家蚕突变体之间的遗传关系

简单序列重复(ISSR)区域标记分析家蚕突变体蚕品种之间的遗传关系

Dhanikachalam Velu, Kangayam M. Ponnuvel*, Murugiah Muthulakshmi,

RandhirK.Sinha,SyedM.H.Qadri

印度，生物技术实验室,中央养蚕的种质资源中心,Hosur - 635109,Tamil Nadu,

2007年10月23日出版,修订于2008年1月7日, 录于2008年1月24日

生命科学学院生物工程 12-1苏进、 包艳春译 指导老师：高明波老师

摘要： 简单序列重复区域(ISSR)标记被用来确定基因突变蚕品种（家蚕）之间的关系。这项研究用15个ISSR引物并包括简单序列重复(SSR)。总共产生了20个突变体，有113项被标记,其中73.45%是多态的。在选择突变体遗传材料时,平均有(1.7080±0.4567)等位基因,有效等位基因(1.5194±0.3950)和遗传多样性(Ht)(0.2901±0.0415)。使用未加权的两组产生的树状图与算术平均法(UPGMA)和统计分析方法，使用Nei’s的遗传距离形成的一个主要组,分为6组，并从中分离出20个蚕突变体。因此,用ISSR扩增来确定突变蚕品种间的遗传变异性是一种有价值的方法。蚕品种种质资源中心的维护就是用的此种方法。

关键词: 遗传多样性; 家蚕; 突变体；ISSR

引言

家蚕是被驯化的昆虫，用于生产丝绸，在印度，养蚕是一个基本的农业产业，它不仅可以提供高质量的生丝，还可以提高农民的收入。在印度，中央养蚕的种质资源中心有432个蚕品种,其中有20 339突变体是二化的突变体和73 种多化的突变体蚕品种。这些蚕突变体在产量和其他表型参数方面都表明其生物多样性。不同的蚕品种一般表现型也不一样，例如，卵的颜色、幼虫的外形、茧的形状和颜色等。然而,遗传同一性突变体在不同品系之间的关系也有类似的特征。 所以，形态特征无法准确确定品种的遗传身份。它必须用品种的分子特征来分析种质资源的遗传多样性，而分子标记在形态学和生化标记上有许多的优点，因为这些标记不受环境的影响，它是稳定的、独立的(Bernatsky and Tanksley, 1989; Gepts, 1993) 。用聚合酶链反应（PCR）标记技术已经被广泛开发和应用，如简单序列重复标记(SSR)(Tautz, 1989),随机扩增多态性DNA标记(RAPD)(Williams et al., 1990), 简单重复序列区间标记（ISSR）(Zietkiewicz et al., 1994), 和扩增片段长度多态性（AFLP）(Vos et al., 1995).限制性片段长度多态性(Botstein et al., 1980)。这些标记技术常被用来研究某些植物和动物种群动态的遗传多样性(Zeitkiewicz et al., 1994; Tsumura et al., 1996; Dayanadhan et al., 1997; Gabierelsen and Brochman,1998;Wolfe et al., 1998; Knox and Palmer,1999).如RFLP分子标记(Shi et al., 1995), RAPD (Yasukochi, 1998), AFLP (Tan et al., 2001) and SSR (Reddy et al., 1999a; Miao et al., 2005) 用RFLP和PCR为基础的技术来研究蚕品种的遗传关系，并构建其分子连锁图谱(Xia et al.,1998; Reddy et al., 1999a, 1999b; Nagaraju et al., 2001; Lu et al., 2002; Li et al., 2005). 也取得了进展，确定RAPD标记分配nonsusceptability位点densonucleovirus(Abe et al., 2000; Li et al., 2001)和抗核型多角体病毒（NPV）位点(Yao et al., 2003)。同样，AFLP(Lu et al., 2004）和ISSR(Chatterjee and Mohandas, 2003)标记被用来确定的数量性状位点（QTL）如产量性状和产茧量。简单重复序列区域（ISSR）标记系统已被广泛用于植物和动物的遗传分析(Zeitkiewicz et al., 1994; Reddy et al., 1999b;Bornet et al., 2002; Vijayan, 2004)。家蚕遗传变异分析采用ISSR标记法，(Li et al., 2007)。此外,ISSR扩增技术能够区分个体之间的变异(Zietkiewicz et al .,1994)和评估种质的遗传多样性(Wolfe et al., 1998)，ISSR分子标记

法是利用非编码位点分散在整个基因组中，产生大数量的片段的原理，具有生产重复性高，和低成本等特点。

突变体蚕品种作为学术研究的对象，表现型遗传连锁图谱提供了超过230个基因位点，分布于28个连锁群中（n = 28），且整合集中在分子标记连锁图谱和昆虫的表型遗传连锁图谱中(Doira, 1992)。它的发展促进了昆虫和其他鳞翅目昆虫生物现象的观察、分析和研究。在这项研究中，为了保护这些变异的蚕品种，选定了20个家蚕突变体为遗传材料，并对每个突变体进行了ISSR分析。 材料和方法

蚕品种

二十个蚕突变体，表现型的差异（表1）被作为核心研究对象，把它们饲养在规定的温度和湿度环境下(Krishnaswamy et al., 1977).随机选择十个蚕蛾，把它们的翅膀减除，放入氯氮苯酚溶液中，分离DNA和用异戊醇分析其构成(Suzuki et al., 1972). 把DNA溶于TE缓冲液（Tris EDTA）（pH 8）中，稀释和量化的浓度为10纳克每升，微量标准为DNA（10毫微克/μL）。

表一 突变蚕选择研究列表

ISSR引物PCR扩增DNA

英国哥伦比亚大学共有25个ISSR引物被用于这项研究,其中15个引物显示很高比例的多态性。（表二）。PCR扩增热循环仪在MJ研究PTC 200完成，使用20μL反应混合物含有30 ng的DNA，2μL 10×PCR缓冲液（MBI fermentas），0.2 mmol／L的dNTP，2.5毫摩尔/ L的氯化镁，0.15μmol/L引物和1 U Taq DNA聚合酶，PCR操作进程为94°C 2分钟40个周期，94°C 30 秒，50°C 30秒， 72℃ 2分钟和最后在72°C延长10分钟.

PCR产物决定了在1.5%琼脂糖凝胶的Tris-乙酸/ EDTA缓冲（ 1×TAE）和恒定电压80 V 2 h电泳，用溴化乙锭染色（0.5μμg／ml）和摄影与凝胶成像系统，实验重复三次且有条带，所有的三个凝胶一致，清晰带用于分析。弱带不分析。

ISSR

数据评估与分析

可获得的和可复制的放大DNA片段始终被转换成能简要描述的二进制计数法，存在(= 1)和缺失(= 0)。在带型分析的基础上使用参数对遗传变异进行了分析,如多态性比例(P)分析,遗传多样性(Ht)分析和遗传距离分析(Nei,1978),使用的是POPGENE软件(Yeh and Boyle, 1997)。 UPGMA树和引导分析分别使用的是(Sneath and Sokal, 1973l)PHYLIP 3.5 c软件生成的项目(Felsenstein,1993)1000。 结果

通过ISSR分析遗传变异性

通过ISSR引物带生成的光谱带显示了20个突变体之间的多态性(图1)。15个ISSR引物生成113条带,其中83条带具有多态性占73.45%。条带在250 - 3000个碱基范围内。产生的条带数从3变化（UBC 861）到14（UBC 807）（表2）

表二 ISSR引物及其多态性列表的

种群的多样性分析表明，观察到的等位基因的平均数（Na）为（1.7080±0.4567），有效等位基因数（Ne）（1.5194±0.3950），遗传多样性（HT）（0.2901±0.0415）和Shannon信息指数（I）（0.4216±0.2868），蚕品种之间的遗传相似性范围从0.5752——0.9558。在家蚕品种 TMS 75和 TMS 61中观察到的最高相似性为0.9558 ，而在家蚕品种TMS 38 和TMS 14之间观察到的最低相似性为0.5752（表3）。

基于Nei's的遗传距离的遗传距离值如表3。蚕突变体之间的遗传距离距离从0.0453到0.5530不等。蚕品种TMS 75和TMS 61显示最低遗传距离为0.0453,而最高遗传距离为0.5530。图1。在20突变体中找到的ISSR带谱的 UBC 809（a）和UBC 841（b）是在TMS 38和TMS 14之间。用Nei's遗传距离模型产生的所有的突变体矩阵UPGMA种群分析如图2。由6组形成一个主要的种群。第1组由五个突变体形成两个子组,第一子组由三个突变体即TMS 75和TMS61，其遗传距离为0.0453。TMS 35是孤立的子组。第二子群由遗传距离为0.2501的TMS 34和TMS 65组成。第二组由四个突变体组成，即TMS 2和TMS 12和2个集群（ODT和TMS 14）突变体组成，其遗传距离为0.2276。同样，第三组中，TMS 82 、TMS 69的遗传距离为0.2165，用的是两个突变体TMS62、TMS64。第四组由TMS 33和TMS 67，遗传距离为0.2056。第五组包括三个突变体，TMS 32 、TMS 31和一个孤立的集群TMS 66，遗传距离为0.2847，而第六组由TMS 38和TMS 17组成，其遗传距离是0.3329。

表三

Nei's遗传同一性（对角线上方）和遗传距离（对角线下方）

讨论

突变体蚕由自发突变和人工诱变进化而来。其形态特征和突变性状的分离被用来作为遗传分析的基本工具(Doira, 1992; Banno et al., 1994)。蚕品种的培育起源于日本，并被用来研究遗传多样性和物种数量之间的关系。UPGMA集群结果与Nei's遗传距离表明，20突变蚕品种形成于一个主要集群和六个子集群，表明所有的突变体有相同的起源，因为他们属于二化性品种。同样的Similarly Reddy et al. (1999b)从不同的起源分析13个变异体，并将他们分为滞育和非滞育组。

在选定的突变体家蚕遗传品种中，15个ISSR引物共扩增出113条带，占多态性带73.45% 。Li 团队（2007）在中国蚕业研究所进行了ISSR扩增，分析了不同蚕品种之间的遗传关系(SRI-CAAS)。他们确定了保种技术，其中分别聚集应用在在二化性和多化性品种中。在这项研究中，所有的突变体起源于由温带二化性品种形成的种群。然而，突变的蚕品种之间的遗传距离为0.0453～0.5530。TMS 75和TMS 61两个变异蚕之间有较低的遗传距离0.0453，TMS 14和TMS 38之间的遗传距离最高为0.5530，其表明这些突变体具有独特的特征基因。

显然，从一个人工繁殖后被驯化的蚕品种，因为生殖隔离；没有基因在突变体之间交换。在突变体的蚕品种、种群的多样性分析结果表明，观察到的等位基因的平均数（NA）（1.7080±0.4567），有效等位基因数（Ne）（1.5194±0.3950）和Shannon信息指数（Ⅰ）（0.4216±0.2868）。这些结果体现在自交群体中，且在目前的突变体中有较高的遗传变异现象。类似的调查结果在不同地域的蚕，也有报道anthereae roylei(Kar et al., 2005)。在封闭的饲养条件下，饲养家蚕蚕品种包括突变体，高度缺乏随机交配。对此封闭个体之间的交流通常用于维护基因库的延续，因为由于近交，衰退往往是频繁发生的。这些研究结果有助于分析蚕品种杂合性保持，其中的遗传距离表明在每一个遗传个体中没有较大的生殖隔离。

总之，这项研究揭示了突变体之间的亲缘关系。一个主要的种群表明，它们都有属于同一起源的类似的化性。杂合性是对柞桑蚕驯化不同（少数家蚕是野生）(Kar et al., 2005)。然而，突变体间的遗传距离的变化。根据观察到的遗传距离与TMS38和 TMS 14（远亲）比较TMS38和 TMS 14（远亲）蚕和TMS75、 TMS 61可能是近亲。ISSR分子标记的使用显示长度数3–14条，带谱的范围从250到3000 bp，73.45% 的多态性，这表明突变体中的杂合性的适用范围。这也证实了平均有

效等位基因数。研究等位基因遗传多样性。以上研究表明，ISSR标记可以有效地用于系统性分析进化家蚕和杂合性的关系。

参考文献

Abe, H., Sugasaki, T., and Kanehara, M. (2000). Identification and genetic mapping of RAPD markers linked to the densonucleosis refractoriness gene, nsd-2, in the silkworm, Bombyx mori. Genes Genet. Syst. 75: 93−96.

Banno, Y., Noda, K., Kawaguchi, Y., Koga, K., and Doira, H. (1994). Linkage studies on a hemolymph protein of young larval-A4 (PYL-4) of the silkworm, Bombyx mori. J. Seric. Sci. Jpn. 63: 299−302. Berbatzky, R., and Tanksley, S.D. (1989). Restriction fragments as molecular markers for germplasm evaluation and utilization. In The Use of Plant Genetic Resources, A.H.D. Brown, O.H. Frankel,

D.R.Marshel, and J.T. Williams. (New York: Cambridge University Press), pp. 353−362.

Bornet, B., Goraguer, F., Joly, G., and Branchard, M. (2002). Genetic diversity in European and

Argentinean cultivated potatoes (Solanum tuberosum) detected by inter simple sequence repeats (ISSRs). Genome 45: 481 −484.

Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., and Davis, R.W. (1980). Construction of genetic linkage map in man using restriction length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314−331.

Chatterjee, S.N., and Mohandas, T.P. (2003). Identification of ISSRmarkers associated with productivity traits in silkworm, Bombyx mori L. Genome 46: 438−447.

Dayanandhan, S., Bawa, K.S., and Kesseli, R. (1997). Conservation of microsatellite among tropical trees (leguminosae). Am. J. Bot. 84: 1658−1663.

Doira, H. (1992). Genetic stocks and mutation of Bombyx mori. In Important Genetic Resources, Doira, H. ed. Faculty of Agriculture, Kyusu University, Japan.

Felsenstein, J. (1993). PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Department of Genetics, University of Washington, Seattle.

Gabierslsen, T.M., and Brochmann, C. (1998). Sex after all: High levels of diversity detected in theatric clonally plant saxifrage cernua using RAPD markers. Mol. Ecol. 10: 1701 −1708.

Gepts, P. (1993). The use of molecular and biochemical markers in crop evolution studies. Evol. Biol. 27: 51 −94.

Kar, P.K., Vijayan, K., Mohandas, T.P., Nair, C.V., Saratchandra, B. and Thangavelu, K. (2005). Genetic variability and genetic structure of wild and semi-domestic populations tasar silkworm (Antheraea mylita) eco Daba as revealed through ISSR markers. Genetica 125: 173−183.

Knox, E.B., and Palmer, J.D. (1999). The chloroplast genome arrangement of Lobelia thuliniana

(Lobiliaceae): Expression of inverted repeat in an ancestor of the companulales. Plant Syst. Evol. 214: 49−64.

Krishnaswamy, S., Narashimanna, M.N., Suryanarayana, S.K., and Kumaraj, S. (1977). Manual on sericulture. Silkworm rearing (Mysore Publ. Central Silk Board).

Li, M.W., Yao, Q., Hou, C.X., Lu, C., and Chen. K.P. (2001). Studies on RAPD markers linked to the densonucleosis refractoriness gene, nsd-Z, in the silkworm, Bombyx mori L. Sericologia 41: 409−415. Li, M.W., Shen, L., Xu, A.Y., Miao, X.X., Hou, C.X., Sun, P.J, Zhang,Y.H., and Huang, Y.P. (2005). Genetic diversity among the silkworm (Bombyx mori L., Lep, Bombycidae) germplasm revealed by microsatellites. Genome 48: 802−810.

Li, M.W., Hou, C.X., Miao, X.X., Xu, A.Y., and Huang, Y.P. (2007). Analyzing genetic relationship in Bombyx mori using inter simple sequence repeat amplification. J. Econ. Entomol. 100: 202−208.

Lu, C., Yu, H.S., and Xiang, Z.H. (2002). Molecular systematic studies on Chinese mandarina silkworm (Bombyx mandarina M.) and domestic silkworm (Bombyx mori L.). Sci. Agric. Sin. 35: 94−101.

Lu, C., Li, B., Zhao, A., and Xiang, Z. (2004). QTL mapping of economically important traits in silkworm (Bombyx mori). Sci. China Ser. C Life Sci. 47: 477−484.

Miao, X.X., Xu, S.J., Li, M.H., Li, M.W., Huang, J.H., Dai, F.Y.,Marino, S.W., Mills, D.R., Zheng, P.Y., Mita K, Jia, S.H., Zhang, Y.,Liu, W.B., Xiang, H., Guo, Q.H., Xu, A.Y., Kong, X.Y., Lin, H.X.,Shi, Y.Z., Lu, G., Zhang, X., Huang, W., Yasukochi, Y., Sugasaki, T.,Shimada, T., Naga-raju, J., Xiang, Z.H., Wang, S.Y., Goldsmith,M.R., Lu, C., Zhao, G.P., and Huang, Y.P. (2005). Simple sequence repeat-based consensus linkage map of Bombyx mori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 16303−16308.

Nagaraju, J., Reddy, K.D., Nagaraja, G.M., and Sethuraman, B.N. (2001). Comparison of multilocus RFLPs and PCR-based marker systems for genetic analysis of the silkworm, Bombyx mori. Heredity 86: 588−597. Nei, M. (1978). Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89: 583−590.

Reddy, K.D., Abraham, E.G., and Nagaraju, J. (1999a). Microsatellites in the silkworm, Bombyx mori: Abundance, polymorphism, and strain characterization. Genome 42: 1057−1065.

Reddy, K.D., Nagaraju, J., and Abraham, E.G. (1999b). Genetic characterization of the silkworm Bombyx mori by simple sequence repeat (SSR)-anchored PCR. Heredity 83: 681 −687.

Shi, J., and Heckel, D.G., and Goldsmith, M.R. (1995). A genetic linkage map for the domesticated silkworm Bombyx mori based on restriction fragment length polymorphism. Genet. Res. 66: 109−126. Sneath, P.H.A., and Sokal, R.R. (1973). Numerical taxonomy. The principles and practice of numerical classification. (New York: Freeman WH & Co.).

Suzuki, Y., Gage, I., and Brown, D.D. (1972). The genes for silk fibroinin Bombyx mori. J. Mol. Biol. 70: 637−49.

Tan, Y.D., Wan, C.L., Zhu, Y.F., Lu, C., Xiang, Z.H., and Deng, H.W. (2001). An amplified fragment length polymorphism map of the silkworm. Genetics 157: 1277−1284.

Tautz, D. (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res. 17: 6463−6471.

Tsumura, Y.K., Ohba, K., and Strauss, S.H. (1996). Diversity and inheritance of inter-simple repeat polymorphism in Douglas fir (Pseudootsuga menziesii) and Sugi (Crypromeria japonica). Theor. Appl. Genet. 92: 40−45.

Vijayan, K. (2004). Genetic relationships of Japanese and Indian mulberry (Morus spp.) genotypes revealed by DNA fingerprinting. Plant Syst. Evol. 243: 331 −232.

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M. (1995). AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23: 4407−4414.

Williams, J.G.K., Hanafey, M.K., Rafalski, J.A., and Tingey, S.V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 6531 −6535.

Wolfe, A.D., Xiang, Q.Y., and Kephart, S.R. (1998). Assessing hybridization in natural populations of Penstemon (Scrophulariaceae) using hypervariable inter-simple sequence repeat markers. Mol. Ecol. 7: 1107−1125.

Xia, Q.Y., Zhou, Z.Y., Lu, C., and Xiang, Z.H. (1998). Molecular phylogenetic study on the racial

differentiation of Bombyx mori by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Acta Entomol. Sin. 41: 32−40.

Yao, Q., Li, M.W., Wang, Y., Wang, W.B., Lu, J., Dong, Y., and Chen, K.P. (2003). Screening of molecular markers for NPV resistance in Bombyx mori L. (Lep: Bombycidae). J. Appl. Entomol.127: 134−136. Yasukochi, Y. (1998). A dense genetic linkage map of the silkworm, Bombyx mori, covering all chromosomes based on 1018 molecular markers. Genetics 150: 1513−1525.

Yeh, F.C., and Boyle, T. (1997). POPGENE Ver 1.32. (http:// www.ualberta.ca/fyeh) Microsoft window based freeware for population genetic analysis.

Zietkiewicz, E., Rafalski, A., and Labuda, D. (1994). Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176−183.

简单序列重复(ISSR)区域标记分析家蚕突变体蚕品种之间的遗传关系

Dhanikachalam Velu, Kangayam M. Ponnuvel*, Murugiah Muthulakshmi,

RandhirK.Sinha,SyedM.H.Qadri

印度，生物技术实验室,中央养蚕的种质资源中心,Hosur - 635109,Tamil Nadu,

2007年10月23日出版,修订于2008年1月7日, 录于2008年1月24日

生命科学学院生物工程 12-1苏进、 包艳春译 指导老师：高明波老师

摘要： 简单序列重复区域(ISSR)标记被用来确定基因突变蚕品种（家蚕）之间的关系。这项研究用15个ISSR引物并包括简单序列重复(SSR)。总共产生了20个突变体，有113项被标记,其中73.45%是多态的。在选择突变体遗传材料时,平均有(1.7080±0.4567)等位基因,有效等位基因(1.5194±0.3950)和遗传多样性(Ht)(0.2901±0.0415)。使用未加权的两组产生的树状图与算术平均法(UPGMA)和统计分析方法，使用Nei’s的遗传距离形成的一个主要组,分为6组，并从中分离出20个蚕突变体。因此,用ISSR扩增来确定突变蚕品种间的遗传变异性是一种有价值的方法。蚕品种种质资源中心的维护就是用的此种方法。

关键词: 遗传多样性; 家蚕; 突变体；ISSR

引言

家蚕是被驯化的昆虫，用于生产丝绸，在印度，养蚕是一个基本的农业产业，它不仅可以提供高质量的生丝，还可以提高农民的收入。在印度，中央养蚕的种质资源中心有432个蚕品种,其中有20 339突变体是二化的突变体和73 种多化的突变体蚕品种。这些蚕突变体在产量和其他表型参数方面都表明其生物多样性。不同的蚕品种一般表现型也不一样，例如，卵的颜色、幼虫的外形、茧的形状和颜色等。然而,遗传同一性突变体在不同品系之间的关系也有类似的特征。 所以，形态特征无法准确确定品种的遗传身份。它必须用品种的分子特征来分析种质资源的遗传多样性，而分子标记在形态学和生化标记上有许多的优点，因为这些标记不受环境的影响，它是稳定的、独立的(Bernatsky and Tanksley, 1989; Gepts, 1993) 。用聚合酶链反应（PCR）标记技术已经被广泛开发和应用，如简单序列重复标记(SSR)(Tautz, 1989),随机扩增多态性DNA标记(RAPD)(Williams et al., 1990), 简单重复序列区间标记（ISSR）(Zietkiewicz et al., 1994), 和扩增片段长度多态性（AFLP）(Vos et al., 1995).限制性片段长度多态性(Botstein et al., 1980)。这些标记技术常被用来研究某些植物和动物种群动态的遗传多样性(Zeitkiewicz et al., 1994; Tsumura et al., 1996; Dayanadhan et al., 1997; Gabierelsen and Brochman,1998;Wolfe et al., 1998; Knox and Palmer,1999).如RFLP分子标记(Shi et al., 1995), RAPD (Yasukochi, 1998), AFLP (Tan et al., 2001) and SSR (Reddy et al., 1999a; Miao et al., 2005) 用RFLP和PCR为基础的技术来研究蚕品种的遗传关系，并构建其分子连锁图谱(Xia et al.,1998; Reddy et al., 1999a, 1999b; Nagaraju et al., 2001; Lu et al., 2002; Li et al., 2005). 也取得了进展，确定RAPD标记分配nonsusceptability位点densonucleovirus(Abe et al., 2000; Li et al., 2001)和抗核型多角体病毒（NPV）位点(Yao et al., 2003)。同样，AFLP(Lu et al., 2004）和ISSR(Chatterjee and Mohandas, 2003)标记被用来确定的数量性状位点（QTL）如产量性状和产茧量。简单重复序列区域（ISSR）标记系统已被广泛用于植物和动物的遗传分析(Zeitkiewicz et al., 1994; Reddy et al., 1999b;Bornet et al., 2002; Vijayan, 2004)。家蚕遗传变异分析采用ISSR标记法，(Li et al., 2007)。此外,ISSR扩增技术能够区分个体之间的变异(Zietkiewicz et al .,1994)和评估种质的遗传多样性(Wolfe et al., 1998)，ISSR分子标记

法是利用非编码位点分散在整个基因组中，产生大数量的片段的原理，具有生产重复性高，和低成本等特点。

突变体蚕品种作为学术研究的对象，表现型遗传连锁图谱提供了超过230个基因位点，分布于28个连锁群中（n = 28），且整合集中在分子标记连锁图谱和昆虫的表型遗传连锁图谱中(Doira, 1992)。它的发展促进了昆虫和其他鳞翅目昆虫生物现象的观察、分析和研究。在这项研究中，为了保护这些变异的蚕品种，选定了20个家蚕突变体为遗传材料，并对每个突变体进行了ISSR分析。 材料和方法

蚕品种

二十个蚕突变体，表现型的差异（表1）被作为核心研究对象，把它们饲养在规定的温度和湿度环境下(Krishnaswamy et al., 1977).随机选择十个蚕蛾，把它们的翅膀减除，放入氯氮苯酚溶液中，分离DNA和用异戊醇分析其构成(Suzuki et al., 1972). 把DNA溶于TE缓冲液（Tris EDTA）（pH 8）中，稀释和量化的浓度为10纳克每升，微量标准为DNA（10毫微克/μL）。

表一 突变蚕选择研究列表

ISSR引物PCR扩增DNA

英国哥伦比亚大学共有25个ISSR引物被用于这项研究,其中15个引物显示很高比例的多态性。（表二）。PCR扩增热循环仪在MJ研究PTC 200完成，使用20μL反应混合物含有30 ng的DNA，2μL 10×PCR缓冲液（MBI fermentas），0.2 mmol／L的dNTP，2.5毫摩尔/ L的氯化镁，0.15μmol/L引物和1 U Taq DNA聚合酶，PCR操作进程为94°C 2分钟40个周期，94°C 30 秒，50°C 30秒， 72℃ 2分钟和最后在72°C延长10分钟.

PCR产物决定了在1.5%琼脂糖凝胶的Tris-乙酸/ EDTA缓冲（ 1×TAE）和恒定电压80 V 2 h电泳，用溴化乙锭染色（0.5μμg／ml）和摄影与凝胶成像系统，实验重复三次且有条带，所有的三个凝胶一致，清晰带用于分析。弱带不分析。

ISSR

数据评估与分析

可获得的和可复制的放大DNA片段始终被转换成能简要描述的二进制计数法，存在(= 1)和缺失(= 0)。在带型分析的基础上使用参数对遗传变异进行了分析,如多态性比例(P)分析,遗传多样性(Ht)分析和遗传距离分析(Nei,1978),使用的是POPGENE软件(Yeh and Boyle, 1997)。 UPGMA树和引导分析分别使用的是(Sneath and Sokal, 1973l)PHYLIP 3.5 c软件生成的项目(Felsenstein,1993)1000。 结果

通过ISSR分析遗传变异性

通过ISSR引物带生成的光谱带显示了20个突变体之间的多态性(图1)。15个ISSR引物生成113条带,其中83条带具有多态性占73.45%。条带在250 - 3000个碱基范围内。产生的条带数从3变化（UBC 861）到14（UBC 807）（表2）

表二 ISSR引物及其多态性列表的

种群的多样性分析表明，观察到的等位基因的平均数（Na）为（1.7080±0.4567），有效等位基因数（Ne）（1.5194±0.3950），遗传多样性（HT）（0.2901±0.0415）和Shannon信息指数（I）（0.4216±0.2868），蚕品种之间的遗传相似性范围从0.5752——0.9558。在家蚕品种 TMS 75和 TMS 61中观察到的最高相似性为0.9558 ，而在家蚕品种TMS 38 和TMS 14之间观察到的最低相似性为0.5752（表3）。

基于Nei's的遗传距离的遗传距离值如表3。蚕突变体之间的遗传距离距离从0.0453到0.5530不等。蚕品种TMS 75和TMS 61显示最低遗传距离为0.0453,而最高遗传距离为0.5530。图1。在20突变体中找到的ISSR带谱的 UBC 809（a）和UBC 841（b）是在TMS 38和TMS 14之间。用Nei's遗传距离模型产生的所有的突变体矩阵UPGMA种群分析如图2。由6组形成一个主要的种群。第1组由五个突变体形成两个子组,第一子组由三个突变体即TMS 75和TMS61，其遗传距离为0.0453。TMS 35是孤立的子组。第二子群由遗传距离为0.2501的TMS 34和TMS 65组成。第二组由四个突变体组成，即TMS 2和TMS 12和2个集群（ODT和TMS 14）突变体组成，其遗传距离为0.2276。同样，第三组中，TMS 82 、TMS 69的遗传距离为0.2165，用的是两个突变体TMS62、TMS64。第四组由TMS 33和TMS 67，遗传距离为0.2056。第五组包括三个突变体，TMS 32 、TMS 31和一个孤立的集群TMS 66，遗传距离为0.2847，而第六组由TMS 38和TMS 17组成，其遗传距离是0.3329。

表三

Nei's遗传同一性（对角线上方）和遗传距离（对角线下方）

讨论

突变体蚕由自发突变和人工诱变进化而来。其形态特征和突变性状的分离被用来作为遗传分析的基本工具(Doira, 1992; Banno et al., 1994)。蚕品种的培育起源于日本，并被用来研究遗传多样性和物种数量之间的关系。UPGMA集群结果与Nei's遗传距离表明，20突变蚕品种形成于一个主要集群和六个子集群，表明所有的突变体有相同的起源，因为他们属于二化性品种。同样的Similarly Reddy et al. (1999b)从不同的起源分析13个变异体，并将他们分为滞育和非滞育组。

在选定的突变体家蚕遗传品种中，15个ISSR引物共扩增出113条带，占多态性带73.45% 。Li 团队（2007）在中国蚕业研究所进行了ISSR扩增，分析了不同蚕品种之间的遗传关系(SRI-CAAS)。他们确定了保种技术，其中分别聚集应用在在二化性和多化性品种中。在这项研究中，所有的突变体起源于由温带二化性品种形成的种群。然而，突变的蚕品种之间的遗传距离为0.0453～0.5530。TMS 75和TMS 61两个变异蚕之间有较低的遗传距离0.0453，TMS 14和TMS 38之间的遗传距离最高为0.5530，其表明这些突变体具有独特的特征基因。

显然，从一个人工繁殖后被驯化的蚕品种，因为生殖隔离；没有基因在突变体之间交换。在突变体的蚕品种、种群的多样性分析结果表明，观察到的等位基因的平均数（NA）（1.7080±0.4567），有效等位基因数（Ne）（1.5194±0.3950）和Shannon信息指数（Ⅰ）（0.4216±0.2868）。这些结果体现在自交群体中，且在目前的突变体中有较高的遗传变异现象。类似的调查结果在不同地域的蚕，也有报道anthereae roylei(Kar et al., 2005)。在封闭的饲养条件下，饲养家蚕蚕品种包括突变体，高度缺乏随机交配。对此封闭个体之间的交流通常用于维护基因库的延续，因为由于近交，衰退往往是频繁发生的。这些研究结果有助于分析蚕品种杂合性保持，其中的遗传距离表明在每一个遗传个体中没有较大的生殖隔离。

总之，这项研究揭示了突变体之间的亲缘关系。一个主要的种群表明，它们都有属于同一起源的类似的化性。杂合性是对柞桑蚕驯化不同（少数家蚕是野生）(Kar et al., 2005)。然而，突变体间的遗传距离的变化。根据观察到的遗传距离与TMS38和 TMS 14（远亲）比较TMS38和 TMS 14（远亲）蚕和TMS75、 TMS 61可能是近亲。ISSR分子标记的使用显示长度数3–14条，带谱的范围从250到3000 bp，73.45% 的多态性，这表明突变体中的杂合性的适用范围。这也证实了平均有

效等位基因数。研究等位基因遗传多样性。以上研究表明，ISSR标记可以有效地用于系统性分析进化家蚕和杂合性的关系。

参考文献

Abe, H., Sugasaki, T., and Kanehara, M. (2000). Identification and genetic mapping of RAPD markers linked to the densonucleosis refractoriness gene, nsd-2, in the silkworm, Bombyx mori. Genes Genet. Syst. 75: 93−96.

Banno, Y., Noda, K., Kawaguchi, Y., Koga, K., and Doira, H. (1994). Linkage studies on a hemolymph protein of young larval-A4 (PYL-4) of the silkworm, Bombyx mori. J. Seric. Sci. Jpn. 63: 299−302. Berbatzky, R., and Tanksley, S.D. (1989). Restriction fragments as molecular markers for germplasm evaluation and utilization. In The Use of Plant Genetic Resources, A.H.D. Brown, O.H. Frankel,

D.R.Marshel, and J.T. Williams. (New York: Cambridge University Press), pp. 353−362.

Bornet, B., Goraguer, F., Joly, G., and Branchard, M. (2002). Genetic diversity in European and

Argentinean cultivated potatoes (Solanum tuberosum) detected by inter simple sequence repeats (ISSRs). Genome 45: 481 −484.

Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., and Davis, R.W. (1980). Construction of genetic linkage map in man using restriction length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314−331.

Chatterjee, S.N., and Mohandas, T.P. (2003). Identification of ISSRmarkers associated with productivity traits in silkworm, Bombyx mori L. Genome 46: 438−447.

Dayanandhan, S., Bawa, K.S., and Kesseli, R. (1997). Conservation of microsatellite among tropical trees (leguminosae). Am. J. Bot. 84: 1658−1663.

Doira, H. (1992). Genetic stocks and mutation of Bombyx mori. In Important Genetic Resources, Doira, H. ed. Faculty of Agriculture, Kyusu University, Japan.

Felsenstein, J. (1993). PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Department of Genetics, University of Washington, Seattle.

Gabierslsen, T.M., and Brochmann, C. (1998). Sex after all: High levels of diversity detected in theatric clonally plant saxifrage cernua using RAPD markers. Mol. Ecol. 10: 1701 −1708.

Gepts, P. (1993). The use of molecular and biochemical markers in crop evolution studies. Evol. Biol. 27: 51 −94.

Kar, P.K., Vijayan, K., Mohandas, T.P., Nair, C.V., Saratchandra, B. and Thangavelu, K. (2005). Genetic variability and genetic structure of wild and semi-domestic populations tasar silkworm (Antheraea mylita) eco Daba as revealed through ISSR markers. Genetica 125: 173−183.

Knox, E.B., and Palmer, J.D. (1999). The chloroplast genome arrangement of Lobelia thuliniana

(Lobiliaceae): Expression of inverted repeat in an ancestor of the companulales. Plant Syst. Evol. 214: 49−64.

Krishnaswamy, S., Narashimanna, M.N., Suryanarayana, S.K., and Kumaraj, S. (1977). Manual on sericulture. Silkworm rearing (Mysore Publ. Central Silk Board).

Li, M.W., Yao, Q., Hou, C.X., Lu, C., and Chen. K.P. (2001). Studies on RAPD markers linked to the densonucleosis refractoriness gene, nsd-Z, in the silkworm, Bombyx mori L. Sericologia 41: 409−415. Li, M.W., Shen, L., Xu, A.Y., Miao, X.X., Hou, C.X., Sun, P.J, Zhang,Y.H., and Huang, Y.P. (2005). Genetic diversity among the silkworm (Bombyx mori L., Lep, Bombycidae) germplasm revealed by microsatellites. Genome 48: 802−810.

Li, M.W., Hou, C.X., Miao, X.X., Xu, A.Y., and Huang, Y.P. (2007). Analyzing genetic relationship in Bombyx mori using inter simple sequence repeat amplification. J. Econ. Entomol. 100: 202−208.

Lu, C., Yu, H.S., and Xiang, Z.H. (2002). Molecular systematic studies on Chinese mandarina silkworm (Bombyx mandarina M.) and domestic silkworm (Bombyx mori L.). Sci. Agric. Sin. 35: 94−101.

Lu, C., Li, B., Zhao, A., and Xiang, Z. (2004). QTL mapping of economically important traits in silkworm (Bombyx mori). Sci. China Ser. C Life Sci. 47: 477−484.

Miao, X.X., Xu, S.J., Li, M.H., Li, M.W., Huang, J.H., Dai, F.Y.,Marino, S.W., Mills, D.R., Zheng, P.Y., Mita K, Jia, S.H., Zhang, Y.,Liu, W.B., Xiang, H., Guo, Q.H., Xu, A.Y., Kong, X.Y., Lin, H.X.,Shi, Y.Z., Lu, G., Zhang, X., Huang, W., Yasukochi, Y., Sugasaki, T.,Shimada, T., Naga-raju, J., Xiang, Z.H., Wang, S.Y., Goldsmith,M.R., Lu, C., Zhao, G.P., and Huang, Y.P. (2005). Simple sequence repeat-based consensus linkage map of Bombyx mori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 16303−16308.

Nagaraju, J., Reddy, K.D., Nagaraja, G.M., and Sethuraman, B.N. (2001). Comparison of multilocus RFLPs and PCR-based marker systems for genetic analysis of the silkworm, Bombyx mori. Heredity 86: 588−597. Nei, M. (1978). Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89: 583−590.

Reddy, K.D., Abraham, E.G., and Nagaraju, J. (1999a). Microsatellites in the silkworm, Bombyx mori: Abundance, polymorphism, and strain characterization. Genome 42: 1057−1065.

Reddy, K.D., Nagaraju, J., and Abraham, E.G. (1999b). Genetic characterization of the silkworm Bombyx mori by simple sequence repeat (SSR)-anchored PCR. Heredity 83: 681 −687.

Shi, J., and Heckel, D.G., and Goldsmith, M.R. (1995). A genetic linkage map for the domesticated silkworm Bombyx mori based on restriction fragment length polymorphism. Genet. Res. 66: 109−126. Sneath, P.H.A., and Sokal, R.R. (1973). Numerical taxonomy. The principles and practice of numerical classification. (New York: Freeman WH & Co.).

Suzuki, Y., Gage, I., and Brown, D.D. (1972). The genes for silk fibroinin Bombyx mori. J. Mol. Biol. 70: 637−49.

Tan, Y.D., Wan, C.L., Zhu, Y.F., Lu, C., Xiang, Z.H., and Deng, H.W. (2001). An amplified fragment length polymorphism map of the silkworm. Genetics 157: 1277−1284.

Tautz, D. (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res. 17: 6463−6471.

Tsumura, Y.K., Ohba, K., and Strauss, S.H. (1996). Diversity and inheritance of inter-simple repeat polymorphism in Douglas fir (Pseudootsuga menziesii) and Sugi (Crypromeria japonica). Theor. Appl. Genet. 92: 40−45.

Vijayan, K. (2004). Genetic relationships of Japanese and Indian mulberry (Morus spp.) genotypes revealed by DNA fingerprinting. Plant Syst. Evol. 243: 331 −232.

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M. (1995). AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23: 4407−4414.

Williams, J.G.K., Hanafey, M.K., Rafalski, J.A., and Tingey, S.V. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 6531 −6535.

Wolfe, A.D., Xiang, Q.Y., and Kephart, S.R. (1998). Assessing hybridization in natural populations of Penstemon (Scrophulariaceae) using hypervariable inter-simple sequence repeat markers. Mol. Ecol. 7: 1107−1125.

Xia, Q.Y., Zhou, Z.Y., Lu, C., and Xiang, Z.H. (1998). Molecular phylogenetic study on the racial

differentiation of Bombyx mori by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Acta Entomol. Sin. 41: 32−40.

Yao, Q., Li, M.W., Wang, Y., Wang, W.B., Lu, J., Dong, Y., and Chen, K.P. (2003). Screening of molecular markers for NPV resistance in Bombyx mori L. (Lep: Bombycidae). J. Appl. Entomol.127: 134−136. Yasukochi, Y. (1998). A dense genetic linkage map of the silkworm, Bombyx mori, covering all chromosomes based on 1018 molecular markers. Genetics 150: 1513−1525.

Yeh, F.C., and Boyle, T. (1997). POPGENE Ver 1.32. (http:// www.ualberta.ca/fyeh) Microsoft window based freeware for population genetic analysis.

Zietkiewicz, E., Rafalski, A., and Labuda, D. (1994). Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176−183.