作者：周长慧，王征，涂宏刚，黄芳华，王庆利，常艳(国家上海新药安全评价研究中心，国家食品药品监督管理局药品审评中心)编辑：思俊［摘要］ 基于新技术方法的呈出、管理需求的变化和动物福利的考虑，世界经济合作与发展组织(OECD) 化学品检测的指导原则定期得到回顾修订。2014年9月26日，OECD正式生效了几项遗传毒性试验指导原则的最新修订版，包括体外哺乳动物细胞染色体畸变试验、体外哺乳动物细胞微核试验、哺乳动物红细胞微核试验和哺乳动物骨髓染色体畸变试验，同时新增了体内啮齿类碱性彗星试验的指导原则。本文对最新修订版的指导原则与旧版本的指导原则进行对比分析，阐述主要差异点，为国内遗传毒性评价工作的深入开展和遗传毒性指导原则的修订完善提供指导线索。遗传学损伤的诱导和蓄积可导致基因组不稳定，这是恶性肿瘤形成的关键步骤［1］。采用遗传毒性试验评价化合物的遗传毒性，对预测化合物的致癌性有重要的参考意义。目前中国对药物的遗传毒性评价主要遵循的指导原则(TGs) 有国家食品药品监督管理总局(CFDA) 于2007年颁布的药物遗传毒性研究技术指导原则［2］、人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH) 于2011年颁布的S2(R1)［3］，世界经济合作与发展组织(OECD) 陆续颁布的TGs［4］则提供了实验方法学的重要参考。当前被OECD正式批准并现行的化学品遗传毒性评价指导原则TGs 主要有细菌回复突变试验( TG471)［5］、体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473)［6］、哺乳动物红细胞微核试验(TG474)［7］、哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)［8］、体外哺乳动物细胞基因突变试验((TG476)［9］、体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验((TG486)［10］、体外哺乳动物细胞微核试验((TG487)［11］、转基因啮齿类体细胞和生殖细胞基因突变试验((TG488)［12］等。34个OECD成员国和其他合作国家相互承认数据(MAD) ，这就要求在TGs和 GLP条件下获得的数据被监管机构相互接受。OECD TGs 由成员国和其他相关机构的专家达成一致意见，OECD TGs 有普遍的科学性和接受度。因此，OECD遗传毒性TGs 被认为是实施常规遗传毒性试验的金标准。大部分现行的OECD遗传毒性TGs 的最终修订是在20世纪90年代中期，随着对遗传毒性认识的不断提高，遗传毒性新技术和新方法得到完善与发展，尤其是一些体内外遗传毒性试验方法的国际联合验证，积累了丰富的数据，如流式细胞术检测体内微核试验［13-14］和体内彗星试验［15］等。同时体外哺乳动物细胞试验阳性率过高的情况引起了广泛的关注［16］。自2010年起，OECD陆续启动了TGs 的修订工作，并在OECD网站公示修订草案，搜集公众公开评论意见。除修订外，一些很少用的或者有更好替代方法的指导原则被确定为删除/废除的候选。此外，还发展和新增一些新的遗传毒性试验方法的 TG。2014年9月26日，OECD正式生效了几项遗传毒性试验指导原则的最新修订版，包括TG473、TG474、TG475、TG487，此外新增了体内啮齿类碱性彗星试验的指导原则(TG489)［17］。本文主要对最新修订版的指导原则与旧版本的指导原则(TG473-1997，TG474-1997，TG475-1997，TG487-2010) 进行对比分析［18~21］，使用图表形式比较直观地阐述主要差异点，为国内遗传毒性指导原则的修订完善和遗传毒性评价工作的深入开展提供指导线索。1 体外试验1.1 体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473)体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473) 最初于1983年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订，TG473-2014反映了这30年里体外哺乳动物染色体畸变试验各项操作、技术要点和数据解释方面累积的经验。表 1反映了TG473-2014与TG473-1997的主要差异点。
1.2 体外哺乳动物细胞微核试验(TG487)体外哺乳动物细胞微核试验(TG487) 最初于2010年生效，TG487-2014反映了这几年里体外哺乳动物染色体畸变试验各项操作、技术要点和数据解释方面积累的经验。TG487-2014与体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473-2014)有一些共性的更新点，如1.1.3 ~1.1.5，1.1.9~1.1.10，1.1.14~1.1.17，除此之外TG473-2014与TG473-1997主要差异点见表2。
2 体内试验2014年OECD更新的体内试验有2个，即哺乳动物红细胞微核试验(TG474)和哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)，TG474-2014和TG475-2014均强调了实验室熟练度确认的要求，即在进行常规试验之前，实验室必须具备足够的经验开展此项试验。实验室必须有能力复制出至少2个阳性对照品和平行的赋形剂对照品预期的结果，能重现出剂量依赖性增加，并能证实采用骨髓或外周血的试验系统的灵敏度和动态范围。建立历史对照阴性和阳性对照范围和分布，文献建议历史对照数据库包含相同试验条件下的至少10个、最好20个试验的数据。若有充分的历史对照数据的实验室则无需开展熟练度确认试验。此外，体内试验可以不设置阳性对照给药组，但是每个实验必须有阳性对照的计数样本(如固定但尚未染色的玻片或血样)。可通过定期(如6~18个月) 独立开展阳性对照试验获得合数数量的参考样本。2.1 哺乳动物红细胞微核试验(TG474)哺乳动物红细胞微核试验(TG474) 最初于1983年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订。TG474-2014适应了新技术方法的更新成熟，并重视试验的科学性和动物福利。TG474-2014对镜检或自动化检测成熟红细胞中的微核都认可，并建议将体内微核试验与其他一般毒性试验或遗传毒性试验进行整合。但是用自动化方法检测骨髓或外周血微核更便利，对比研究表明有合适的校准标准的自动化检测方法，较镜检有更好的实验室间和实验室内重复性和灵敏度［22~23］。自动化检测方法包括且不限于流式细胞仪、图像分析系统以及激光扫描仪。表3总结了TG474-2014与TG474-1997主要差异点。
2.2 哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475) 最初于1984年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订。TG475-2014与TG474-2014有一些共性的更新点，如2.1.11~2.1.12，2.1.15~2.1.18，除此之外主要差异点见表4。
3 讨论2014年9月，OECD最新更新的4篇指导原则整体上存在修订的共性，如要求做实验室资质确认试验(即实验室熟练度要求) ; 要求建立阴性和阳性历史对照数据库，并对建库方法进行了建议说明; 细化了试验结果的判定标准; 不管是染色体畸变试验还是微核试验，对样本量要求都加大甚至翻倍等。这在一定程度上均能提高遗传毒性试验数据的科学性和可靠性。此外，最新体外试验指导原则对体外细胞株的选择#沉淀浓度的使用和细胞毒性检测方法等提出更多建议; 体外试验最高浓度的降低也反映了ICH S2(R1)的修订变化［3，24］，但是OECD TG的最高浓度高于ICH S2(R1)的要求，OECD TG 适用于所有化学品的检测，人用药物遵循ICH S2(R1)的要求，因为ICH S2(R1)界定的1 mmol·L-1的浓度限值远远高于目前药物的临床暴露量(包括组织蓄积) ，也高于目前临床前体内试验的暴露量。OECD TG743和TG487中界定的10 mmol·L-1或2 mg·L-1也并未降低体外试验预测啮齿类致癌物的灵敏度和特异性［25］，但是对降低体外试验的假阳性作用也很有限，建议更多从细胞系的选择、细胞毒性检测方法、非生理条件和代谢活化系统等角度降低体外试验的假阳性率。OECD对于体内遗传毒性试验TG 的修订，更多考虑了动物实验的3R(替代、减少和优化) 原则，除建议使用经过充分验证的自动化检测方法外，还要求在可行的条件下进行将遗传毒性试验方法整合入重复毒性试验中，获得暴露水平，细化了阴性和阳性结果的接受标准。此外，OECD新增了TG489(体内啮齿类碱性彗星试验) ，以此替代了体内UDS试验方法。建议将体内彗星试验与重复给药毒性试验、体外微核试验等进行整合，暴露和所研究组织的选择应基于受试物可获得的所用信息，如人体拟用途径、代谢和分布、潜在作用接触部位、结构警惕及其他毒性资料。总之，OECD最新 TG 反映了十多年来几个常规遗传毒性试验方法的最新进展，也对遗传毒性实验室开展遗传毒性试验提出了更多技术要求，这有助于提高对化学品(尤其是药物) 安全评价的准确性，也对国内遗传毒性指导原则的修订提供指导和参考。来源：中国新药杂志2015年第24卷第18期
作者：周长慧，王征，涂宏刚，黄芳华，王庆利，常艳(国家上海新药安全评价研究中心，国家食品药品监督管理局药品审评中心)编辑：思俊［摘要］ 基于新技术方法的呈出、管理需求的变化和动物福利的考虑，世界经济合作与发展组织(OECD) 化学品检测的指导原则定期得到回顾修订。2014年9月26日，OECD正式生效了几项遗传毒性试验指导原则的最新修订版，包括体外哺乳动物细胞染色体畸变试验、体外哺乳动物细胞微核试验、哺乳动物红细胞微核试验和哺乳动物骨髓染色体畸变试验，同时新增了体内啮齿类碱性彗星试验的指导原则。本文对最新修订版的指导原则与旧版本的指导原则进行对比分析，阐述主要差异点，为国内遗传毒性评价工作的深入开展和遗传毒性指导原则的修订完善提供指导线索。遗传学损伤的诱导和蓄积可导致基因组不稳定，这是恶性肿瘤形成的关键步骤［1］。采用遗传毒性试验评价化合物的遗传毒性，对预测化合物的致癌性有重要的参考意义。目前中国对药物的遗传毒性评价主要遵循的指导原则(TGs) 有国家食品药品监督管理总局(CFDA) 于2007年颁布的药物遗传毒性研究技术指导原则［2］、人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH) 于2011年颁布的S2(R1)［3］，世界经济合作与发展组织(OECD) 陆续颁布的TGs［4］则提供了实验方法学的重要参考。当前被OECD正式批准并现行的化学品遗传毒性评价指导原则TGs 主要有细菌回复突变试验( TG471)［5］、体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473)［6］、哺乳动物红细胞微核试验(TG474)［7］、哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)［8］、体外哺乳动物细胞基因突变试验((TG476)［9］、体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验((TG486)［10］、体外哺乳动物细胞微核试验((TG487)［11］、转基因啮齿类体细胞和生殖细胞基因突变试验((TG488)［12］等。34个OECD成员国和其他合作国家相互承认数据(MAD) ，这就要求在TGs和 GLP条件下获得的数据被监管机构相互接受。OECD TGs 由成员国和其他相关机构的专家达成一致意见，OECD TGs 有普遍的科学性和接受度。因此，OECD遗传毒性TGs 被认为是实施常规遗传毒性试验的金标准。大部分现行的OECD遗传毒性TGs 的最终修订是在20世纪90年代中期，随着对遗传毒性认识的不断提高，遗传毒性新技术和新方法得到完善与发展，尤其是一些体内外遗传毒性试验方法的国际联合验证，积累了丰富的数据，如流式细胞术检测体内微核试验［13-14］和体内彗星试验［15］等。同时体外哺乳动物细胞试验阳性率过高的情况引起了广泛的关注［16］。自2010年起，OECD陆续启动了TGs 的修订工作，并在OECD网站公示修订草案，搜集公众公开评论意见。除修订外，一些很少用的或者有更好替代方法的指导原则被确定为删除/废除的候选。此外，还发展和新增一些新的遗传毒性试验方法的 TG。2014年9月26日，OECD正式生效了几项遗传毒性试验指导原则的最新修订版，包括TG473、TG474、TG475、TG487，此外新增了体内啮齿类碱性彗星试验的指导原则(TG489)［17］。本文主要对最新修订版的指导原则与旧版本的指导原则(TG473-1997，TG474-1997，TG475-1997，TG487-2010) 进行对比分析［18~21］，使用图表形式比较直观地阐述主要差异点，为国内遗传毒性指导原则的修订完善和遗传毒性评价工作的深入开展提供指导线索。1 体外试验1.1 体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473)体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473) 最初于1983年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订，TG473-2014反映了这30年里体外哺乳动物染色体畸变试验各项操作、技术要点和数据解释方面累积的经验。表 1反映了TG473-2014与TG473-1997的主要差异点。
1.2 体外哺乳动物细胞微核试验(TG487)体外哺乳动物细胞微核试验(TG487) 最初于2010年生效，TG487-2014反映了这几年里体外哺乳动物染色体畸变试验各项操作、技术要点和数据解释方面积累的经验。TG487-2014与体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473-2014)有一些共性的更新点，如1.1.3 ~1.1.5，1.1.9~1.1.10，1.1.14~1.1.17，除此之外TG473-2014与TG473-1997主要差异点见表2。
2 体内试验2014年OECD更新的体内试验有2个，即哺乳动物红细胞微核试验(TG474)和哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)，TG474-2014和TG475-2014均强调了实验室熟练度确认的要求，即在进行常规试验之前，实验室必须具备足够的经验开展此项试验。实验室必须有能力复制出至少2个阳性对照品和平行的赋形剂对照品预期的结果，能重现出剂量依赖性增加，并能证实采用骨髓或外周血的试验系统的灵敏度和动态范围。建立历史对照阴性和阳性对照范围和分布，文献建议历史对照数据库包含相同试验条件下的至少10个、最好20个试验的数据。若有充分的历史对照数据的实验室则无需开展熟练度确认试验。此外，体内试验可以不设置阳性对照给药组，但是每个实验必须有阳性对照的计数样本(如固定但尚未染色的玻片或血样)。可通过定期(如6~18个月) 独立开展阳性对照试验获得合数数量的参考样本。2.1 哺乳动物红细胞微核试验(TG474)哺乳动物红细胞微核试验(TG474) 最初于1983年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订。TG474-2014适应了新技术方法的更新成熟，并重视试验的科学性和动物福利。TG474-2014对镜检或自动化检测成熟红细胞中的微核都认可，并建议将体内微核试验与其他一般毒性试验或遗传毒性试验进行整合。但是用自动化方法检测骨髓或外周血微核更便利，对比研究表明有合适的校准标准的自动化检测方法，较镜检有更好的实验室间和实验室内重复性和灵敏度［22~23］。自动化检测方法包括且不限于流式细胞仪、图像分析系统以及激光扫描仪。表3总结了TG474-2014与TG474-1997主要差异点。
2.2 哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475) 最初于1984年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订。TG475-2014与TG474-2014有一些共性的更新点，如2.1.11~2.1.12，2.1.15~2.1.18，除此之外主要差异点见表4。
3 讨论2014年9月，OECD最新更新的4篇指导原则整体上存在修订的共性，如要求做实验室资质确认试验(即实验室熟练度要求) ; 要求建立阴性和阳性历史对照数据库，并对建库方法进行了建议说明; 细化了试验结果的判定标准; 不管是染色体畸变试验还是微核试验，对样本量要求都加大甚至翻倍等。这在一定程度上均能提高遗传毒性试验数据的科学性和可靠性。此外，最新体外试验指导原则对体外细胞株的选择#沉淀浓度的使用和细胞毒性检测方法等提出更多建议; 体外试验最高浓度的降低也反映了ICH S2(R1)的修订变化［3，24］，但是OECD TG的最高浓度高于ICH S2(R1)的要求，OECD TG 适用于所有化学品的检测，人用药物遵循ICH S2(R1)的要求，因为ICH S2(R1)界定的1 mmol·L-1的浓度限值远远高于目前药物的临床暴露量(包括组织蓄积) ，也高于目前临床前体内试验的暴露量。OECD TG743和TG487中界定的10 mmol·L-1或2 mg·L-1也并未降低体外试验预测啮齿类致癌物的灵敏度和特异性［25］，但是对降低体外试验的假阳性作用也很有限，建议更多从细胞系的选择、细胞毒性检测方法、非生理条件和代谢活化系统等角度降低体外试验的假阳性率。OECD对于体内遗传毒性试验TG 的修订，更多考虑了动物实验的3R(替代、减少和优化) 原则，除建议使用经过充分验证的自动化检测方法外，还要求在可行的条件下进行将遗传毒性试验方法整合入重复毒性试验中，获得暴露水平，细化了阴性和阳性结果的接受标准。此外，OECD新增了TG489(体内啮齿类碱性彗星试验) ，以此替代了体内UDS试验方法。建议将体内彗星试验与重复给药毒性试验、体外微核试验等进行整合，暴露和所研究组织的选择应基于受试物可获得的所用信息，如人体拟用途径、代谢和分布、潜在作用接触部位、结构警惕及其他毒性资料。总之，OECD最新 TG 反映了十多年来几个常规遗传毒性试验方法的最新进展，也对遗传毒性实验室开展遗传毒性试验提出了更多技术要求，这有助于提高对化学品(尤其是药物) 安全评价的准确性，也对国内遗传毒性指导原则的修订提供指导和参考。来源：中国新药杂志2015年第24卷第18期