实验一大黄中游离蒽醌的提取分离与检识
（一）目的要求
学习羟基蒽醌类化合物的提取分离和检识，通过实验要求：
1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。
2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。
3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。
4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。
5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。
（二）主要化学成分的结构及性质
大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Reg.和药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。大黄中含有大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚及其苷，总含量约3％～5％。
1．大黄酸 分子式C15H8O6，分子量284.21。黄色针状结晶（升华法），mp.321～322℃，330℃分解。能溶于碱水、吡啶，略溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。
2．大黄素分子式C15H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶(乙醇)，mp.256～257℃，能升华。易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。
3．芦荟大黄素分子式C16H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶（甲苯），mp.223～224℃。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。
4．大黄酚分子式C15H10O4，分子量254.23。橙黄色六方形或单斜结晶（乙醇或苯），mp.196～197℃，能升华。易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶
于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。
5．大黄素甲醚 分子式C16H12O5，分子量284.26。砖红色单斜针状结晶，mp.203～207℃，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
OHOOH大黄酚 R1=CH3 R2=H
大黄素 R1=CH3 R2=OH
大黄酸 R1=COOH R2=H
大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3 R2
R1
（三）实验原理
本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。
（四）实验内容
1. 提取与分离
见书。
2．检识
（1）碱液试验分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴10％氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。
（2）醋酸镁试验分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5％醋酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。
（3）薄层色谱检识
薄层板：硅胶G-CMC-Na
试样：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的氯仿溶液
对照品：上述各成分对照品乙醇溶液
展开剂：石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液
显色：在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5％醋酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。
（五）实验说明及注意事项
1．大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。
2．萃取用pH8缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；pH9.9缓冲液为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。配制好的缓冲液要测pH值。一般萃取大黄酸用pH7～8范围的，萃取大黄素用pH9.5～11范围的。
3．用各缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。
4．本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。
5．色谱分离大黄酚及大黄素甲醚时，先用氯仿洗脱至出现黄色色带时，改用氯仿—醋酸乙酯（8∶2）混合溶剂继续洗脱，并更换收集器，每10ml为一份，按顺序编号，直至色谱柱的第一色带全部洗脱下来为止。各流分经硅胶-CMC-Na板，氯仿－醋酸乙酯(8∶2)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。
（六）思考题
1．大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？
2．pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？
3．蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？
4．蒽醌类与醋酸镁显色反应的必要条件是什么？其颜色反应与羟基所在的位置有何关系？
实验一大黄中游离蒽醌的提取分离与检识
（一）目的要求
学习羟基蒽醌类化合物的提取分离和检识，通过实验要求：
1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。
2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。
3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。
4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。
5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。
（二）主要化学成分的结构及性质
大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Reg.和药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。大黄中含有大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚及其苷，总含量约3％～5％。
1．大黄酸 分子式C15H8O6，分子量284.21。黄色针状结晶（升华法），mp.321～322℃，330℃分解。能溶于碱水、吡啶，略溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。
2．大黄素分子式C15H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶(乙醇)，mp.256～257℃，能升华。易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。
3．芦荟大黄素分子式C16H10O5，分子量270.23。橙色针状结晶（甲苯），mp.223～224℃。易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。
4．大黄酚分子式C15H10O4，分子量254.23。橙黄色六方形或单斜结晶（乙醇或苯），mp.196～197℃，能升华。易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶
于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。
5．大黄素甲醚 分子式C16H12O5，分子量284.26。砖红色单斜针状结晶，mp.203～207℃，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
OHOOH大黄酚 R1=CH3 R2=H
大黄素 R1=CH3 R2=OH
大黄酸 R1=COOH R2=H
大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3 R2
R1
（三）实验原理
本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。
（四）实验内容
1. 提取与分离
见书。
2．检识
（1）碱液试验分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴10％氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。
（2）醋酸镁试验分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5％醋酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。
（3）薄层色谱检识
薄层板：硅胶G-CMC-Na
试样：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的氯仿溶液
对照品：上述各成分对照品乙醇溶液
展开剂：石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液
显色：在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5％醋酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。
（五）实验说明及注意事项
1．大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。
2．萃取用pH8缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；pH9.9缓冲液为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。配制好的缓冲液要测pH值。一般萃取大黄酸用pH7～8范围的，萃取大黄素用pH9.5～11范围的。
3．用各缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。
4．本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。
5．色谱分离大黄酚及大黄素甲醚时，先用氯仿洗脱至出现黄色色带时，改用氯仿—醋酸乙酯（8∶2）混合溶剂继续洗脱，并更换收集器，每10ml为一份，按顺序编号，直至色谱柱的第一色带全部洗脱下来为止。各流分经硅胶-CMC-Na板，氯仿－醋酸乙酯(8∶2)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。
（六）思考题
1．大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？
2．pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？
3．蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？
4．蒽醌类与醋酸镁显色反应的必要条件是什么？其颜色反应与羟基所在的位置有何关系？