多糖的提取和分析方法

第22卷第3期化工时刊Vol.22,No.3

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年3月ChemicalIndustryTimesMar.3.2008

多糖的提取和分析方法

刘　婷　周光明

(西南大学化学化工学院,重庆400715)

摘　要　对近年来多糖的最新提取和分析方法,按不同方面分析的分类对多糖的一些分析检测技术进行了综述,并对各种检测技术从方法、操作等方面进行了优缺点比较,为多糖分析的进一步发展研究提供参考。关键词　多糖　提取　分析方法

ExtractionandAnalyticalmethodofPolysaccharides

LiuTing　ZhouGuangming3

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SouthwestUniversity,Chongqing400715)

Abstract　Thenewestextractionandanalyticalmethodofin,andsome

analysisanddeterminationtechnologyforpolysaccharidesweretodifferentpartsofanalysis1Moreover,accordingtotheofdeterminationtechnologythecomparisonofthethereferencesforthefurtherdevelopmentsandre2searchmentsof1The44referenceswereadopted1

Keywords　extraction　analyticalmethod

　　糖类是自然界中存在最多的有机化合物,也是重

要的生物高分子化合物和信息物质。多糖(polysac2charides,PS)分布广泛,在高等植物,细菌,真菌,藻类

提取率的同时,由于多糖不耐酸碱,因此会使部分多糖分解,也存在着一定的不足。

谢红旗等[12],利用酶法提起香菇多糖,将香菇500g,粉碎,加适量水,加入115%中性蛋白酶在50℃

以及动物体内含量丰富。

20世纪60年代以来,人们逐渐发现多糖具有复

和pH值为418条件下酶解60min,加水至10L,然后升温至95℃,使生物酶失活,

在95℃温度下药物提取器中恒温提取2h,滤布过滤,收集滤液。酶解法可以大大提高多糖的提取效率,并且降低蛋白质含量。但药品价格较贵,温度控制严格,操作成本较高。

现发展出用超声波和微波辅助多糖提取法。李俊等[13],利用超声波辅助提取罗汉果多糖,取干燥、粉碎的罗汉果100g根据实验条件中入50℃热水,超声波提取3次,每次5min,合并各次提取液,减压浓缩;往浓缩液中加入95%乙醇使罗汉果多糖沉淀,高速离心15min得到沉淀,用丙酮洗涤5次,在-50℃下冷冻干燥,得罗汉果粗多糖。经过实验证明,超声波辅助提取多糖明显提高多糖的提取率。

杂多样的生物活性和功能[1～9],如多糖有免疫调节功能可作为广谱免疫促进剂,作为药物可以治疗风湿病,慢性病毒性肝炎,癌症等;还具有抗病毒,抗感染,抗辐射,抗凝血,降血糖,降血脂,消除氧化自由基,促进核酸与蛋白质的生物合成等作用。多糖的分析方法也有很多,且日益受到人们的关注和研究。

　　多糖为大分子化合物,易溶于水,通常采用水提醇沉法[10],但耗时较长,且提取效率不高。为了提高多糖的提取效率,在水提醇沉法的基础上发展了碱提取法[9],酸提取法[11]。此两种方法在大大提高多糖

收稿日期:2007-11-19

基金项目:重庆市自然科学基金(CSTC2007BB5370)

作者简介:刘婷(1984～),女,硕士生;周光明(1964～),男,教授,研究方向:分析化学

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刘　婷等　多糖的提取和分析方法　　　　　　　　　　　　　　　　　20081Vol122,No.3　化工时刊微波辅助提取是利用微波能的加热效应来加速溶剂对固体样品中目标化合物的提取的新技术。邓永智等[14]利用微波辅助提取法通过正交实验法从海水小球藻中提取多糖,在70℃,功率为600W,提取时间为30min的条件下海水小球藻中的多糖可以得到较好的提取。超声波和微波辅助提取多糖操作简单,且不会引入杂质,是很好的多糖提取方法。

法。212　多糖的组分分析

多糖组分的分离测定方法目前主要有高效液相色谱法(HPLC),气相色谱法(GC),薄层色谱法(TLC),高效毛细管电泳法(HPCE)等。

杨兴斌等[21]采用1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化反相高效液相色谱法,建立了9种常见单糖的分离模式,并成功地用于当归多糖的单糖组成分析,具有良好的重现性,结果表明,当归多糖由甘露糖,鼠李糖,葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,葡萄糖,半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组成,其物质的量比为0157∶1100∶0113∶3106∶8116∶7117∶12169。该方法灵敏快速,准确,方便,可在线大批量分析。

邓永智等[14],在MS参数:VF-5MS毛细管色谱柱(m×0mm,美国);进样口温度280/至210℃,保持,0mL/min;离子化模

211　多糖的含量分析

由于糖类具有还原性,在多糖的定量测定方面可

以根据糖的还原性进行测定,也可将糖转化成为糖醛衍生物进行测定。

经典的多糖测定方法为苯酚-硫酸法[15]和蒽酮-硫酸法[16],均以无水葡萄糖为对照品,分光光度法

测定,计算含量。这两种方法快速、方便、准确,但这两种测定方法对有色样品都不理想,苯酚-样品颜色的影响更大,-]-,结果分别为0185±0101%,1141%±0106%,和2163%±0127%,傅傅强等[18]认为这一结果偏低,主要是以葡萄糖作标准曲线的原因,并提出以校正因子修正测定结果,同时测定了江西獒源的红茶、绿茶和乌龙茶的茶多糖含量,分别为3%～315%、4117%～6135%、3110%～3153%。比较两种计算方法的结果,相差很大,一方面是因品种、加工方法等的差异导致的,另一方面是因为用作计算校正因子的茶多糖为非纯品,使得校正因子偏大而导致的。

最近有学者比较研究了苯酚-硫酸法和间接碘量法[19]测定灵芝多糖,间接碘量法可分别测定样品中总糖和还原糖的含量,消除了样品还原性杂质的干扰,所测结果更接近实际多糖含量。通过改进间接碘量法,使滴定过程不需要在沸腾状态下进行,从而除去了温度条件对滴定结果的干扰,使反应更易控制。间接碘量法具有干扰少准确度高的特点,但与苯酚-硫酸法相比,操作过程较为烦琐。

多糖含量的测定还有3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法,该方法操作简单,快速,灵敏度高,杂质干扰较小。王红英[20]等利用该法测定麦冬多糖含量,精确度高。重现性好。是一种可取的多糖常规测定方

离子化能量70eV;离子阱温度180℃;接口温度280℃;质量扫描范围40～550amu的条件下利用气相色谱-质谱联用法分析了海水小球藻多糖的单糖组成。

颜军等[22]通过斑点分离度,清晰度,有无拖尾现象及展层时间等方面,利用薄层色谱法快速分析了多糖的单糖组成,通过实验确定了适合的展开剂为展开系统(乙酸乙脂∶吡啶∶无水乙醇∶水=8∶2∶1∶2),合适的显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂。

耿越等[23]采用高效毛细管电泳法测定玉米花粉多糖中单糖的组成,样品经水解后,经α-萘胺衍生化,电泳条件为:缓冲液为75mmol/L硼砂溶液(pH=915);柱温22℃;电压16kV;检测波长200nm;气压进样,进样时间为5s。测得玉米花粉多糖主要由葡萄糖,阿拉伯糖和半乳糖3种单糖组成。该方法操作简单,精度高,可成为测定多糖中单糖组分的方法。周蓉[24],季宇彬[25]等也利用高校毛细管电泳法成功分析了甘草多糖以及龙葵多糖的单糖组分。

综合各类方法,HPLC有分离速度快,分辨率高,分离效率好,重现性好,不破坏样品的优点。但糖类本身没有紫外吸收,只能采用示差折光监测器(R1)或蒸发光散射检测器(ELSD)检测。RI分辨率低,而ELSD效果虽好却价格昂贵。另外,采用HPLC分析

时,色谱柱的选择比较困难。一般采用氨基柱但分离

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20081Vol122,No.3　　　　　　　　　　　　　　　　　　论文综述《OverviewofThesises》化工时刊　

效果不够理想,而专用的糖柱又十分昂贵。采用GC

测定糖类时,由于糖本身没有足够的挥发性,所以必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发以及对热稳定的衍生物。此外,由于糖的异构化,在某些衍生物的制备过程中,还会产生衍生物的异构化,使色谱分析时每种糖产生多个峰,这往往影响组分的分离和定量。液相色谱(TLC)是一种微量而快速的分析方法,它兼备了柱层析和纸层析两者的优点而且操作方便,设备简单,容易掌握,便宜,灵活的特点。但样品不能回收,展开剂和显色剂的选择也要求严格。HPCE技术具有样品用量少,时间短,灵敏度高,分离效果明显的特点,在糖类物质的检测方面具有独特的优势。

近年来,离子色谱法测定糖类逐渐被学者们所关注,离子色谱鉴于糖类化合物分子具有电化学活性及

35]

在强碱溶液中呈离子化状态,Roxklin等[26、于1983年首先报道了用阴离子交换色谱柱分离,测器测定糖的新方法()0101～012mol/流动相pHpKa值的方法可明显增加分离的选择性[27～28]。因为阴离子交换分离是在碱性条件下完成的,检测方法必须与此相匹配。用金电极的脉冲安培监测器适合这个条件[29～33]。Cai等[34]用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法直接同时分析了血清中多种糖类,利用梯度洗脱在16min内将葡萄糖、核糖、麦芽糖、异麦芽糖分离开来,再直接用脉冲安培法检测,无需衍生。Tom2maso等[35]也用该法成功分离测定了牛奶中的单糖及多糖组分,效果良好。离子色谱法,操作简单,结果准确,是一种快速、便捷的检测方法。但由于离子色谱对进样样品要求较高,样品前处理步骤要求严格,但在糖类检测方面具有自身突出优势。213　多糖的结构分析

多糖的结构分析在近年来采用了许多先进的仪器设备,分析方法和手段都有了很大的提高。主要有紫外光谱法、红外光谱法和核磁共振分析法,现分别介绍如下:

紫外光谱分析[36]:多糖样品溶于水中放置一夜,在10000r/min下离心20min,上清液加入乙醇沉淀。沉淀用乙醚,丙酮洗涤,真空干燥,进行紫外扫描,在270～280cm处有强吸收峰。—68

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红外光谱分析:利用红外光谱,主要可以鉴定多糖中是否含有硫酸基(1260～1210cm-1)及硫酸基的取代位置(800～950cm-1)。红外光谱扫描茶叶多糖具有一般多糖类的特征吸收峰(4000～6500cm-1),黄桂宪等[37]从茶叶废渣中提取出来的

灰色多糖TPS-3在3415～3280cm-1和1665～1635cm-1处均有一般多糖物质的特征吸收峰。

核磁共振分析:应用13CNMR可以鉴别多糖中糖苷键位置,确认多糖中是否有甲氧基取代及其取代的位置和硫酸基的取代位置。利用1HNMR进一步确认多糖结构。林晓之等[38]就对海藻多糖的组成及结构利用FT-IR和13CNMR两种光谱手段做了深入的研究,从而确定了各类海藻多糖的结构组成。

在糖的结构分析方法,[39,,,,光散射法,超过滤法[40]等。

利用化学方法分析多糖中单糖的组成的主要是通过水解,使多糖中单糖相互间连接的糖苷键断裂,释放出单糖,再运用色谱手段,对单糖进行定性定量。常用的水解方法有硫酸水解法[41],盐酸水解法[42]和三氟乙酸水解法[43]等。硫酸水解法使用硫酸因具有一定的氧化性,会破坏一部分多糖,使分析结果准确度降低;盐酸水解法虽避免了氧化性,但耗时太长,不实用;三氟乙酸水解法使用的三氟乙酸毒性较大,也具有一定的局限性。邓永智等[14],利用超声辅助水解法,则是一种方便、快速、水解较为彻底的方法。当超声波作用时间为90min,超声波功率为300W,水解液为1mol/L乙酸时,效果最好。

　　近年来,多糖的分析检测的研究逐渐被人们所重视,本文仅是对部分多糖提取和分析方法进行了介绍,对于简单样品的分析可选用较为简便的方法直接分析测定,对于复杂样品,应采用适当方式富集、分离后再进行检测,或采用选择性和灵敏度高的技术。而离子色谱法作为一种高效,便捷的分析检测方法在分析测定多糖方面的研究却相对较少,为了多糖的分析研究的进一步发展,为了寻找一条更高速、快捷、准确的分析方法之路,离子色谱法测定多糖应引起学者们

刘　婷等　多糖的提取和分析方法　　　　　　　　　　　　　　　　　20081Vol122,No.3　化工时刊的广泛重视。

参考文献

[1]　陈昌福1植物多糖[J]1病害防治,2007,(5):50～51[2]　王慧铭,孙炜,项伟岚,潘宏铭1鳖甲多糖对小鼠免疫调

[17]　汪东风,谢晓风,杨敏1粗老茶叶治糖尿病的药理成分

[J]1中草巧,1995,26(5):255～257

[18]　傅博强,谢明勇,聂少平1茶叶中多糖含量的测定[J]1

食品科学,2001,(11):69～73

[19]　赵阳楠,常继东1苯酚硫酸法和间接碘量法测定灵芝

节作用的研究[J]1中国中药杂志,2007,32(12):1245～

1247

[3]　徐文清,高文远,王月英,李美佳1银耳多糖硫酸酯的合

多糖含量比较[J]1食用茵,2007,(3):58～61

[20]　王红英,钱斯日古楞,赵前程,藏姝,等13,5-二硝基水

杨酸比色法测定麦冬多糖含量[J]1沈阳农业大学学报,2005,36(5):628～630

[21]　杨兴斌,赵燕,周四元,刘莉,王海芳,梅其炳1柱前衍

成及抗肿瘤作用的研究[J]1中国药学杂志,2007,42

(8):630～632

[4]　TanFeng,DengJun1Analysisoftheconstituentsandantisenile

functionofAchyranthesbidentatapolysaccharides[J]1ActaB2otanicaSinica,2002,44(7):795～798

[5]　谢少凡,柳欣,蒋明,刘长林,刘剑峰1硫酸乙酰肝素多

生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成[J]1分析化学,2005,33(9):1287～1290

[22]　颜军,郭晓强,李晓光,郭晓勇,苟小军1TLC快速分析

多糖的单糖组成[J]1食品科学,2006,27(12):603～607

[23]　耿越,王建波,刘靓雯,张明伟,刘书明1高效毛细管电

糖类似物的抗乳腺癌活性研究进展[J]1中国新药杂志,

2007,16(1):11～16

[6]　张海容1沙棘果皮多糖清楚氧自由基的活性研究[J]1

[J]1中草药,

,36(8):1164]　,,,甘草多糖的分离

植物学通报,2005,22(6):703～707

[7]　袁强,袁弘1[J]1分析化学,1999,27

(:245

[25]　季宇彬,王帅帅,汲晨锋1龙葵多糖含量测定及组分分

影响[J]1)[8]　张元琳,,]1食品科学2007,28(2):

305～308

[9]　吴琼,郑成,宁正祥,刘本国,董华强1碱溶性银耳粗多

析[J]1分析化学,2006,34(11):1665

[26]　RendlemanJA1Ionizationofcarbohydratesinthepresenceof

metalhydroxidesandoxides,carbhydratesinsolution[J]1Ad2vancesinChemistrySeries1WashingtonDC:AmericanChem2icalSociety,1973,117:51

[27]　金利通,刘彤,周满水,方禹之1高压液相色谱磷钼杂

糖的提取及其清除自由基作用的研究[J]1食品科学,

2007,28(6):153～155

[10]　黄森,查学强,罗建平,于龙1Box-Behnken法优化提取

霍山石斛活性多糖的研究[J]1中药材,2007,30(5):591～594

[11]　刘贝贝,李小定,潭正林,吴谋成1菜籽饼粕中多糖的

多酸修饰电极安培检测儿茶酚胺类神经递质的研究

[J]1高等学校化学学报,1993,14(7):914～917

[28]　牟世芬,李宗利1阴离子交换分离。脉冲安培检测分

酸提取工艺优化[J]1农业工程学报,2006,22(11):213～216

[12]　谢红旗,周春山,杜邵龙,周尽花1酶法提取,超滤分离

析糖类化合物的进展[J]1色谱,1995,13(5):320～324

[29]　LouisetteJ,BasaandMichaelW1Analysisofglycoprotein-deriveroligosaccharidesbyhigh-pHanion-exchangechro2matography[J]1JournalofChromatographyA,1990,499:205

香菇多糖新工艺研究[J]1食品科学,2007,28(4):217～

219

[13]　李俊,黄锡山,张艳军,苏小建,何星存1超声波法提取

～202

[30]　CarboPacPA10andCarboPacM

A1product1Manual1Sunny2

vale1CA1American:DionexCoporation,2004,4:15[31]　PeterHermentin,ReinhildWitzel,JohannesFG,vliegenthaxt,

JohannisPKamerling,ManffedNimtzandHaraldSConradt1AstrategyforthemappingofN-glycansbyhigh-pHanion-exchangechromatographywithpulsedamperometricdetec2tion[J]1AnalyticalBiochemistry11992,203:281～289[32]　KoykoKoizumi,YokoKubota,HisakoOzaki,Shigenobu

Keiko,MasakoFukudaandToshikoTanimoto1Analysesofi2somericmono-O-methyl-D-glucoses,D-glucobioses

罗汉果多糖的工艺研究[J]1中药材,2007,30(4):475～

477

[14]　邓永智,李文权,袁东星1海水小球藻中多糖的提取及

其单糖组成的气相色谱-质谱分析[J]1分析化学,

2006,34(12):1697～1701

[15]　赵玉英1蒙成药哈日阿布日-16中多糖的组分和糖含

量研究[J]1光谱学与光谱分析,2005,314～316

[16]　王黎明,夏文水1蒽酮-硫酸法测定茶多糖含量的研

究[J]1食品科学,2005,26(7):185～188

—69—

20081Vol122,No.3　　　　　　　　　　　　　　　　　　论文综述《OverviewofThesises》化工时刊　

andD-glucosemonophosphatesbyhighperformanceanion-exchangechromatographywithpulsedamperometricdetection[J]1JournalofChroltmtographyA,1992,595:340～345

[33]　牟世芬,刘克纳,丁晓静编著1离子色谱方法及应用

[M]1第二版1北京:化学工业出版社,2005;76～82

[34]　YaqiCai,JingshenLiu,YaliShi,LinaLiangandShifen

Mou1Determinationofseveralsugarsinserumbyhigh-per2formanceanion-exchangechromatographywithpulsedam2perometricdetection[J]1JoumalofChromatographyA12005,1085(1):98～103

[35]　TommasoRICataldi,MassimilianoAngelotti,GiulianaBian2

co1Determinationofmono-anddisaccharidesinmilkandmilkproductsbyhigh-performanceanion-exchangechro2matographywithpulsedamperometricdetection[J]1AnalyticaChimicaActa12003,485:43～49

[36]　孙玉军,木通多糖的分离纯化及部分理化性质测定

[J]1安徽技术师范学院学报,2001,15(4):60～61

[37]　黄桂宪,等1广西绿茶多糖分离与分析[J]1中国茶叶,

1995,(5):18～19

[38]　林晓之,唐渝,张渊明,[39]　周林,郭祀远,蔡妙颜,李琳1粘度法测定水溶液中裂

褶多糖相对分子质量[J]1功能高分子学报,2005,18

(4):692～695

[40]　张惟杰著1复合多糖生化研究技术[M]1上海:上海科

学技术出版社,1987,77～120

[41]　JDeanPakulski,RonaldBenner1Animprovedmethodforthe

hydrdysisandMBTHanalysisofdissolvedandparticulatecar2bohydratesinseawater[J]1MarineChemistry,1992,40:143

～160

[42]　SverreMMyklestad,EiinSkanoy,SolveigHestmann1Asensi2

tiveandrapidmethodforanalysisofdissolvedmono-andpolysaecharidesinseawater[J]1MarineChemistry,1997,(56):279～286

[43]　DeRuiterGA,ScholsHA1Carbohydrateanalysisofwater-solubleuronicacid-containingpolysaccharideswithhigh-performance

anion

-using

issuperiortofour[J],1992,207(1):,张丽颖1国内中药多糖的提取分离及分析研

](12117究概况[J]1药物分析杂志,2005,25(10):1285～1288

简

　讯

复旦大学化学系发明合成双氯芬酸类药物新路

由复旦大学化学系陈芬儿教授领衔的课题组发明的一条合成双氯芬酸类药物新路,突破了国内外30年来一直采用的传统生产工艺,极大地改善了严重环境污染现状和工人劳动强度条件,其原料成本大幅下降,在国际竞争中处于领先地位。凭借这一突破性的成果,复旦大学化学系陈芬儿课题组荣获2007年科技进步二等奖。

陈芬儿教授历经十多年发明的合成新工艺,使双氯芬酸钠的原料成本大幅下降,产品质量显著提高,从而迫使瑞士、日本、美国、德国等国相继停产而转向从我国进口。陈芬儿教授该发明技术在国内某制药公司实现工业化生产,产生了重大经济效益,占领了80%的国际市场份额。

芬欧汇川集团利用新技术生产造纸纤维和生化产品

芬欧汇川集团日前与芬兰一家科技公司—Chempolis公司签署技术特许协议,利用一项新技术生产造纸纤维和生物化学产品。通过利用这项新技术,芬欧汇川集团将在中国采用农业生产所产生的剩余物,连同其他非木质原料,例如麦草和芦苇,都能作为原料用于生产纸浆和生物化学产品。

2007年4月,芬欧汇川集团在江苏省常熟市建成的芬欧汇川亚洲研发中心一直负责研究当地纤维原材料,并将就如何利用

农业剩余物生产纸浆开展基础研究。芬欧汇川集团目前正在中国考察建立农业剩余物工业综合利用项目的可能性。这一农业剩余物综合利用项目将成为世界上第一个使用Chempolis公司技术投入工业化规模生产的项目。

(沈镇平)

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多糖的提取和分析方法

刘　婷　周光明

(西南大学化学化工学院,重庆400715)

摘　要　对近年来多糖的最新提取和分析方法,按不同方面分析的分类对多糖的一些分析检测技术进行了综述,并对各种检测技术从方法、操作等方面进行了优缺点比较,为多糖分析的进一步发展研究提供参考。关键词　多糖　提取　分析方法

ExtractionandAnalyticalmethodofPolysaccharides

LiuTing　ZhouGuangming3

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SouthwestUniversity,Chongqing400715)

Abstract　Thenewestextractionandanalyticalmethodofin,andsome

analysisanddeterminationtechnologyforpolysaccharidesweretodifferentpartsofanalysis1Moreover,accordingtotheofdeterminationtechnologythecomparisonofthethereferencesforthefurtherdevelopmentsandre2searchmentsof1The44referenceswereadopted1

Keywords　extraction　analyticalmethod

　　糖类是自然界中存在最多的有机化合物,也是重

要的生物高分子化合物和信息物质。多糖(polysac2charides,PS)分布广泛,在高等植物,细菌,真菌,藻类

提取率的同时,由于多糖不耐酸碱,因此会使部分多糖分解,也存在着一定的不足。

谢红旗等[12],利用酶法提起香菇多糖,将香菇500g,粉碎,加适量水,加入115%中性蛋白酶在50℃

以及动物体内含量丰富。

20世纪60年代以来,人们逐渐发现多糖具有复

和pH值为418条件下酶解60min,加水至10L,然后升温至95℃,使生物酶失活,

在95℃温度下药物提取器中恒温提取2h,滤布过滤,收集滤液。酶解法可以大大提高多糖的提取效率,并且降低蛋白质含量。但药品价格较贵,温度控制严格,操作成本较高。

现发展出用超声波和微波辅助多糖提取法。李俊等[13],利用超声波辅助提取罗汉果多糖,取干燥、粉碎的罗汉果100g根据实验条件中入50℃热水,超声波提取3次,每次5min,合并各次提取液,减压浓缩;往浓缩液中加入95%乙醇使罗汉果多糖沉淀,高速离心15min得到沉淀,用丙酮洗涤5次,在-50℃下冷冻干燥,得罗汉果粗多糖。经过实验证明,超声波辅助提取多糖明显提高多糖的提取率。

杂多样的生物活性和功能[1～9],如多糖有免疫调节功能可作为广谱免疫促进剂,作为药物可以治疗风湿病,慢性病毒性肝炎,癌症等;还具有抗病毒,抗感染,抗辐射,抗凝血,降血糖,降血脂,消除氧化自由基,促进核酸与蛋白质的生物合成等作用。多糖的分析方法也有很多,且日益受到人们的关注和研究。

　　多糖为大分子化合物,易溶于水,通常采用水提醇沉法[10],但耗时较长,且提取效率不高。为了提高多糖的提取效率,在水提醇沉法的基础上发展了碱提取法[9],酸提取法[11]。此两种方法在大大提高多糖

收稿日期:2007-11-19

基金项目:重庆市自然科学基金(CSTC2007BB5370)

作者简介:刘婷(1984～),女,硕士生;周光明(1964～),男,教授,研究方向:分析化学

—66—

刘　婷等　多糖的提取和分析方法　　　　　　　　　　　　　　　　　20081Vol122,No.3　化工时刊微波辅助提取是利用微波能的加热效应来加速溶剂对固体样品中目标化合物的提取的新技术。邓永智等[14]利用微波辅助提取法通过正交实验法从海水小球藻中提取多糖,在70℃,功率为600W,提取时间为30min的条件下海水小球藻中的多糖可以得到较好的提取。超声波和微波辅助提取多糖操作简单,且不会引入杂质,是很好的多糖提取方法。

法。212　多糖的组分分析

多糖组分的分离测定方法目前主要有高效液相色谱法(HPLC),气相色谱法(GC),薄层色谱法(TLC),高效毛细管电泳法(HPCE)等。

杨兴斌等[21]采用1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化反相高效液相色谱法,建立了9种常见单糖的分离模式,并成功地用于当归多糖的单糖组成分析,具有良好的重现性,结果表明,当归多糖由甘露糖,鼠李糖,葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,葡萄糖,半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组成,其物质的量比为0157∶1100∶0113∶3106∶8116∶7117∶12169。该方法灵敏快速,准确,方便,可在线大批量分析。

邓永智等[14],在MS参数:VF-5MS毛细管色谱柱(m×0mm,美国);进样口温度280/至210℃,保持,0mL/min;离子化模

211　多糖的含量分析

由于糖类具有还原性,在多糖的定量测定方面可

以根据糖的还原性进行测定,也可将糖转化成为糖醛衍生物进行测定。

经典的多糖测定方法为苯酚-硫酸法[15]和蒽酮-硫酸法[16],均以无水葡萄糖为对照品,分光光度法

测定,计算含量。这两种方法快速、方便、准确,但这两种测定方法对有色样品都不理想,苯酚-样品颜色的影响更大,-]-,结果分别为0185±0101%,1141%±0106%,和2163%±0127%,傅傅强等[18]认为这一结果偏低,主要是以葡萄糖作标准曲线的原因,并提出以校正因子修正测定结果,同时测定了江西獒源的红茶、绿茶和乌龙茶的茶多糖含量,分别为3%～315%、4117%～6135%、3110%～3153%。比较两种计算方法的结果,相差很大,一方面是因品种、加工方法等的差异导致的,另一方面是因为用作计算校正因子的茶多糖为非纯品,使得校正因子偏大而导致的。

最近有学者比较研究了苯酚-硫酸法和间接碘量法[19]测定灵芝多糖,间接碘量法可分别测定样品中总糖和还原糖的含量,消除了样品还原性杂质的干扰,所测结果更接近实际多糖含量。通过改进间接碘量法,使滴定过程不需要在沸腾状态下进行,从而除去了温度条件对滴定结果的干扰,使反应更易控制。间接碘量法具有干扰少准确度高的特点,但与苯酚-硫酸法相比,操作过程较为烦琐。

多糖含量的测定还有3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法,该方法操作简单,快速,灵敏度高,杂质干扰较小。王红英[20]等利用该法测定麦冬多糖含量,精确度高。重现性好。是一种可取的多糖常规测定方

离子化能量70eV;离子阱温度180℃;接口温度280℃;质量扫描范围40～550amu的条件下利用气相色谱-质谱联用法分析了海水小球藻多糖的单糖组成。

颜军等[22]通过斑点分离度,清晰度,有无拖尾现象及展层时间等方面,利用薄层色谱法快速分析了多糖的单糖组成,通过实验确定了适合的展开剂为展开系统(乙酸乙脂∶吡啶∶无水乙醇∶水=8∶2∶1∶2),合适的显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂。

耿越等[23]采用高效毛细管电泳法测定玉米花粉多糖中单糖的组成,样品经水解后,经α-萘胺衍生化,电泳条件为:缓冲液为75mmol/L硼砂溶液(pH=915);柱温22℃;电压16kV;检测波长200nm;气压进样,进样时间为5s。测得玉米花粉多糖主要由葡萄糖,阿拉伯糖和半乳糖3种单糖组成。该方法操作简单,精度高,可成为测定多糖中单糖组分的方法。周蓉[24],季宇彬[25]等也利用高校毛细管电泳法成功分析了甘草多糖以及龙葵多糖的单糖组分。

综合各类方法,HPLC有分离速度快,分辨率高,分离效率好,重现性好,不破坏样品的优点。但糖类本身没有紫外吸收,只能采用示差折光监测器(R1)或蒸发光散射检测器(ELSD)检测。RI分辨率低,而ELSD效果虽好却价格昂贵。另外,采用HPLC分析

时,色谱柱的选择比较困难。一般采用氨基柱但分离

—6

7

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20081Vol122,No.3　　　　　　　　　　　　　　　　　　论文综述《OverviewofThesises》化工时刊　

效果不够理想,而专用的糖柱又十分昂贵。采用GC

测定糖类时,由于糖本身没有足够的挥发性,所以必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发以及对热稳定的衍生物。此外,由于糖的异构化,在某些衍生物的制备过程中,还会产生衍生物的异构化,使色谱分析时每种糖产生多个峰,这往往影响组分的分离和定量。液相色谱(TLC)是一种微量而快速的分析方法,它兼备了柱层析和纸层析两者的优点而且操作方便,设备简单,容易掌握,便宜,灵活的特点。但样品不能回收,展开剂和显色剂的选择也要求严格。HPCE技术具有样品用量少,时间短,灵敏度高,分离效果明显的特点,在糖类物质的检测方面具有独特的优势。

近年来,离子色谱法测定糖类逐渐被学者们所关注,离子色谱鉴于糖类化合物分子具有电化学活性及

35]

在强碱溶液中呈离子化状态,Roxklin等[26、于1983年首先报道了用阴离子交换色谱柱分离,测器测定糖的新方法()0101～012mol/流动相pHpKa值的方法可明显增加分离的选择性[27～28]。因为阴离子交换分离是在碱性条件下完成的,检测方法必须与此相匹配。用金电极的脉冲安培监测器适合这个条件[29～33]。Cai等[34]用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法直接同时分析了血清中多种糖类,利用梯度洗脱在16min内将葡萄糖、核糖、麦芽糖、异麦芽糖分离开来,再直接用脉冲安培法检测,无需衍生。Tom2maso等[35]也用该法成功分离测定了牛奶中的单糖及多糖组分,效果良好。离子色谱法,操作简单,结果准确,是一种快速、便捷的检测方法。但由于离子色谱对进样样品要求较高,样品前处理步骤要求严格,但在糖类检测方面具有自身突出优势。213　多糖的结构分析

多糖的结构分析在近年来采用了许多先进的仪器设备,分析方法和手段都有了很大的提高。主要有紫外光谱法、红外光谱法和核磁共振分析法,现分别介绍如下:

紫外光谱分析[36]:多糖样品溶于水中放置一夜,在10000r/min下离心20min,上清液加入乙醇沉淀。沉淀用乙醚,丙酮洗涤,真空干燥,进行紫外扫描,在270～280cm处有强吸收峰。—68

—

红外光谱分析:利用红外光谱,主要可以鉴定多糖中是否含有硫酸基(1260～1210cm-1)及硫酸基的取代位置(800～950cm-1)。红外光谱扫描茶叶多糖具有一般多糖类的特征吸收峰(4000～6500cm-1),黄桂宪等[37]从茶叶废渣中提取出来的

灰色多糖TPS-3在3415～3280cm-1和1665～1635cm-1处均有一般多糖物质的特征吸收峰。

核磁共振分析:应用13CNMR可以鉴别多糖中糖苷键位置,确认多糖中是否有甲氧基取代及其取代的位置和硫酸基的取代位置。利用1HNMR进一步确认多糖结构。林晓之等[38]就对海藻多糖的组成及结构利用FT-IR和13CNMR两种光谱手段做了深入的研究,从而确定了各类海藻多糖的结构组成。

在糖的结构分析方法,[39,,,,光散射法,超过滤法[40]等。

利用化学方法分析多糖中单糖的组成的主要是通过水解,使多糖中单糖相互间连接的糖苷键断裂,释放出单糖,再运用色谱手段,对单糖进行定性定量。常用的水解方法有硫酸水解法[41],盐酸水解法[42]和三氟乙酸水解法[43]等。硫酸水解法使用硫酸因具有一定的氧化性,会破坏一部分多糖,使分析结果准确度降低;盐酸水解法虽避免了氧化性,但耗时太长,不实用;三氟乙酸水解法使用的三氟乙酸毒性较大,也具有一定的局限性。邓永智等[14],利用超声辅助水解法,则是一种方便、快速、水解较为彻底的方法。当超声波作用时间为90min,超声波功率为300W,水解液为1mol/L乙酸时,效果最好。

　　近年来,多糖的分析检测的研究逐渐被人们所重视,本文仅是对部分多糖提取和分析方法进行了介绍,对于简单样品的分析可选用较为简便的方法直接分析测定,对于复杂样品,应采用适当方式富集、分离后再进行检测,或采用选择性和灵敏度高的技术。而离子色谱法作为一种高效,便捷的分析检测方法在分析测定多糖方面的研究却相对较少,为了多糖的分析研究的进一步发展,为了寻找一条更高速、快捷、准确的分析方法之路,离子色谱法测定多糖应引起学者们

刘　婷等　多糖的提取和分析方法　　　　　　　　　　　　　　　　　20081Vol122,No.3　化工时刊的广泛重视。

参考文献

[1]　陈昌福1植物多糖[J]1病害防治,2007,(5):50～51[2]　王慧铭,孙炜,项伟岚,潘宏铭1鳖甲多糖对小鼠免疫调

[17]　汪东风,谢晓风,杨敏1粗老茶叶治糖尿病的药理成分

[J]1中草巧,1995,26(5):255～257

[18]　傅博强,谢明勇,聂少平1茶叶中多糖含量的测定[J]1

食品科学,2001,(11):69～73

[19]　赵阳楠,常继东1苯酚硫酸法和间接碘量法测定灵芝

节作用的研究[J]1中国中药杂志,2007,32(12):1245～

1247

[3]　徐文清,高文远,王月英,李美佳1银耳多糖硫酸酯的合

多糖含量比较[J]1食用茵,2007,(3):58～61

[20]　王红英,钱斯日古楞,赵前程,藏姝,等13,5-二硝基水

杨酸比色法测定麦冬多糖含量[J]1沈阳农业大学学报,2005,36(5):628～630

[21]　杨兴斌,赵燕,周四元,刘莉,王海芳,梅其炳1柱前衍

成及抗肿瘤作用的研究[J]1中国药学杂志,2007,42

(8):630～632

[4]　TanFeng,DengJun1Analysisoftheconstituentsandantisenile

functionofAchyranthesbidentatapolysaccharides[J]1ActaB2otanicaSinica,2002,44(7):795～798

[5]　谢少凡,柳欣,蒋明,刘长林,刘剑峰1硫酸乙酰肝素多

生化高效液相色谱法分析当归多糖的单糖组成[J]1分析化学,2005,33(9):1287～1290

[22]　颜军,郭晓强,李晓光,郭晓勇,苟小军1TLC快速分析

多糖的单糖组成[J]1食品科学,2006,27(12):603～607

[23]　耿越,王建波,刘靓雯,张明伟,刘书明1高效毛细管电

糖类似物的抗乳腺癌活性研究进展[J]1中国新药杂志,

2007,16(1):11～16

[6]　张海容1沙棘果皮多糖清楚氧自由基的活性研究[J]1

[J]1中草药,

,36(8):1164]　,,,甘草多糖的分离

植物学通报,2005,22(6):703～707

[7]　袁强,袁弘1[J]1分析化学,1999,27

(:245

[25]　季宇彬,王帅帅,汲晨锋1龙葵多糖含量测定及组分分

影响[J]1)[8]　张元琳,,]1食品科学2007,28(2):

305～308

[9]　吴琼,郑成,宁正祥,刘本国,董华强1碱溶性银耳粗多

析[J]1分析化学,2006,34(11):1665

[26]　RendlemanJA1Ionizationofcarbohydratesinthepresenceof

metalhydroxidesandoxides,carbhydratesinsolution[J]1Ad2vancesinChemistrySeries1WashingtonDC:AmericanChem2icalSociety,1973,117:51

[27]　金利通,刘彤,周满水,方禹之1高压液相色谱磷钼杂

糖的提取及其清除自由基作用的研究[J]1食品科学,

2007,28(6):153～155

[10]　黄森,查学强,罗建平,于龙1Box-Behnken法优化提取

霍山石斛活性多糖的研究[J]1中药材,2007,30(5):591～594

[11]　刘贝贝,李小定,潭正林,吴谋成1菜籽饼粕中多糖的

多酸修饰电极安培检测儿茶酚胺类神经递质的研究

[J]1高等学校化学学报,1993,14(7):914～917

[28]　牟世芬,李宗利1阴离子交换分离。脉冲安培检测分

酸提取工艺优化[J]1农业工程学报,2006,22(11):213～216

[12]　谢红旗,周春山,杜邵龙,周尽花1酶法提取,超滤分离

析糖类化合物的进展[J]1色谱,1995,13(5):320～324

[29]　LouisetteJ,BasaandMichaelW1Analysisofglycoprotein-deriveroligosaccharidesbyhigh-pHanion-exchangechro2matography[J]1JournalofChromatographyA,1990,499:205

香菇多糖新工艺研究[J]1食品科学,2007,28(4):217～

219

[13]　李俊,黄锡山,张艳军,苏小建,何星存1超声波法提取

～202

[30]　CarboPacPA10andCarboPacM

A1product1Manual1Sunny2

vale1CA1American:DionexCoporation,2004,4:15[31]　PeterHermentin,ReinhildWitzel,JohannesFG,vliegenthaxt,

JohannisPKamerling,ManffedNimtzandHaraldSConradt1AstrategyforthemappingofN-glycansbyhigh-pHanion-exchangechromatographywithpulsedamperometricdetec2tion[J]1AnalyticalBiochemistry11992,203:281～289[32]　KoykoKoizumi,YokoKubota,HisakoOzaki,Shigenobu

Keiko,MasakoFukudaandToshikoTanimoto1Analysesofi2somericmono-O-methyl-D-glucoses,D-glucobioses

罗汉果多糖的工艺研究[J]1中药材,2007,30(4):475～

477

[14]　邓永智,李文权,袁东星1海水小球藻中多糖的提取及

其单糖组成的气相色谱-质谱分析[J]1分析化学,

2006,34(12):1697～1701

[15]　赵玉英1蒙成药哈日阿布日-16中多糖的组分和糖含

量研究[J]1光谱学与光谱分析,2005,314～316

[16]　王黎明,夏文水1蒽酮-硫酸法测定茶多糖含量的研

究[J]1食品科学,2005,26(7):185～188

—69—

20081Vol122,No.3　　　　　　　　　　　　　　　　　　论文综述《OverviewofThesises》化工时刊　

andD-glucosemonophosphatesbyhighperformanceanion-exchangechromatographywithpulsedamperometricdetection[J]1JournalofChroltmtographyA,1992,595:340～345

[33]　牟世芬,刘克纳,丁晓静编著1离子色谱方法及应用

[M]1第二版1北京:化学工业出版社,2005;76～82

[34]　YaqiCai,JingshenLiu,YaliShi,LinaLiangandShifen

Mou1Determinationofseveralsugarsinserumbyhigh-per2formanceanion-exchangechromatographywithpulsedam2perometricdetection[J]1JoumalofChromatographyA12005,1085(1):98～103

[35]　TommasoRICataldi,MassimilianoAngelotti,GiulianaBian2

co1Determinationofmono-anddisaccharidesinmilkandmilkproductsbyhigh-performanceanion-exchangechro2matographywithpulsedamperometricdetection[J]1AnalyticaChimicaActa12003,485:43～49

[36]　孙玉军,木通多糖的分离纯化及部分理化性质测定

[J]1安徽技术师范学院学报,2001,15(4):60～61

[37]　黄桂宪,等1广西绿茶多糖分离与分析[J]1中国茶叶,

1995,(5):18～19

[38]　林晓之,唐渝,张渊明,[39]　周林,郭祀远,蔡妙颜,李琳1粘度法测定水溶液中裂

褶多糖相对分子质量[J]1功能高分子学报,2005,18

(4):692～695

[40]　张惟杰著1复合多糖生化研究技术[M]1上海:上海科

学技术出版社,1987,77～120

[41]　JDeanPakulski,RonaldBenner1Animprovedmethodforthe

hydrdysisandMBTHanalysisofdissolvedandparticulatecar2bohydratesinseawater[J]1MarineChemistry,1992,40:143

～160

[42]　SverreMMyklestad,EiinSkanoy,SolveigHestmann1Asensi2

tiveandrapidmethodforanalysisofdissolvedmono-andpolysaecharidesinseawater[J]1MarineChemistry,1997,(56):279～286

[43]　DeRuiterGA,ScholsHA1Carbohydrateanalysisofwater-solubleuronicacid-containingpolysaccharideswithhigh-performance

anion

-using

issuperiortofour[J],1992,207(1):,张丽颖1国内中药多糖的提取分离及分析研

](12117究概况[J]1药物分析杂志,2005,25(10):1285～1288

简

　讯

复旦大学化学系发明合成双氯芬酸类药物新路

由复旦大学化学系陈芬儿教授领衔的课题组发明的一条合成双氯芬酸类药物新路,突破了国内外30年来一直采用的传统生产工艺,极大地改善了严重环境污染现状和工人劳动强度条件,其原料成本大幅下降,在国际竞争中处于领先地位。凭借这一突破性的成果,复旦大学化学系陈芬儿课题组荣获2007年科技进步二等奖。

陈芬儿教授历经十多年发明的合成新工艺,使双氯芬酸钠的原料成本大幅下降,产品质量显著提高,从而迫使瑞士、日本、美国、德国等国相继停产而转向从我国进口。陈芬儿教授该发明技术在国内某制药公司实现工业化生产,产生了重大经济效益,占领了80%的国际市场份额。

芬欧汇川集团利用新技术生产造纸纤维和生化产品

芬欧汇川集团日前与芬兰一家科技公司—Chempolis公司签署技术特许协议,利用一项新技术生产造纸纤维和生物化学产品。通过利用这项新技术,芬欧汇川集团将在中国采用农业生产所产生的剩余物,连同其他非木质原料,例如麦草和芦苇,都能作为原料用于生产纸浆和生物化学产品。

2007年4月,芬欧汇川集团在江苏省常熟市建成的芬欧汇川亚洲研发中心一直负责研究当地纤维原材料,并将就如何利用

农业剩余物生产纸浆开展基础研究。芬欧汇川集团目前正在中国考察建立农业剩余物工业综合利用项目的可能性。这一农业剩余物综合利用项目将成为世界上第一个使用Chempolis公司技术投入工业化规模生产的项目。

(沈镇平)

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