※牛物下程
良晶科学
２０１１，Ｖ０１．３２，Ｎｏ．０９２１３
酿酒活性干酵母生产工艺优化及干燥剂的选择
张建峰，耿宏伟，王丕武卡
（吉林农业大学生命科学学院，吉林长春
１３０１
１８）
摘要：对酿酒活性干酵母（从ＤＹ）生产工艺进行优化及选定生产用保护剂。酿酒酵母体积分数ｌ％～３％的接种量
接于发酵罐，２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ，通气量１０ＮＬ／ｍｉｎ，培养４０ｈ：流化床干燥器进风温度９０＂Ｃ；司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合作为生产用保护剂，ＡＡＤＹ活菌率可高达７７．８９％；海藻糖５％＋司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合作为高端生产用保护剂或者用于保藏莺要菌种，ＡＡＤＹ活菌率可达（８３．５２±１．８７）％。关键词：酿酒活性干酵母；干燥保护剂；生产工艺
ＰｒｏｃｅｓｓＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＡｇｅｎｍｆｏｒＡｌｃｏｈｏｌＡｃｔｉｖｅＤｒｙＹｅａｓｔ
ＺＨＡＮＧＪｉａｎ・ｆｅｎｇ，ＧＥＮＧＨｏｎｇ－ｗｅｉ，ＷＡＮＧＰｉ—ＷＵ＊
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ
１３０１
１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｏｕｇｈ
ａ
ｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｆｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｌｃｏｈｏｌａｃｔｉｖｅｄｒｙｙｅａｓｔ（ＡＡＤＹ）ｗａｓ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｏｒｔｈｅ
ｗａｓｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ
ａｔ
１％－－３％（Ｗ叻ｉｎｔｏａｆｅｒｍｅｎｔｏｒ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
Ｗａｓ
４０ｈ
Ｓｅｔ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ａｔ
２８℃ａｎｄ１０ＮＬ／ｍｉｎａｉｒｆｌｏｗｗｉｔｈｓｈａｋｉｎｇａｔ２００
ａ
ｒ／ｒａｉｎ．硼ｋ
ｉｎｌｅｔ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ
２％
ｆｌｕｉｄｉｚｅｄｂｅｄａｔ
９０℃．ＴｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｕｓｅｄｆｏｒｏｒｄｉｎａｒｙＡＡＤＹｗａｓ
ｔｏ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ
２％Ｓｐａｎ．６０ａｎｄ
Ｔｗｅｅｎ－８０ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｌｉｖｉｎｇＡＡＤＹｃｅｌｌｓｗａｓｕｐ
２％Ｔｗｅｅｎ－８０ｃｏｕｌｄｂｅＡＡＤＹ
７７．８９％．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ５％ｔｒｅｈａｌｏＳｅ，２％Ｓｐａｎ－６０ａｎｄ
ｃｏｍｃｒｖａｔｉｏｎａｎｄｋｅｅｐ（８３．５２±１．８７）％ｏｆ
ｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｐｌＤｔｃｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＡＡＤＹａｎｄｓｔｒａｉｎ
ｃｅｌｌｓａｌｉｖｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｌｃｏｈｏｌａｃｔｉｖｅｄｒｙｙｅａｓｔ（ＡＡＤＹ）；ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔ；ｐｒｏｃｅｓｓ
中图分类号：髑２６１．１文献标识码：Ａ
文章编号：１００２．６６３０（２０１１）０９－０２１３－０４
酿酒酵母菌是一种单细胞微生物，大多属于真菌中的子囊菌纲，主要有酿酒酵母、葡萄汁酵母、卡尔斯伯酵母、裂殖酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母、球拟酵母和酒香酵母Ｉｔ】。酿酒活性干酵母（ａｌｃｏｈ０１．
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｃｔｉｖｅｄｒｙ
母的干燥，目前主要采用流化床的气流干燥法【６－，ｌ。酵母菌细胞对干燥的抗性受到菌种、培养条件、干燥时间、干燥温度、保护剂等因素的影响，保护剂是最关
键的一个因素。而干燥保护剂的筛选是一项极为复杂的
ｙｅａｓｔ，ＡＡＤＹ）是以固体干物质
工作。目前，国内外主要是通过传统的因子试验设计来筛选各菌株的干燥保护剂。本实验运用单因素试验，
对酿酒酵母的保护剂进行筛选。并对效果比较好的干燥
形式存在，而不失去活性的酿酒酵母产品【引。ＡＡＤＹ有
两个基本特征：一是常温下长期贮存而不失去活性，
二是将ＡＡＤＹ在一定条件下复水活化后，即恢复成自然状态并具有正常酵母活性的细胞ｆ３．５】。ＡＡＤＹ具有性能稳定、易于运输、使用方便等优点，被广泛地应用
于酿酒领域【４】。
保护剂进行组合实验，希望能达到较好的保护效果，为
ＡＡＤＹ的生产提供参考。
１
材料与方法菌种
酿酒酵母由广东丹宝利酵母有限公司提供。
酿酒酵母干燥过程中会造成酵母细胞的失活，从而
影响ＡＡＤＹ的发酵性能。因此，选择合适的干燥方法
１．１
是至关重要的。从酵母工业开始至今，吸水干燥、气流干燥、喷雾干燥和真空冷冻干燥等方法先后应用于酵
收稿日期：２０１０．０９．１４
１．２
试剂与仪器
ＶＣ、海藻糖、ＶＥ、吡哆醇、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）
基金项目：吉林省教育厅“十一五”科研规划项目（吉教科２００９・３６３）：吉林农业大学科研启动基金项目（吉农２１５—０００８１）作者简介：张建峰（１９７３—），男，副教授，博士研究生，研究方向为作物生物技术。Ｅ－ｍａｉｈｚｈａｎｇｊｉａｎｆｅｎ９０６＠ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｏｒｇ．ｃｎ
・通信作者：王丕武（１９５８１，男，教授，博士，研究方向为作物遗传育种和生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｅｉｗｕｗ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ万方数据
２１４
２０１１，Ｖ０１．３２，Ｎｏ．０９
食品科学
※生物下程
北京鼎国生物技术有限责任公司；甘油、蔗糖北京
北化精细化学品有限责任公司；Ｌ．谷氨酸钠、甘氨酸上海楷洋生物技术有限公司；甘露醇、乳糖、麦芽糖
沈阳市东兴试剂厂；聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ．Ｐ）
杭州南杭
化工有限公司；Ｄ．山梨醇
青岛万盛化工有限公司；
司班．６０
北京风礼精求商贸有限责任公司；脱脂奶粉
上海生物科技有限公司；叶温．８０
沈阳市新西试荆厂；聚乙二醇（ＰＥＧ６０００）、ＰＥＧ４０００北京益科精细化
学品有限公司：肌醇郑州兴禾化工产品有限公司；
美蓝
北京恒业中远化工有限公司；以上试剂均为国产
化学纯试剂。
ＫＦ．３０Ｌ发酵罐
韩国高百特发酵机（卜海）有限公
司；ｗＢＦ．１流化床重庆英格制药机械有限公司；
ＢＡＳ０．０６／１００板框压滤机
宁波永泉制药设备有限公司；
ＤＬＧ．６０单螺杆挤出造粒机
广州楷诚干燥设备有限公
司；ＳＣ６９．Ｄ２Ｃ水份快速测定仪上海启威电子有限公司。
１．３
吕氏美蓝染色液配制
吕氏美蓝染色液：将０．３９美蓝溶解于３０ｍＬ
９５％乙
醇中，充分搅拌，然后与１００ｍＬ０．１９／ＬＫＯＨ溶液混合，充分搅拌混合液，静止２４ｈ后弃去沉淀备用ｆ８ｌ。
１．４
培养基的配制麦芽汁培养基：每千克大麦芽粉加水４ｋｇ，４５℃水
浴３０ｍｉｎ，升到６３℃水浴３０ｍｉｎ，再升到７０℃水浴约３０ｍｉｎ，以碘液检查不变蓝为准，过滤得麦芽汁。用蒸馏水调整糖度１２０Ｂｘ，以稀碱调ｐＨ５，火菌锅１１５℃、灭菌１５ｍｉｎｔ９－ｌｏｌ。
１．５
菌体的培养、压榨、造粒、干燥
将经过平板纯化的酿酒酵母菌种接于两瓶麦芽汁培
养基中，每瓶培养基３００ｍＬ／Ｌ，接种量ｌ％，于２８℃，
１５０ｒ／ｒａｉｎ摇床培养４０ｈ。然后全部接种到３０Ｌ发酵罐中，
２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ，通气量１０ＮＬ／ｍｉｎ，培养４０ｈ。培养液按一定比例加入十燥保护剂，经板框压滤机压榨，含水量不高于６５％，利用单螺杆挤出造粒机造粒（１ｍｍ×
２ｍｍ）。送入流化床干燥器进行干燥。
１．６
ＡＡＤＹ复水活化
取ＡＡＤＹ０．５９，加入复水活化液０．４９／Ｌ匍萄糖液
１５ｍＬ。放入水浴恒温振荡器中，３８℃、１３０ｒ／ｍｉｎ、水
浴３０ｍｉｎ，即完成活化１１ＩＩ。
１．７
活菌率及含水量的测定
活菌率：参照ＧＢ／Ｔ２２５４７—２００８《饲料添加剂饲
用活性干酵母（酿酒酵母）》中的标准方法测定【９１。含水量：取１．０９酵母样品，采用水分快速测定仪测定。
１．８
发酵培养时间的选择
３０Ｌ发酵罐分批培养时间分别取１０、２０、３０、４０、
５０ｈ，每批次发酵结束测定菌液浓度用ＯＤ枷。。表示；每
批次加入２％（占细胞干物质质量的质量分数）司班一６０混
万方数据
合，在同样条件下进行压榨、造粒、流化干燥，控制
干酵母含水量６％左右，然后测定复水活化后的活菌率。
１．９
干燥温度的选择
３０Ｌ发酵罐培养酵母茵，培养时间取１．８节结果中
最佳时间，培养获得的酵母泥加入２％司班一６０混合，进行压榨、造粒。造粒后均分成几份，分别以进风温度４０、５０、６０，７０、８０、９０、１００℃进行干燥［１２－１３１，
控制干燥时间使千酵母含水量６％左右。然后测定复水
活化后的活蔺率…。
１．１０
干燥保护剂的筛选
根据相关文献［１４．１７】，选定下列药品作为干燥保护
剂：Ｌ．谷氨酸钠、甘露醇、ＰＶＰ．Ｐ、甘氨酸、Ｄ．山梨醇、司班．６０、脱脂奶粉、叶温一８０、ＶＣ、海藻糖、
ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ４０００、麦芽糖、乳糖、甘油、肌醇、ＶＥ、吡哆醇、ＤＭＳＯ、蔗糖。每种干燥保护剂分别设定５个添加量，与发酵后的酵母乳充分混合后压榨、
造粒、干燥，控制干燥时间使干酵母含水量６％左右，
然后测定复水活化后的活菌率。通过实验确定单个干燥
保护剂的最佳添加鼍。然后比较每种干燥保护剂在各自
的最佳添加量下的保护效果。
１．１ｌ
干燥保护剂的优化组合
将Ｉ．１０节中选出的效果比较好的干燥保护剂按一定
比例混合后使用，加入酵母乳后进行压榨、造粒、干燥，控制干燥时间使干酵母含水量６％左右，然后测定
复水活化后的活菌率。采用Ｌ９（３４）正交试验设计见表ｌｔＸＳｌ。
表１正交试验因素水平表
Ｔａｂｌｅ１
Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏａａｌａｒｒａｙ
ｄｅｓｉｇｎ
１．１２
统计分析方法
实验数据表示为ｉ±Ｊ，使用统计分析软件ＳＰＳＳ
１２．０
进行统计学分析。单因素分析采用ＡＮＯＶＡ方法和
Ｄｕｎｃａｎ多重比较，以Ｐ＜０．０１表示差异显著。
２
结果与分析
２．１
发酵培养时间的选择
从图ｌ可看出，０Ｄ一。值随培养时间的变化符合酿
酒酵母的生长规律，３０ｈ后进入稳定期。由ＡＡＤＹ活
荫率随培养时间的变化关系可以看出，在对数生长期的
酵母菌干燥后死亡量比较大，而稳定期的酵母干燥后活
菌率较高。因此考虑生物量和ＡＡＤＹ活菌率两项指标都
※生物下程
—ｉｍｍ—ｌｍ
—ｉｉ
ｉ，—・＿・—————！！！＿，－—＿・＿・—Ｉ——＿—＿—＿Ｉ＿＿＿＿—ｌ—・Ｉ—————・＿＿＿—・・—Ｉ＿・——＿＿————・Ｉ・—＿・———・——－
旦晶科学
２０１１．Ｖ０１．３２，Ｎｏ．０９２１５
是应该选择４０ｈ的培养时间比较恰当。
７０
１１２４
毒１ｌ
雏
：
２０爝
１０隶
Ｏ０
０
１０
２０
３０４０５０
培养时倒ｍ
图Ｉ
ＯＤ・ｍ．值、ＡＡＤＹ活菌率随培养时间的变化情况
№ｌ
ｃｈａｎｇｅｓｉｎＯＥｔｍ．ｖａｌｕｅａｎｄＵｖｉｎｇｃｅｌｌ
ｒａｔｅ
ｏｆＡＡＤＹｄｕｒｉｎｇ
ｃｕｌｔｕｒｅ
２２
干燥温度的选择
８０
逑７０
嚣６０
誊５０
呈４０
３０
４０５０６０
７０８０９０１００
干燥温度／＇Ｃ
图２干燥温度对ＡＡＤＹ活菌率的影响
ｎ口Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｒｙｍｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
Ｏｎ
ｌｉｖｉｎｇｃｅＨｒａｔｅｏｆＡＡＤＹ
从图２可以看出，ＡＡＤＹ活菌率随着流化床干燥器０
０℃的降低非常明显，考虑到干燥需要的时间和
干燥保护剂的筛选
表２干燥保护剂对ＡＡＤＹ活菌率的影响
Ｔａｂｌｅ
２Ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆｄｒｙｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
ａｇｅｎｔｓ
Ｏｉｌ
ｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌ
ｒａｔｅｏｆＡＡＤＹ
十燥ｆ舻利添加景膀ＡＡＤＹ活菌串膀
海海皤
５
８１．３５±１．２４３‘脱脂奶粉
５５７．７２±１．８８３ｃ
吐嚣；Ｉ－８０２６５．３４±０．９４７４ｓ肌醇２
５３．０１±ｎ５８卯
司班－６０
２６４．７０±！．３０７ｓ珏６４０∞
５
５２．８９±Ｏ．７３０００甘蘑蹲
２
６１．１６±０．加２６ｃ
、Ｅ
ｌ４９．９５±１．３６ｌ“只淞６唧
５邡恬７±ｏ．棚３８ｃ甘油２
４９３６±】．６８１５
ｌ
∞．４２±１５，９ｃｐ璧Ｐ５
４９．２６±ｌ脚
麦芽糖５
６０．２３±１．９２０。吡哆醇
乳糖６０．０３±２．６５７ｃ啪
２
４８．８３±１．３８９ＥＳ５４８ｊ２±０．８１５６Ｅ甘氨酸
ｌ５９．４３±１．５８０ｃ、Ｃ
ｌ
４６．４４±１．１７５Ｆ２
５９．３ｌ±１．８Ｓ４ｃ
口潍
５
３７．０９±１．４９０Ｇ
对选定的２０种保护剂分别做单因素试验，每种保
万方数据
甘露醇２％、ＰＶＰ・Ｐ５％、甘氨酸１％、Ｄ．山梨醇２％、司班－６０２％、脱脂奶粉５％、吐温．８０２％、ＶＣ１％、
海藻糖５％、ＰＥＧ６０００５％、ＰＥＧ４０００５％、麦芽糖５％、
乳糖５％、甘油２％、肌醇２％、ＶＥ１％、吡哆醇２％、
ＤＭＳＯ５％、蔗糖５％。选定各种保护剂的最佳添加量进行单因素比较试验，结果见表２。
从表２可以看出，效果较好的保护剂是海藻糖、司
班一６０、吐温一８０，由此３种保护剂进行下一步正交试验找出最好的组合。
２．４
干燥保护剂的优化组合试验结果
表３正交试验结果与分析
Ｔａｂｌｅ３
Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
ａｒｒａｙｌａｙｏｕｔａｎｄ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｒｅｓｕｌｔｓ
由表３可以看出，影响干燥的因素主次顺序为Ｃ＞
ｚ丑：。即海藻糖５％、
２％、吐温一８０２％作为干燥剂的最优组合。
验证实验
从正交试验结果分析得出，ＣｚＡｚＢｚ组合的保护效果
ｚ曰：进行实验，
２％）的组合ＡＡＤＹ活菌率也高达７７％，完
讨论与结论
通过一系列实验研究，可以看出ＯＤ删。。值的变化
进风温度的提高逐渐降低，４０～９０℃的减少比较缓慢，
１ＡＡＤＹ活荫率双重因素，选择９０℃的进风温度。
２．３
Ａ＞曰，干燥剂的最优组合为Ｃ：Ａ司班－６０２＿５
干燥保护剂添加凯ＡＡＤＹ活菌撕
最好，而９组试验中Ｃ２Ａ，Ｂ，组合所得ＡＡＤＹ活菌率为
最高值，与最优组合Ｃ２Ａ：Ｂ：比较，同时考虑到海藻糖成本较高，加入一组去掉海藻糖的组合Ａ每组重复３次。结果表明：ＣｚＡ：Ｂｚ的ＡＡＤＹ活菌率为
Ｌ奄氨酸钠肛山梨醇
（８３５２±１．聊％；Ｃ诅瘕的ＡＡＤＹ活蔺率为（８２．７５±２．Ｃｒ７）％：
Ａ２８２的ＡＡＤＹ活茵率为（７７．８９±２．２６）％。可见，正交
试验设计得出的最优组合效果最好。另外Ａ：Ｂ：（司班．６０
２％＋吐温一８０全可以满足生产需要，而且实验过程中发现这样组合可以解决司班．６０难溶于水的问题。
３
注：袁中数据后标注不同人写字母表示差异显著（Ｐ＜Ｏ．０Ｄ。
护剂选定５个添加量做干燥实验，确定每种保护剂的最佳用量。具体数据省略，结果如下：Ｌ．谷氨酸钠ｌ％、
符合酿酒酵母的生长规律。ＡＡＤＹ的活菌率在对数生长
期（１０－～３０ｈ）偏低，而在稳定期（４０ｈ左右）较高，分析是对数生长期细胞处于大量繁殖阶段，细胞壁膜比较薄，细胞内物质累计不足，抵抗外界条件变化能力差。另
外，海藻糖对ＡＡＤＹ的保护效果极为突出，同时海藻
糖的协同保护效果也很好，这与赵志华等…ｌ的研究结论相吻合。考虑到海藻糖目前的生产成本还很高，结果
表明，司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合效果较好。由
此得到优化的酿酒活性干酵母（ＡＡＤＹ）生产条件：酿酒
酵母１％～３％接种于发酵罐，２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ，通气
量１０ＮＬ／ｒａｉｎ，培养４０ｈ：流化床干燥器进风温度９０℃；司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合作为生产用保护剂，
ＡＡＤＹ活菌率可高达７７．８９％；海藻糖５％＋司班一６０２％＋吐温．８０２％的组合作为高端生产用保护剂或者用于保藏重要菌种，ＡＡＤＹ活菌率可达（８３．５２±１．Ｓ７）％。参考文献：
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张建峰，耿宏伟，王丕武卡
（吉林农业大学生命科学学院，吉林长春
１３０１
１８）
摘要：对酿酒活性干酵母（从ＤＹ）生产工艺进行优化及选定生产用保护剂。酿酒酵母体积分数ｌ％～３％的接种量
接于发酵罐，２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ，通气量１０ＮＬ／ｍｉｎ，培养４０ｈ：流化床干燥器进风温度９０＂Ｃ；司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合作为生产用保护剂，ＡＡＤＹ活菌率可高达７７．８９％；海藻糖５％＋司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合作为高端生产用保护剂或者用于保藏莺要菌种，ＡＡＤＹ活菌率可达（８３．５２±１．８７）％。关键词：酿酒活性干酵母；干燥保护剂；生产工艺
ＰｒｏｃｅｓｓＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＡｇｅｎｍｆｏｒＡｌｃｏｈｏｌＡｃｔｉｖｅＤｒｙＹｅａｓｔ
ＺＨＡＮＧＪｉａｎ・ｆｅｎｇ，ＧＥＮＧＨｏｎｇ－ｗｅｉ，ＷＡＮＧＰｉ—ＷＵ＊
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ
１３０１
１８，Ｃｈｉｎａ）
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ａ
ｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｆｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｌｃｏｈｏｌａｃｔｉｖｅｄｒｙｙｅａｓｔ（ＡＡＤＹ）ｗａｓ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｏｒｔｈｅ
ｗａｓｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ
ａｔ
１％－－３％（Ｗ叻ｉｎｔｏａｆｅｒｍｅｎｔｏｒ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
Ｗａｓ
４０ｈ
Ｓｅｔ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ａｔ
２８℃ａｎｄ１０ＮＬ／ｍｉｎａｉｒｆｌｏｗｗｉｔｈｓｈａｋｉｎｇａｔ２００
ａ
ｒ／ｒａｉｎ．硼ｋ
ｉｎｌｅｔ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ
２％
ｆｌｕｉｄｉｚｅｄｂｅｄａｔ
９０℃．ＴｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｕｓｅｄｆｏｒｏｒｄｉｎａｒｙＡＡＤＹｗａｓ
ｔｏ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ
２％Ｓｐａｎ．６０ａｎｄ
Ｔｗｅｅｎ－８０ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｌｉｖｉｎｇＡＡＤＹｃｅｌｌｓｗａｓｕｐ
２％Ｔｗｅｅｎ－８０ｃｏｕｌｄｂｅＡＡＤＹ
７７．８９％．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ５％ｔｒｅｈａｌｏＳｅ，２％Ｓｐａｎ－６０ａｎｄ
ｃｏｍｃｒｖａｔｉｏｎａｎｄｋｅｅｐ（８３．５２±１．８７）％ｏｆ
ｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｐｌＤｔｃｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＡＡＤＹａｎｄｓｔｒａｉｎ
ｃｅｌｌｓａｌｉｖｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｌｃｏｈｏｌａｃｔｉｖｅｄｒｙｙｅａｓｔ（ＡＡＤＹ）；ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔ；ｐｒｏｃｅｓｓ
中图分类号：髑２６１．１文献标识码：Ａ
文章编号：１００２．６６３０（２０１１）０９－０２１３－０４
酿酒酵母菌是一种单细胞微生物，大多属于真菌中的子囊菌纲，主要有酿酒酵母、葡萄汁酵母、卡尔斯伯酵母、裂殖酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母、球拟酵母和酒香酵母Ｉｔ】。酿酒活性干酵母（ａｌｃｏｈ０１．
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｃｔｉｖｅｄｒｙ
母的干燥，目前主要采用流化床的气流干燥法【６－，ｌ。酵母菌细胞对干燥的抗性受到菌种、培养条件、干燥时间、干燥温度、保护剂等因素的影响，保护剂是最关
键的一个因素。而干燥保护剂的筛选是一项极为复杂的
ｙｅａｓｔ，ＡＡＤＹ）是以固体干物质
工作。目前，国内外主要是通过传统的因子试验设计来筛选各菌株的干燥保护剂。本实验运用单因素试验，
对酿酒酵母的保护剂进行筛选。并对效果比较好的干燥
形式存在，而不失去活性的酿酒酵母产品【引。ＡＡＤＹ有
两个基本特征：一是常温下长期贮存而不失去活性，
二是将ＡＡＤＹ在一定条件下复水活化后，即恢复成自然状态并具有正常酵母活性的细胞ｆ３．５】。ＡＡＤＹ具有性能稳定、易于运输、使用方便等优点，被广泛地应用
于酿酒领域【４】。
保护剂进行组合实验，希望能达到较好的保护效果，为
ＡＡＤＹ的生产提供参考。
１
材料与方法菌种
酿酒酵母由广东丹宝利酵母有限公司提供。
酿酒酵母干燥过程中会造成酵母细胞的失活，从而
影响ＡＡＤＹ的发酵性能。因此，选择合适的干燥方法
１．１
是至关重要的。从酵母工业开始至今，吸水干燥、气流干燥、喷雾干燥和真空冷冻干燥等方法先后应用于酵
收稿日期：２０１０．０９．１４
１．２
试剂与仪器
ＶＣ、海藻糖、ＶＥ、吡哆醇、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）
基金项目：吉林省教育厅“十一五”科研规划项目（吉教科２００９・３６３）：吉林农业大学科研启动基金项目（吉农２１５—０００８１）作者简介：张建峰（１９７３—），男，副教授，博士研究生，研究方向为作物生物技术。Ｅ－ｍａｉｈｚｈａｎｇｊｉａｎｆｅｎ９０６＠ｔｓｉｎｇｈｕａ．ｏｒｇ．ｃｎ
・通信作者：王丕武（１９５８１，男，教授，博士，研究方向为作物遗传育种和生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｅｉｗｕｗ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ万方数据
２１４
２０１１，Ｖ０１．３２，Ｎｏ．０９
食品科学
※生物下程
北京鼎国生物技术有限责任公司；甘油、蔗糖北京
北化精细化学品有限责任公司；Ｌ．谷氨酸钠、甘氨酸上海楷洋生物技术有限公司；甘露醇、乳糖、麦芽糖
沈阳市东兴试剂厂；聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ．Ｐ）
杭州南杭
化工有限公司；Ｄ．山梨醇
青岛万盛化工有限公司；
司班．６０
北京风礼精求商贸有限责任公司；脱脂奶粉
上海生物科技有限公司；叶温．８０
沈阳市新西试荆厂；聚乙二醇（ＰＥＧ６０００）、ＰＥＧ４０００北京益科精细化
学品有限公司：肌醇郑州兴禾化工产品有限公司；
美蓝
北京恒业中远化工有限公司；以上试剂均为国产
化学纯试剂。
ＫＦ．３０Ｌ发酵罐
韩国高百特发酵机（卜海）有限公
司；ｗＢＦ．１流化床重庆英格制药机械有限公司；
ＢＡＳ０．０６／１００板框压滤机
宁波永泉制药设备有限公司；
ＤＬＧ．６０单螺杆挤出造粒机
广州楷诚干燥设备有限公
司；ＳＣ６９．Ｄ２Ｃ水份快速测定仪上海启威电子有限公司。
１．３
吕氏美蓝染色液配制
吕氏美蓝染色液：将０．３９美蓝溶解于３０ｍＬ
９５％乙
醇中，充分搅拌，然后与１００ｍＬ０．１９／ＬＫＯＨ溶液混合，充分搅拌混合液，静止２４ｈ后弃去沉淀备用ｆ８ｌ。
１．４
培养基的配制麦芽汁培养基：每千克大麦芽粉加水４ｋｇ，４５℃水
浴３０ｍｉｎ，升到６３℃水浴３０ｍｉｎ，再升到７０℃水浴约３０ｍｉｎ，以碘液检查不变蓝为准，过滤得麦芽汁。用蒸馏水调整糖度１２０Ｂｘ，以稀碱调ｐＨ５，火菌锅１１５℃、灭菌１５ｍｉｎｔ９－ｌｏｌ。
１．５
菌体的培养、压榨、造粒、干燥
将经过平板纯化的酿酒酵母菌种接于两瓶麦芽汁培
养基中，每瓶培养基３００ｍＬ／Ｌ，接种量ｌ％，于２８℃，
１５０ｒ／ｒａｉｎ摇床培养４０ｈ。然后全部接种到３０Ｌ发酵罐中，
２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ，通气量１０ＮＬ／ｍｉｎ，培养４０ｈ。培养液按一定比例加入十燥保护剂，经板框压滤机压榨，含水量不高于６５％，利用单螺杆挤出造粒机造粒（１ｍｍ×
２ｍｍ）。送入流化床干燥器进行干燥。
１．６
ＡＡＤＹ复水活化
取ＡＡＤＹ０．５９，加入复水活化液０．４９／Ｌ匍萄糖液
１５ｍＬ。放入水浴恒温振荡器中，３８℃、１３０ｒ／ｍｉｎ、水
浴３０ｍｉｎ，即完成活化１１ＩＩ。
１．７
活菌率及含水量的测定
活菌率：参照ＧＢ／Ｔ２２５４７—２００８《饲料添加剂饲
用活性干酵母（酿酒酵母）》中的标准方法测定【９１。含水量：取１．０９酵母样品，采用水分快速测定仪测定。
１．８
发酵培养时间的选择
３０Ｌ发酵罐分批培养时间分别取１０、２０、３０、４０、
５０ｈ，每批次发酵结束测定菌液浓度用ＯＤ枷。。表示；每
批次加入２％（占细胞干物质质量的质量分数）司班一６０混
万方数据
合，在同样条件下进行压榨、造粒、流化干燥，控制
干酵母含水量６％左右，然后测定复水活化后的活菌率。
１．９
干燥温度的选择
３０Ｌ发酵罐培养酵母茵，培养时间取１．８节结果中
最佳时间，培养获得的酵母泥加入２％司班一６０混合，进行压榨、造粒。造粒后均分成几份，分别以进风温度４０、５０、６０，７０、８０、９０、１００℃进行干燥［１２－１３１，
控制干燥时间使千酵母含水量６％左右。然后测定复水
活化后的活蔺率…。
１．１０
干燥保护剂的筛选
根据相关文献［１４．１７】，选定下列药品作为干燥保护
剂：Ｌ．谷氨酸钠、甘露醇、ＰＶＰ．Ｐ、甘氨酸、Ｄ．山梨醇、司班．６０、脱脂奶粉、叶温一８０、ＶＣ、海藻糖、
ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ４０００、麦芽糖、乳糖、甘油、肌醇、ＶＥ、吡哆醇、ＤＭＳＯ、蔗糖。每种干燥保护剂分别设定５个添加量，与发酵后的酵母乳充分混合后压榨、
造粒、干燥，控制干燥时间使干酵母含水量６％左右，
然后测定复水活化后的活菌率。通过实验确定单个干燥
保护剂的最佳添加鼍。然后比较每种干燥保护剂在各自
的最佳添加量下的保护效果。
１．１ｌ
干燥保护剂的优化组合
将Ｉ．１０节中选出的效果比较好的干燥保护剂按一定
比例混合后使用，加入酵母乳后进行压榨、造粒、干燥，控制干燥时间使干酵母含水量６％左右，然后测定
复水活化后的活菌率。采用Ｌ９（３４）正交试验设计见表ｌｔＸＳｌ。
表１正交试验因素水平表
Ｔａｂｌｅ１
Ｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏａａｌａｒｒａｙ
ｄｅｓｉｇｎ
１．１２
统计分析方法
实验数据表示为ｉ±Ｊ，使用统计分析软件ＳＰＳＳ
１２．０
进行统计学分析。单因素分析采用ＡＮＯＶＡ方法和
Ｄｕｎｃａｎ多重比较，以Ｐ＜０．０１表示差异显著。
２
结果与分析
２．１
发酵培养时间的选择
从图ｌ可看出，０Ｄ一。值随培养时间的变化符合酿
酒酵母的生长规律，３０ｈ后进入稳定期。由ＡＡＤＹ活
荫率随培养时间的变化关系可以看出，在对数生长期的
酵母菌干燥后死亡量比较大，而稳定期的酵母干燥后活
菌率较高。因此考虑生物量和ＡＡＤＹ活菌率两项指标都
※生物下程
—ｉｍｍ—ｌｍ
—ｉｉ
ｉ，—・＿・—————！！！＿，－—＿・＿・—Ｉ——＿—＿—＿Ｉ＿＿＿＿—ｌ—・Ｉ—————・＿＿＿—・・—Ｉ＿・——＿＿————・Ｉ・—＿・———・——－
旦晶科学
２０１１．Ｖ０１．３２，Ｎｏ．０９２１５
是应该选择４０ｈ的培养时间比较恰当。
７０
１１２４
毒１ｌ
雏
：
２０爝
１０隶
Ｏ０
０
１０
２０
３０４０５０
培养时倒ｍ
图Ｉ
ＯＤ・ｍ．值、ＡＡＤＹ活菌率随培养时间的变化情况
№ｌ
ｃｈａｎｇｅｓｉｎＯＥｔｍ．ｖａｌｕｅａｎｄＵｖｉｎｇｃｅｌｌ
ｒａｔｅ
ｏｆＡＡＤＹｄｕｒｉｎｇ
ｃｕｌｔｕｒｅ
２２
干燥温度的选择
８０
逑７０
嚣６０
誊５０
呈４０
３０
４０５０６０
７０８０９０１００
干燥温度／＇Ｃ
图２干燥温度对ＡＡＤＹ活菌率的影响
ｎ口Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｒｙｍｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
Ｏｎ
ｌｉｖｉｎｇｃｅＨｒａｔｅｏｆＡＡＤＹ
从图２可以看出，ＡＡＤＹ活菌率随着流化床干燥器０
０℃的降低非常明显，考虑到干燥需要的时间和
干燥保护剂的筛选
表２干燥保护剂对ＡＡＤＹ活菌率的影响
Ｔａｂｌｅ
２Ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆｄｒｙｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
ａｇｅｎｔｓ
Ｏｉｌ
ｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌ
ｒａｔｅｏｆＡＡＤＹ
十燥ｆ舻利添加景膀ＡＡＤＹ活菌串膀
海海皤
５
８１．３５±１．２４３‘脱脂奶粉
５５７．７２±１．８８３ｃ
吐嚣；Ｉ－８０２６５．３４±０．９４７４ｓ肌醇２
５３．０１±ｎ５８卯
司班－６０
２６４．７０±！．３０７ｓ珏６４０∞
５
５２．８９±Ｏ．７３０００甘蘑蹲
２
６１．１６±０．加２６ｃ
、Ｅ
ｌ４９．９５±１．３６ｌ“只淞６唧
５邡恬７±ｏ．棚３８ｃ甘油２
４９３６±】．６８１５
ｌ
∞．４２±１５，９ｃｐ璧Ｐ５
４９．２６±ｌ脚
麦芽糖５
６０．２３±１．９２０。吡哆醇
乳糖６０．０３±２．６５７ｃ啪
２
４８．８３±１．３８９ＥＳ５４８ｊ２±０．８１５６Ｅ甘氨酸
ｌ５９．４３±１．５８０ｃ、Ｃ
ｌ
４６．４４±１．１７５Ｆ２
５９．３ｌ±１．８Ｓ４ｃ
口潍
５
３７．０９±１．４９０Ｇ
对选定的２０种保护剂分别做单因素试验，每种保
万方数据
甘露醇２％、ＰＶＰ・Ｐ５％、甘氨酸１％、Ｄ．山梨醇２％、司班－６０２％、脱脂奶粉５％、吐温．８０２％、ＶＣ１％、
海藻糖５％、ＰＥＧ６０００５％、ＰＥＧ４０００５％、麦芽糖５％、
乳糖５％、甘油２％、肌醇２％、ＶＥ１％、吡哆醇２％、
ＤＭＳＯ５％、蔗糖５％。选定各种保护剂的最佳添加量进行单因素比较试验，结果见表２。
从表２可以看出，效果较好的保护剂是海藻糖、司
班一６０、吐温一８０，由此３种保护剂进行下一步正交试验找出最好的组合。
２．４
干燥保护剂的优化组合试验结果
表３正交试验结果与分析
Ｔａｂｌｅ３
Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
ａｒｒａｙｌａｙｏｕｔａｎｄ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｒｅｓｕｌｔｓ
由表３可以看出，影响干燥的因素主次顺序为Ｃ＞
ｚ丑：。即海藻糖５％、
２％、吐温一８０２％作为干燥剂的最优组合。
验证实验
从正交试验结果分析得出，ＣｚＡｚＢｚ组合的保护效果
ｚ曰：进行实验，
２％）的组合ＡＡＤＹ活菌率也高达７７％，完
讨论与结论
通过一系列实验研究，可以看出ＯＤ删。。值的变化
进风温度的提高逐渐降低，４０～９０℃的减少比较缓慢，
１ＡＡＤＹ活荫率双重因素，选择９０℃的进风温度。
２．３
Ａ＞曰，干燥剂的最优组合为Ｃ：Ａ司班－６０２＿５
干燥保护剂添加凯ＡＡＤＹ活菌撕
最好，而９组试验中Ｃ２Ａ，Ｂ，组合所得ＡＡＤＹ活菌率为
最高值，与最优组合Ｃ２Ａ：Ｂ：比较，同时考虑到海藻糖成本较高，加入一组去掉海藻糖的组合Ａ每组重复３次。结果表明：ＣｚＡ：Ｂｚ的ＡＡＤＹ活菌率为
Ｌ奄氨酸钠肛山梨醇
（８３５２±１．聊％；Ｃ诅瘕的ＡＡＤＹ活蔺率为（８２．７５±２．Ｃｒ７）％：
Ａ２８２的ＡＡＤＹ活茵率为（７７．８９±２．２６）％。可见，正交
试验设计得出的最优组合效果最好。另外Ａ：Ｂ：（司班．６０
２％＋吐温一８０全可以满足生产需要，而且实验过程中发现这样组合可以解决司班．６０难溶于水的问题。
３
注：袁中数据后标注不同人写字母表示差异显著（Ｐ＜Ｏ．０Ｄ。
护剂选定５个添加量做干燥实验，确定每种保护剂的最佳用量。具体数据省略，结果如下：Ｌ．谷氨酸钠ｌ％、
符合酿酒酵母的生长规律。ＡＡＤＹ的活菌率在对数生长
期（１０－～３０ｈ）偏低，而在稳定期（４０ｈ左右）较高，分析是对数生长期细胞处于大量繁殖阶段，细胞壁膜比较薄，细胞内物质累计不足，抵抗外界条件变化能力差。另
外，海藻糖对ＡＡＤＹ的保护效果极为突出，同时海藻
糖的协同保护效果也很好，这与赵志华等…ｌ的研究结论相吻合。考虑到海藻糖目前的生产成本还很高，结果
表明，司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合效果较好。由
此得到优化的酿酒活性干酵母（ＡＡＤＹ）生产条件：酿酒
酵母１％～３％接种于发酵罐，２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ，通气
量１０ＮＬ／ｒａｉｎ，培养４０ｈ：流化床干燥器进风温度９０℃；司班．６０２％＋吐温．８０２％的组合作为生产用保护剂，
ＡＡＤＹ活菌率可高达７７．８９％；海藻糖５％＋司班一６０２％＋吐温．８０２％的组合作为高端生产用保护剂或者用于保藏重要菌种，ＡＡＤＹ活菌率可达（８３．５２±１．Ｓ７）％。参考文献：
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ｙｅａｓｔ：ｍｏｉｓｔｕｒｅｌｅｖｅｌｓ．ｄｒｙｉｎｇｒａｔｅｓ。ａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｃｈａｎｇｅｓｄｕｄｎｇ血ｙｉＤｇ
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