１
对硫磷半抗原的合成中，以对硫磷的自然降解产物中的一类主要产物—对氨基对硫磷作为半抗原，运用人工方法把对硫磷降解为氨基对硫磷，使硝基变为氨基［１２］。 杀菌剂丁苯吗啉［１３］的代谢产物丁苯吗啉酸可直接用于偶联。 也可用结构类似物作先导物，对其进行改造，得到需要的半抗原，如在哒螨灵半抗原合成中，用哒螨灵的结构类似物半琥珀酸胆固醇为先导物合成含有活性基团的半抗原［１４］。
从农药分子生产过程的中间产物中选取化合物合成半抗原。 如用有机磷农药中间产物二乙基硫代磷和对甲基
苯丁酸为原料，经水解、酯化作用合成了半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］硫代磷酸酯［１５］。
１．３ 由原料重新合成半抗原
在合成过程中选择适当步骤用一个有反应功能团的分子参与反应，从而合成出有反应功能团的半抗原分子。如三唑磷半抗原的合成，是以三氯硫磷、苯唑醇、巯基丙酸为原料，通过３步反应合成三唑磷半抗原６－［Ｏ－乙基－Ｏ－（１－苯基－１，２，４－三唑－３－基）硫代磷酰胺基］己酸（Ш）［１６］，其合成路线见图４。
１２农 药 AGROCHEMICALS第４７卷
叉反应，因此设计的“簇半抗原”中必须含有有机磷农药的母核。
陈林等选用有机磷农药中毒性大、数量多、使用广泛的Ｏ，Ｏ－二乙基硫代磷酸基团为母核，合成了簇半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］硫代磷酸酯［１５］（见图５）。 薛小平等合成了两种有机磷农药“簇半抗原”［１９］
，但对于“簇半抗原”与“簇抗体”的关系还没有弄清楚，所得抗体效价和亲和力不高。 国外报道这方面的研究起步较早，如Ｂａｎｋｓ等相继合成几种有机磷农药“簇半抗原”，并制备出“簇多克隆抗体”，其中有的“簇多克隆抗体”已经应用于有机磷农药多残留的检测中，但有的抗体检测限较高，亲和力不够［２０－２１］。 目前理想的“簇抗原”的结构还处于探索阶段，与“簇抗体”的关系还需进一步研究。
图５ 簇半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］
硫代磷酸酯的合成
１．５ 半抗原中特征基团的保护
为了保护待测物的特征结构部分和官能团，在待测物衍生化制备半抗原时对某些活性基团进行选择性保护和去保护是常用的合成手段。 如上述半抗原Ｏ，Ｏ－二乙基Ｏ－［对－（４－羧基丁基）苯基］硫代磷酸酯（ＰＳＥ）的合成中［１５］，就是用对甲氧基苯丁酸与４８％氢溴酸反应生成４－（４－羟基苯基）丁酸，然后与叔丁基二甲基氯硅烷反应形成硅烷酯以保护羧基，再与二乙基硫代磷酰氯发生酯化反应，最后加入适量盐酸，水解脱去保护基团即可得到目标产物。
２ 人工抗原的合成与优选
２．１ 连接臂的选择
现已公认一定长度的间隔臂的引入可使半抗原突出于载体表面，易为机体免疫系统识别，使产生针对半抗原的抗体的可能性增加。 在选择间隔臂时应注意以下几点：一是太长的间隔臂会因氢键或疏水作用导致半抗原分子发生折叠，反而使半抗原与载体蛋白靠近，导致载体蛋白屏蔽其特征基团；
而太短的间隔臂会因载体的空间位阻影响
免疫系统对半抗原的识别。 因此，一些研究者认为最佳的间隔臂是中等尺度，即３￣６碳原子［２２］，但是这种观点还有待进一步证实。 二是不要用吸电子基团或杂环作间隔臂，间隔臂应为非极性。
２．２ 载体的选择
现在一般均选择蛋白质作为大分子载体，常见的有牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、鸡卵清蛋白（ＯＶＡ）、钥孔血蓝蛋白（ＫＬＨ）、兔血清白蛋白（ＲＳＡ）、人血清白蛋白（ＨＳＡ）等。 目前，用的最多的是牛血清白蛋白（ＢＳＡ），因为其物化性质稳定、不易变性、价廉易得，而且其赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的ｐＨ和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂（如吡啶、ＤＭＦ等）的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态。 近年来，也有报道用人工合成多聚肽（常用多聚赖氨酸ＰＬＬ）为载体，其优点是可增加半抗原的免疫原性。
２．３ 半抗原与载体的偶联
有的半抗原中含有较长的直链可直接与载体偶联，大多数的半抗原是通过连接臂与载体偶联，这首先涉及到半抗原分子上偶联部位的选择。
Ａ ：吡啶环上α－Ｃｌ Ｂ ：咪唑环上亚胺基Ｈ Ｃ ：－ＮＯ２可以被还原成－ＮＨ２
图６ 吡虫啉人工抗原合成的活性位点示意图偶联点的选择：一般情况下，农药分子中有多个可供选择的偶联点，不同的偶联点导致分子空间结构不同，暴露的抗原决定簇也不同，因此，制备的人工抗原产生的抗体效价及亲和力也都有差别。 朱国念等［２３］在吡虫啉人工抗原的合成与鉴定中通过对吡虫啉分子结构的分析，发现其分子中有３个活性位点（见图６箭头所示），其中Ａ：吡啶环上α－Ｃｌ易通过亲核取代反应被取代，而且Ｃｌ原子属于分子识别的远端，能使吡虫啉的抗原决定簇充分的暴露在外端，提高抗体的识别能力；Ｂ：咪唑环上亚胺基Ｈ原子，由于受＝Ｎ－ＮＯ２基团吸电子效应的影响，
易于发生取代反应；Ｃ：－ＮＯ２可以被还原成－ＮＨ２，可与载体蛋白直接进行偶联。 Ｌｅｅ等［２４］从上图所示的Ｂ、Ｃ位点入手，分别引入了一个４碳的连接臂，合成了两种半抗原，并制备了多克隆抗体。 但从位点Ｃ入手合成的半抗原所产生的抗体特异性很差，几乎不能识别吡虫啉；由位点Ｂ合成的半抗原所产生的抗体则具较强的特异性。 Ｗａｎａｔａｂｅ等［２５］由α－Ｃｌ原子位点合成了带－ＣＯＯＨ的半抗原并获得了单克隆抗体，其检测灵敏度较高。 异丙隆半抗原的制备及鉴定中，可以通过４种方法在异丙隆分子上引入活性基团［１８］。
可见，
“簇抗原”
第１期贲亚琍，等： 农药人工抗原合成方法的设计与优选
１３
偶联点的正确选择对合成高质量的农药分子半抗原是十分最好尽可能利用不同位点都合成出人工抗原，然后通过比较筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作为检测。
偶联方法的选择：常用的连接方法主要包括以下几种：１）通过羧基连接的混合酸酐法和碳二亚胺（ＥＤＣ、ＤＤＣ）法；２）通过羟基连接的琥珀酸酐法；３）通过醛基连接的戊二醛法；４）通过酚基连接的重氮化法；５）通过氨基连接的Ｍａｎｎｉｃｈ反应和丙烯酸法；６）通过酮基连接的氨基氧乙酸法等。
偶联比的选择：偶联比（每分子载体上所连接半抗原的平均数目，又称为结合比）对抗体的生成有一定的影响，适宜的结合比有助于提高抗体的亲和力和选择性。 不同待测物，不同载体其最佳结合比可能不同。 现在一般通过调节半抗原与载体的摩尔比、反应的ｐＨ值、温度、离子强度等来控制结合比。 半抗原结合比过高或过低均会影响抗体的生成，有人认为以３￣４５为宜，也有人认为以５￣１５左右为宜，过高结合比抗原易导致动物免疫麻痹。
最理想的情况是设计、组合出多套方案，如在半抗原成的半抗原与多种载体相结合，采用不同的投料比，控制反应条件，最终得到不同性质、不同结合比的人工抗原，同时进行免疫试验，以达到优化筛选的目的。
半抗原与载体偶联后所得的人工抗原必须进行纯化，以除去未反应的半抗原小分子、盐类及其它小分子杂质。 现在最常用的方法是透析和凝胶层析。 透析一般纯化较为彻底、操作相对所需时间较长（通常需２ ｄ以上），
简单。 凝胶层析所需时间较短，但操作相对复杂，需要对流出组分进行跟踪分析，以确定目标组分。
对纯化后人工抗原进行鉴定，一方面是定性判断半抗原与载体是否偶联成功；另一方面是定量测定结合比和蛋白质含量等。 判断是否偶联成功最常用的为紫外扫描法，如果人工抗原的紫外吸收特征兼具有或不同于原半抗原和载体蛋白的紫外吸收特征，则可初步判断偶联成功。结合比的测定可以采用紫外分光光度法、标记抗原示踪法、元素分析法和红外光谱法等方法。 常用农药人工抗原的分子设计、合成与优选归纳见表１。
重要的。 如果一个农药分子内有多个不同的偶联点时，的设计中从不同位置引入不同性质、长度的连接臂，所合
２．４ 人工抗原的筛选、纯化和鉴定
表１ 常用农药分子人工抗原合成与优选归纳
农药毒死蜱三唑磷吡虫啉克百威ＭＩＬＯ西维因甲胺磷速灭威氟虫腈异丙隆甲基对硫磷
半抗原合成方法由原药衍生化合成由原料重新合成由原药衍生化合成由原药降解产物合成由原药衍生化合成由原药降解产物合成由结构类似物合成由原药降解产物合成由结构类似物合成由原药衍生化合成由原药衍生化合成
载体ＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＢＳＡＫＬＨＨＳＡＯＶＡＲＳＡ
偶联方法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法碳二亚胺法重氮化法戊二醛法异氰酸酯法混合酸酐法碳二亚胺法
连接臂３个碳原子６个碳原子３个碳原子６个碳原子４个碳原子６个碳原子３个碳原子３个碳原子无连接臂６个碳原子苯环５个碳原子苯环１０个碳原子４个碳原子
４６∶１３８∶１１２∶１１８∶１２∶１２∶１２６∶１１６∶１２３∶１偶联比３９∶１２３∶１３２∶１１０∶１
相关文献
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３ 问题与展望
能否制备稳定并具有免疫原性的半抗原是农药人工抗原分子合成的前提和关键。 农药结构类型复杂，对每一种农药半抗原合成要经过仔细设计，既要保留农药分子的基本结构特征，又要使其能够很好的与载体蛋白结合，往往要设计多个目标分子进行优化选择，不仅工作量大、周期长、成本高，而且许多设计的目标分子还难于合成。虽然人们在半抗原和人工抗原合成设计方面积累了一些经验，但有关半抗原结构、人工抗原结构与结合比及其免疫活性的关系尚未深入研究，致使筛选到高活性的免疫抗原比较困难。 克服这一难点可以通过下列５种途径：１）引入
组合化学设计和生物活性高通量筛选技术，建立不同农药结构与活性关系的评价模型，进一步提高筛选效率和命中率。 ２）簇半抗原的设计是国内外残留分析的一种新趋势，理想“簇抗原”的研究工作可大力推进农药人工抗原合成的发展。 ３）从农药分子的共性结构上设计引入活性基团，为一大类农药分子人工抗原的合成提供了可行性。 例如：甲氧基ＣＨ３Ｏ－是大多数有机磷类农药的共性结构，如果能直接在农药分子上通过ＣＨ３Ｏ－引入活性基团，含有ＣＨ３Ｏ－的有机磷类农药大多可以用这种方法引入活性基团。 以有机磷类农药乐果为例，可设计用通入ＨＣｌ的方法去掉ＣＨ３Ｏ－连上ＯＨ－基团，再加入催化剂ＤＣＣ－ＤＭＡＰ［２９］催化
１４农 药 AGROCHEMICALS 第４７卷
与Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ的酯化反应，连上带有４个碳原子连接臂 也可以参照选择性去甲基反的活性基团Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）４ＣＯＯ－。
应［３０－３１］等方法去掉ＣＨ３Ｏ－基团。 ４）借鉴已合成的半抗原的方法，在结构类似的农药分子上引入活性基团，合成新的半抗原。 例如：呋喃丹与西维因水解后断裂部位相同，可参照西维因半抗原合成方法从呋喃丹水解产物呋喃酚入手制备半抗原。 异丙威、仲丁威等半抗原也可以用这种方法合成。 ５）酶联免疫吸附分析技术的提高。 如常规物理吸附包被抗体或抗原，包被蛋白量低，均一性和牢固性差，影响方法的精密度，尤其对固相抗体竞争法测定样品中含量甚微的半抗原，灵敏度和准确性很难达到满意结果。 共价键结合包被有无可比拟的优点，方法简便，高吸附力，牢固性好。 因此，共价键结合包被有望取代物理吸附方法。
目前，国内在此方面的研究开展较少，如果能够加快研究步伐，借助生物学技术和有机合成技术的结合，伴随着分子生物学、结构生物学技术的发展，人们对于抗原抗体相互作用的研究将进入微观层面，将深入地了解半抗原物质与抗体结合的作用原理，从而使找到半抗原结构与抗体质量的关系变为可能，相信在不久的将来，我国农药人工抗原的合成及酶免疫测定技术将有一个较大的发展。
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责任编辑：赵平