第28卷 第3期2016年3月生命科学
Chinese Bulletin of Life SciencesV ol. 28, No. 3Mar., 2016
DOI: 10.13376/j.cbls/2016038
文章编号：1004-0374(2016)03-0295-08
刘秀梵，教授，博士生导师，动物传染病学专家。2005年当选为中国工程院院士，2015年入选世界兽医家禽协会荣誉堂。他主要从事畜禽传染病流行病学与发病机理研究。在禽流感、新城疫等重要动物传染病的流行病学与致病机理方面开展了系统的研究工作，先后研制出用于禽流感(H9N2亚型) 、鸡传染性法氏囊病和新城疫等疫病预防的7种新型疫苗，取得了新兽药注册证书，并在全国范围内得到了推广应用，产生了显著的经济与社会效益。先后获国家科技进步奖二等奖1项、部省级科技进步奖一等奖3项；曾获中国农业英才奖和何梁和利科技创新奖。他主编了《兽医流行病学》和《单克隆抗体在农业上的应用》，在国内外学术刊物发表论文400多篇，培养博、硕士研究生160多名，指导1篇博士论文被评为全国百篇优秀博士学位论文
。
新城疫病毒的遗传进化
胡顺林，刘秀梵*
(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州 225009)
摘 要：新城疫病毒属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属(Avulavirus ) ，病毒的基因组为单股、负链、不分节段
的RNA ，因此，病毒基因组自身变异的频率较高，是新城疫病毒进化的主要因素。同时，新城疫病毒的多宿主特性和疫苗的频繁使用等因素对病毒的进化也起到了促进作用。病毒在进化过程中出现了多个基因型和基因亚型，并导致了病毒宿主感染范围的扩大、毒力的多样性和抗原性的变异。关键词：新城疫病毒；基因组；进化；基因型
S852.65 文献标志码：A 中图分类号：Q939.47；
The heredity and evolution of Newcastle disease virus
HU Shun-Lin, LIU Xiu-Fan*
(Key Laboratory of Animal Infectious Disease, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract: Newcastle disease virus (NDV) is a member of the genus Avulavirus in the family Paramyxoviridae. The genome of NDV is a non-segmented, single-stranded, negative-sense RNA. Therefore, the frequency of genomic variation is relatively high due to the inherent error rate of the RNA polymerase-dependent RNA replication, which is the main driving force for virus evolution. Additionally, the multiple host range for NDV and frequent vaccination for the control of ND also promote the NDV evolution. During the evolution, NDV has generated variants of multi-genotypes and subgenotypes, resulting in expanded host range, virulence diversity and antigenic variations. Key words: Newcastle disease virus; genome; evolution; genotype
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) 是一个持续进化的病毒，虽然只有一个血清型，但有多个基因型，而不同基因型毒株的生物学特性之间
存在较明显的差异。自1926年以来，新城疫在世
收稿日期：2016-01-03
基金项目：公益性行业(农业) 科研专项(201303033)；国家科技支撑计划(2015BAD12B03)*通信作者：E-mail: xfl[email protected]
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界范围内已发生四次大流行，对家禽养殖业造成了极大的经济损失，每次流行都由新的基因型或基因亚型的毒株所引发。NDV 属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属，是一种有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA 病毒。NDV 的复制依靠RNA 依赖性的RNA 聚合酶，在复制过程中该聚合酶缺乏校对功能，因此，病毒基因组的突变率相对较高，在复制中会产生大量的准种。在自然选择条件下，部分准种的生存优势逐步显现，并得以在自然界中传播，一定程度上促进了病毒的进化，同时，宿主、环境、免疫压力等因素的作用也会对病毒的进化产生影响。
生突变，特别是F 和HN 基因编码的蛋白位于病毒粒子的表面，面临的免疫选择压力相对较大。山东农业大学巩艳艳等[4]通过抗体与病毒同时孵育的方
法，在细胞上研究了新城疫抗体对NDV HN基因和F 基因变异的影响。其研究结果发现，有抗体组HN 基因发生突变的位点数明显多于无抗体组，且非同义突变(NS ) 与同义突变(S ) 比值NS/S为6，明显高于无抗体组的NS/S比值3.4；在有抗体组，有5个核苷酸位点发生稳定的非同义突变，而且其中3个与已知的抗原表位密切相关。F 基因在有抗体组也出现了2个稳定的突变，而在无抗体组未发
[5]
生变化。扬州大学Gu 等通过序列分析后发现，HN 蛋白上存在3个阳性选择位点(266、347 和 540位) ，且这3个位点在疫苗株与流行株上存在明显
1 病毒进化动力学
1.1 新城疫病毒的基因突变
NDV 属于单股负链RNA 病毒，具有RNA 病毒共有的特征，其RNA 聚合酶缺乏有效的RNA 校正功能，病毒自我纠错能力有限，加上病毒本身具有较高的复制效率，使得病毒基因自身的变异率相对于DNA 病毒来讲要高得多。1.1.1 自然状态下的NDV 变异
点突变是NDV 变异的主要方式，其根本原因是RNA 聚合酶缺乏校正能力，NDV 的基因组结构模式为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP ) 、磷蛋白(P ) 、基质蛋白(M ) 、融合蛋白(F ) 、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN ) 和聚合酶蛋白(L ) [1]。Chong 等[2]对世界上不同时期、不同地域、不同宿主来源的54个NDV 代表株全基因组中的各基因片段，分别进行了生物信息学统计分析，发现NDV 病毒各基因均存在核苷酸的突变，且不同基因之间的突变率有一定差异，其中P 基因变异的频率最大，其次是F 和HN 基因。美国农业
[3]
部东南禽病研究所Miller 等利用生物信息学方法，结合大量的NDV 基因组序列，对影响NDV 基因
差异。
1.2 NDV 的重组
NDV 基因组为单股负链不分节段的RNA ，一般认为发生基因重组的概率较低。2003年，Chare 等[6]最早报道了NDV 重组的现象。他们在进行负链RNA 遗传进化的研究中，对来源于35个负链RNA 病毒中79个不同基因片段的2 154条序列进行了分析，发现至少有5种病毒有重组现象，其中就包括NDV 。最早发现的两株重组NDV ，一株来自中国的鹅源新城疫强毒GPMV/QY97-1 (简写QY97-1) ，是最早在国内分离的基因VII 型NDV 之一；另一株则是来自墨西哥的chicken/Mexico/ 37822/96。序列分析表明，QY97-1 株HN 蛋白5′端1~273个氨基酸序列与我国目前广泛流行的VII 型NDV 代表株ZJ/1/00/Go同源性达97.7%，而274~570氨基酸序列则与我国的经典强毒株F 48E 9的同源性达99.7%，因此，认为QY97-1株的HN 基因是F 48E 9和基因VII 型NDV 的 HN基因发生重组的产物。而Mexico 毒株的重组则发生在NP 基因，是chicken/Mexico/37822/96和chicken/Italy/Milano/45的重组，这两个亲代毒株分别来自欧洲和美洲且时间跨度超过了50年。2010年，Chong [2]
等通过对GenBank 中NDV 基因组序列的分析发现，来自中国的基因VII 型鹅源毒株NA-1 (其L 基因有基因VI 型片段的重组) 、来自印尼的基因VII 型Cockatoo 源毒株(NP 基因有基因II 型片段重组) 、来自意大利的鸽源基因VIb 亚型毒株(M 基因有基因II 型片段重组) 和来自中国的HB92株(M 和L 基因源于V4，其他基因源于LaSota ) 均发生了重组。
组变异的进化因素进行了分析和评估，发现在NDV 基因组编码的6个蛋白中，以F 蛋白的变异频率最高。除少数蛋白上的位点处于阳性选择外，总体来说，病毒的6个主要结构蛋白均处于较强的阴性选择状态。同时，Miller 等[3]的研究还发现在来源于野鸟的毒株中，强毒株基因组的年变异率要高于弱毒株，由此推测病毒毒力的增强可以加速NDV 毒株的进化。
1.1.2 免疫选择压造成的影响
疫苗免疫是预防新城疫的重要途径和方法。在长期的疫苗免疫选择压下，病毒的基因组往往会发
第3期胡顺林，等：新城疫病毒的遗传进化297
近年来，关于NDV 重组的报道不断增多，而
2008—2011年期间，且大多数重组病毒发生在中国。
国内至少有5个实验室在国际上报道了NDV 的重组事件
，这引起研究者的广泛关注。
从上述有关NDV 重组的报道来看，似乎NDV
[7-12]
为V 型和VI 型，病原来源于鹦鹉类禽种；第三次新城疫大流行源头在中东的鸽，时间为1980—1990年，基因型为VIb 亚型；自20世纪90年代以来，新城疫一直处于第四次大流行，源头在亚洲远东地
[15]
区，基因型主要是VII 型。除基因型发生变化外，NDV 进化还表现在感染宿主范围的扩大、病毒毒力和抗原性改变等方面。2.1 NDV 基因组的演化
目前，一般将NDV 分为两个大的谱系I 类(class I ) 和II 类(class II) 。I 类毒株基因组全长均为15 198 nt；而II 类病毒的基因组长度有15 186 nt和15 192 nt两种，基因组长度的差异是NDV 进化过程中出现的重要历史特征[16]。按传统的NDV 分类，class II中的NDV 主要有基因I~IX 9个基因型，包括了1960年之前出现的基因I~IV型病毒，即早期
1960年之后出现病毒，其基因组全长为15 186 nt；
的基因V~VIII型病毒，即晚期病毒，其基因组全
长为15 192 nt；而基因IX 型病毒在出现时间上和遗传发生上属早期病毒，但其具有晚期病毒的基因组全长，即15 192 nt。IX 型NDV 毒株与基因V~VIII型毒株一样，NP 基因5′ NCR也存在6 nt的插入，因此，其基因组长度为15 192 nt。IX 型NDV 中的 F48分离于1946年，是目前最早分离到的15 192 nt基因组长度毒株，暗示15 192 nt基因组长度的毒株早在20世纪40年代就已经出现，基因组长度的改变是一个早期事件[17]。
由此，可以推测基因IX 型是介于早期毒株和晚期毒株之间的过渡毒株。晚期基因型毒株可能由此类过渡性病毒进化而来，15 192 nt基因组的出现归于早期毒株在NP 基因5′ NCR插入了6 nt
[18]
基因重组不是稀有事件，而是普遍发生的事件，概率比较高的事件。但是，这些作者都忽视了这样的事实：他们判定发生重组的依据是这些毒株的RNA 经RT-PCR 方法扩增所测得的基因序列，而如果样品中混有两种NDV 毒株，则PCR 扩增时聚合酶模板变换，就可导致人为重组；同时，实验室内也可能产生重组体。美国农业部东南家禽研究所资深
[13]
研究员Afonso ，于2008年在中国学者连续报道3篇NDV 重组的文章后，就写信给Journal of Virology指出了这一点。同时，他还强调，还没有一个报告能确定NDV 的重组事件产生了自然子代病毒。为了进一步搞清楚所报道的NDV 重组事件是否都是真正自然发生的重组事件，还是混有实验室发生的
[14]
人工重组，Song 等进行了一系列研究。他们用5种不同的统计学方法分析了GenBank 中80株
NDV 的全基因组序列，发现至少有8株病毒有重组事件，重组率高达10%，而且其中的5株病毒有多个重组事件发生在基因I 、II 、III 型疫苗毒株和当前呈优势流行的基因VII 型毒株之间。但对根据GenBank 中公布的序列被确定为重组的两株病毒，China/Guangxi09/2003和NDV/03/018，进行蚀斑纯化后重新测序，发现原先的重组根本不存在，证明其是PCR 扩增过程中模板改变而引起的人工重组，因为原先的China/Guangxi09/2003和NDV/03/018样品中经验证的确混有基因III 型病毒[14]。Song 等的研究说明，在GenBank 上登录的NDV 基因序列有一些是不准确的，这会影响对NDV 进化的生物信息学分析。所以，对NDV 重组事件的判定应持慎重态度，为避免出错，第一要检查测序的原始样品是否混有不同基因型的病毒；第二是将重组病毒传代、纯化后测序，证明其后代也是重组病毒。
。I
类毒株的基因组的特点也可以作为间接的证据证明
15 192 nt长度的基因组由15 186 nt长度的进化而来，I 类毒株被认为是NDV 的原始病毒，其 NP基因和II 类的基因I~IV型NDV 一样，不存在6 nt的插入。
I 类NDV 基因组的长度为15 198 nt，与II 类毒 I类病毒的P 基因阅读框内多出了12个nt [16]。株相比，
由于I 类毒株是NDV 的原始病毒库，由此推测I 类病毒在鸡群内广泛传播后产生了II 类的毒株，在此过程中P 基因丢失了12 nt 。根据NDV 发生的历史事件，推测自然界中最早出现了病毒基因组长度为15 198 nt的I 类病毒，该病毒在P 基因缺失12 nt 后出现了基因组的长度为15 186 nt的早期的基因型II 类毒株，之后的进化过程中早期基因型毒株在NP 基因5′ NCR插入了6 nt，进而产生了晚期的基
2 NDV 的进化
自从1926年以来，新城疫在世界范围内共发生了4次大流行。第一次新城疫大流行发生在20世纪60年代以前，NDV 流行株主要是基因II 、III 和IV 型的毒株，危害的对象主要是鸡，历时近30年，经亚洲和欧洲传至世界各地；第二次新城疫大流行的源头在中东，时间在1960—1970年代，基因型
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因V~VIII型毒株。
2012年，在西非出现了基因组长度为15 198 nt的基因VII 型NDV ，该毒株完全符合晚期基因型毒株的特征，只不过在HN 与L 基因的间隔区又插入了6 nt [19]。
研究表明，根据NDV 毒株的基因组全长绘制的遗传发生树，与6个基因的编码区核酸序列分别绘制遗传发生树，和基于F 基因47~420 nt位核苷酸序列的遗传发生树所显示的NDV 的演化规律基本一致，说明NDV 的演化是在基因组的整体水平上同步进行的，基因组在演化过程中先后出现了I 类和 II类两大分支，同时出现了上述的多个基因型。2.2 NDV 宿主范围的演化
随着4次世界范围内NDV 的大流行和疫苗的广泛和频繁使用，NDV 的宿主范围随之明显扩大。由于NDV 的毒力不同、宿主的年龄和品种等原因，导致NDV 对不同遗传背景宿主的致病性差异较大。2.2.1 水禽
水禽是新城疫弱毒株的天然贮存库，水禽和海岸鸟感染NDV 无毒株的比例较高，这些病毒在禽类中不引起任何临床症状。关于美国活禽市场和海岸鸟的无毒新城疫分离株的遗传进化分析显示，这些病毒中的70%属于I 类病毒，30%属于II 类病毒。其中近乎半数的 I类病毒来源于野鸭。水禽和海岸鸟同时也是 II类 NDV的携带者，这些II 类
[20]
病毒主要属于基因I 型和II 型。
水禽曾被认为对NDV 强毒具有极强的抵抗力，
该病毒在全世界范围内很多国家分离到，说明自从1980年代以来该病毒已经在全世界范围内长期存在和流行。鸽NDV 不同的分离株对鸡的致病性有较大的差别。根据核苷酸序列推导的氨基酸序列组成来看，所有鸽NDV 分离株的F 基因裂解位点都具有强毒特性，但有些鸽NDV 分离株却对鸡表现出中等毒力或者低毒力[23]。虽然其他基因型的NDV 也可感染鸽，特别是基因VIId 亚型人工感染时，甚至比VIb 亚型对鸽的致病性还要强，但从鸽分离到的NDV 绝大多数为基因VIb 亚型，因此，该亚型对鸽有明显的宿主特异性。研究表明，虽然基因VIb 亚型NDV 对鸽的致病性没有基因VIId 亚型强，但是其感染鸽后的病毒载量和带毒排毒时间均大于基因VIId 亚型病毒，从另一侧面说明基因VIb 亚型病毒对鸽的特殊嗜性。
Chong 等[24]对鸽VIb 亚型NDV 的起源和进化进行了较详细的研究，表明早期的VIb 亚型鸽NDV 与1960年代出现的鸡源基因VIa 亚型的亲缘关系很近，这与根据全基因组进化速率推算出的其最近祖先病毒出现时间完全一致，因此，证实VIb 型鸽NDV 是鸡源基因VIa 亚型感染鸽后产生适应性进化的产物。2.2.3 其他禽鸟类
到目前为止，除了鸡、家养水禽、鸽外，鸵鸟、麻雀、鹦鹉、鹌鹑、山鸡、鸬鹚、鹧鸪、孔雀等均可感染NDV 强毒并发病，已知能自然或人工感染NDV 的鸟类超过了250多种，种种现象表明，NDV 感染的宿主范围正在逐渐扩大。2.2.4 哺乳动物
我国自1999 年以来局部地区也不断有猪副黏病毒病发生的报道[25-26]。采集死亡猪的肠道内容物和内脏组织进行负染电镜观察，可见病毒粒子有典型的副黏病毒特征。我国猪源NDV 的出现可能是由于一些地区存在猪和鸡混养的模式，造成使用在家禽上的疫苗株感染。另外，有一些基层兽医人员把ND 疫苗作为干扰素诱导剂使用，如报道在临床上使用新城疫I 系苗预防或治疗新生仔猪流行性腹泻或其他疾病。因此，有可能是在临床上使用了新城疫疫苗防治猪病而造成猪的感染。由于分离到的猪源NDV 的F 及HN 基因与使用的NDV 疫苗株，如LaSota 疫苗株存在很高的同源性，其来源于家禽的疫苗病毒是没有疑问的。但是对所有从猪分离到NDV 与发生猪病的联系，都必须进一步研究才能下结论，目前没有任何证据说明NDV 可以引发
鹅、鸭等能携带NDV ，但通常状态下不表现任何的临床症状，即使是强毒感染也不表现明显症状，仅表现为带毒。但是近年来，NDV 出现了某些新的致病特点，特别是对鹅表现出较强的致病性，其致病类似于鸡新城疫。1997年，在我国华南和华东地区爆发引起鹅高发病率和高死亡率的新城疫疫情后，科研人员才开始重视水禽在NDV 储存和传播
[21]
中的作用。引起鹅大面积发病的NDV 主要为基因VII 型，它们与鸡源VII 型NDV 在遗传发生、
免疫原性和致病性上均无明显差异，且无宿主特异[22]
性，推测是新出现的基因VII 型病毒对鹅具有强致病性。近年来鸭感染NDV 的报道也屡见不鲜，提示NDV 对水禽的危害进一步增加。2.2.2 鸽
鸽NDV 被认为是经典新城疫病毒的变异株，这种变异株病毒最早出现于中东地区，后迅速传播到欧洲并造成1980年代初的大流行。最近几年，
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猪的临床疾病。我们应密切关注在猪群中使用大剂量NDV 疫苗可能产生的严重后果。
人也能感染NDV ，可引起急性结膜炎，偶尔也可侵害角膜。多数病例病程为7~10 d，不经治疗就可康复，目前还没有人传染人的报道。2007年报道了从一肺炎死亡病例中分离出一株NDV ，剖检后免疫组化确认了在脱落的肺泡细胞中存在这种NDV [27]，分离株F 蛋白裂解位点具有典型的NDV 强毒特征。
2.3 NDV 毒力的进化
在NDV 中，class I病毒主要为无毒和弱毒型；class II病毒的9个基因型中，I 型为弱毒(1998—2000II 型中有强毒、年澳大利亚出现的I 型强毒株除外) ；
III型至IX 型中除了部分鸽源中强毒和弱毒株；
VIb 亚型病毒为中等毒力外，其他分离株均为强毒。2.3.1 NDV 弱毒的进化
NDV 最早以弱毒的形式在自然界中广泛传播，在某种自然条件下，弱毒株可以通过基因组突变进化成为强毒株。甚至，从流行病学资料和间接的实验证据都可以看出，弱毒株向强毒株的演化并非是偶然事件。
1998年，澳大利亚发生了NDV 强毒的爆发流行，证明分离到的强毒株是从原先鸡群中的弱毒株演变进化而来的。澳大利亚曾于1930年左右分离到无毒的NDV 毒株——AV 株，1933—1966年间，澳大利亚被认为是无NDV 感染国家。20世纪80年代到1998年期间，澳大利亚又分离到数株低毒力NDV 毒株。1998年，在悉尼市的Peat’s Ridge发生了以晚期呼吸道症状为主的新城疫，经鉴定为弱毒(ICPI 值为0.41，F 蛋白裂解位点序列为：
112
NDV 病毒均为无毒株或弱毒株，但是一些实验室在对早期收集的新城疫毒株进行追溯性研究时发现，I 类NDV 强毒株也曾出现过流行。1992年，在非新城疫疫区的爱尔兰爆发的NDV 强毒感染，造成了严重的经济损失，序列分析显示引起此次流行的强毒株属于I 类病毒分支，与此前分离的I 类NDV 弱毒株高度同源，说明I 类毒株中出现的NDV 强毒株由弱毒株进化而来[29]。
Yu 等[30]将水禽中分离到的无致病性裂解位点序列为112ERQERL 117的I 类NDV 无毒株经鸡气囊连续传代(a ) ，第8代(8a ) 之前所得病毒均无明显致病力，但传至第9代(9a ) 时，病毒呈现出了中等毒力。再将第9代病毒经鸡脑内进行传代(b ) 后发现，第1代(9a1b ) 病毒的毒力基本没变，而传至第5代(9a5b ) 时病毒表现出标准的强毒株特征(MDT 、ICPI 、IVPl 分别为56 h、1.88 、2.67) ，能感染鸡的各种组织，且毒株9a5b F蛋白裂解位点序列由最初的
112
ERQERL 117变为了112KRQKRF 117，上述结
果同样表明，F 蛋白的裂解位点序列对毒力影响至关重要。
由上可知，不管通过人工传代还是自然选择，弱毒NDV 的毒力均可能发生增强，并且这种毒力的改变与F 基因裂解位点的核苷酸突变相关。因此，对弱毒NDV 进行持续的监测与病原生态学研究也是十分必要的。
2.3.2 NDV 强毒的进化
2009年，仇旭升等[31]从发病禽群中分离到了两株III 型NDV (JS/7/05/Ch 和JS/9/05/Go) ，虽然两株基因III 型NDV 与Mukteswar 株基因和蛋白序列的同源性均高达99%以上，表明该分离株由I 系苗
JS/7/05/Ch (IVPI = 2.18) 进化而来，但就其毒力而言，和JS/9/05/Go (IVPI = 1.33) 明显高于疫苗株Mukteswar
(IVPI = 0.08)，说明I 系苗在使用过程中出现了毒力增强
[31]
RRQGRL 117) 。两个月后在悉尼的Dean Park分离
1.60~1.70，F 蛋白裂解到了NDV 强毒株(ICPI 为：
112
RRQRRF 117) 。在随后的两年间，澳位点序列为：
大利亚多个地区相继发生了ND ，并分离到多株
NDV 强毒，虽然这些毒株的F 蛋白裂解位点序列为112RRQRRF 117，但在遗传关系上与Peat’s Ridge株密切相关，而且在许多鸡场分离到NDV 强毒株前，都曾检测到Peat’s Ridge株的感染，从而进一步证实澳大利亚1998—2000年发生的NDV 强毒爆发流行与之前分离到的弱毒NDV 有着紧密的遗传关系，在此期间NDV 经历了由弱毒到强毒的演化过程。澳大利亚发生的此起事件，是II 类毒株中基因I 型NDV 在自然界由弱毒进化为强毒的最经典例子[28]。
虽然目前从野生水鸟和活禽市场分离到的I 类
。
在墨西哥，1998—2006年间分离到的NDV 都属于class II中的基因V 型。但是，这些病毒却在遗传进化上明显的分属于两个分支，一个归为早期分支(1998—2001年) ，另一个归为近期分支(2004—2006年) 。研究发现1998—2001年间分离的病毒与2004—2006年分离的病毒只有93%~94%的同源性，这说明1998—2001年间的病毒受到了某种选择压力的作用，这种作用导致了新分支病毒的出现，进一步研究发现2004—2006年分离病毒的毒力与1998—2001年分离毒株相比出现了明显
300生命科学第28卷
的增强[32]。
在基因VI 型NDV 中最早出现的毒株为VIa
VIc 和VId 亚型。研究表明，亚型，之后出现了VIb 、后面3个亚型的毒株均由VIa 亚型毒株进化而来。
VIb 亚型NDV 是VIa 亚型感染鸽后在鸽体内进化的产物，VIc 和VId 亚型毒株仍为鸡源毒株，但毒力与VIa 亚型毒株相比有所增强。
基因VII 型NDV 是当前世界上的优势流行株，虽然VII 型NDV 的毒力指标和其他强毒株相似，但该型对脾脏和肠道淋巴组织的损伤程度明显重于
[33]
早期基因型的强毒株，如Herts33 (基因IV 型) 等。VII 型NDV 感染SPF 试验鸡和鹅后，试验动物的脾脏会表现严重的坏死病变，出现大理石样的白色坏死灶；肠道主要表现为出血及坏死病变，严重者遍及整个肠道和泄殖腔，肠黏膜表面有数量不等、大小不一的黄白色坏死点[21]。2011年，美国佐治亚大学Susta 等[34]分别用基因II 型、V 型和VII 型新城疫强毒感染4周龄SPF 试验鸡，试验结果同样显示，VII 型毒株感染鸡的脾脏、胸腺、法氏囊及盲肠扁桃体的病变程度均明显重于II 型和V 型毒株。同时，美国农业部东南禽病研究所研究的结果还证实，基因VII 型NDV 感染后可诱发强烈的宿IL-6等细胞因子主应答反应，产生大量的IFN-γ 、
[35]
将 35 株NDV 分为7个群，同一群内NDV 的重要
流行病学特征和生物学特性极其相似。在2004年，Tsai 等[38]对1969—1996年间分离自台湾的36株NDV 进行抗原性分析，22株单抗将36株NDV 分为C1、P 、E 、G 、H 群以及1个未定型群。
但近年来，新城疫疫苗在鸡群中频繁使用，在高强度持续的免疫压力下病毒的抗原发生了变化。交叉中和试验结果表明，常用疫苗株与部分流行株之间的抗原性存在差异。台湾学者Lin 等[39]对基因II 型疫苗株与流行株之间进行了交叉中和试验，数据显示，流行毒株与B1和克隆30株之间的抗原性差异值(R ) 主要在0.15~0.5之间，从而证明流行株与疫苗株之间存在明显的抗原差异。韩国学者Cho 等[40]对一株基因VIId 亚型NDV 和疫苗株LaSota 进行了交叉中和试验，结果发现它们之间的R 值仅为0.18，并且发现该流行株与疫苗株制备的血清与流行株进行中和试验时，流行株血清对自身的中和效价竟是疫苗株血清对其效价的128倍，表2008年，Qin 等[11]明毒株之间存在明显的抗原差异。
通过疫苗的交叉保护试验发现，疫苗株对部分流行株不能提供理想的免疫保护。目前普遍认为，疫苗株与流行株之间的基因型和抗原性差异是引起免疫鸡群感染强毒的主要原因之一。
HN 蛋白是NDV 囊膜上最大的纤突糖蛋白，具有识别靶细胞上的唾液酸受体，介导病毒对靶细胞的吸附，并促使新生的病毒子从感染细胞膜表面
[41]
释放的功能，在免疫反应中扮演着重要的角色。作为重要的保护性抗原蛋白，HN 蛋白始终被研究
，
并且可以诱导明显的细胞凋亡，宿主细胞强烈的应答与机体组织病理学的变化具有明显的相关性。与早期毒株相比，基因VII 型毒株更易在免疫鸡群中感染和传播，推测这种现象可能与VII 型毒株对宿主免疫系统侵害能力的增强有关。2.4 新城疫病毒的抗原性进化
1983年，Russell 和Alexander [36]利用NDV Ulster 2C 制备了9株单克隆抗体，通过单抗排谱方法将40个1981年之前的NDV 分离株分为A~H 8个抗原群，同一群毒株与这些单抗的反应谱相同，且同群的毒株具有相同的生物学和流行病学特征。他们研究发现，上述9株单抗与鸽新城疫毒株的反应谱系不同于上述的8个抗原群毒株，因此，将鸽源NDV 分离株归为P 群，认为鸽源NDV 是鸡
[37]
源NDV 的变异株。徐秀龙和刘秀梵以3种不同毒力型的NDV 为免疫抗原，获得21株单克隆抗体，
者们所重视。Iorio 等[42]已证明在HN 蛋白上存在
5个最强的抗原区，345~353位、分别为193~201位、513~521位、494位及569位氨基酸区域，研究结果显示，这些区域或其邻近氨基酸序列的变化都会导致毒株与单抗的反应性发生根本性的改变。流行株与基因I 和II 型疫苗株的HN 蛋白序列的比对分析结果显示，流行株HN 蛋白在这些区域或邻近的氨基酸序列与疫苗株存在明显的不同，其中大部分氨基酸的改变都可涉及到极性、结构及所带电荷的变化，这些不同位点在疫苗株与流行株之间同时存在，表明它们之间在一定程度上存在着抗原性差异。
研究发现近年来HN 蛋白第347位残基发生E 到K 突变的毒株分离率正呈上升趋势，该变异点位于抗原显性决定簇的345~353位，对抗原性改变起
[43][44]
分析了10个关键作用。2010年，Cattoli 等
2008年非洲分离株的HN 序列，发现有6个毒株在
应用这些单克隆抗体与国内外的27株参考毒株和8株野外分离毒株进行中和试验、血凝抑制试验和溶血抑制试验，结果有15 株单克隆抗体能与所有被试的NDV 毒株发生反应。另外，6株单克隆抗体能够鉴别出NDV 毒株的抗原差异，根据试验结果
第3期胡顺林，等：新城疫病毒的遗传进化301
Cho 等[40]研究发现在2008该决定簇发生了突变；
年韩国流行分离株中该类变异株已占到80%。研究数据显示，2009年以来该变异株已占到了我国华东地区分离株的70%左右。上述结果表明，此类变异株在世界上已呈流行趋势，因此，该类变异株的出现应得到高度重视。
[3] [4]
[5]
3 新城疫病毒进化对疫苗免疫效力的影响
目前国内外使用的疫苗株主要属于基因I 型和II 型，其中使用最广泛的疫苗株LaSota 为基因II 型，其分离于1946年，距今已近70年。NDV 是一种持续进化的病毒，近70年来已先后出现了多个基因型，随着时间的推移，流行株与疫苗株的遗传距离越来越远，抗原性的差异也有所增大，因此，流行株与疫苗株基因型之间的差异被认为是免疫鸡群中发生非典型ND 的主要原因。国内外实验室研究业已证明，使用与流行株相同基因型的疫苗株可以
[45]
有效预防NDV 流行强毒株的感染。
目前我国NDV 流行毒株的优势基因型为VIId 亚型，研制和使用VIId 亚型ND 疫苗对我国ND 的控制将具有重要的现实意义，为此，扬州大学利用反向遗传技术从近10年来分离的NDV 强毒中筛选出遗传稳定、生物学特性优良的基因VIId 亚型毒株作为母本毒株，成功研制出了基因VII 型NDV
[46]
致弱株A-VII ，其毒力符合弱毒株的标准，且该
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
毒株在鸡胚中具有较强的繁殖性能。该毒株灭活疫苗的临床试验数据显示，与疫苗株LaSota 相比，该疫苗不仅能有效降低流行株攻毒后试验动物的排毒率，而且能显著减少喉气管和泄殖腔中的病毒含量；同时，该灭活疫苗诱导抗体产生的速度显著快于常规疫苗株LaSota ，且免疫后诱导产生的HI 抗体较LaSota 高2个滴度。该疫苗可有效预防我国NDV 流行株的感染，能有效控制免疫鸡群中的非典型ND ，同时也是第一个可用于鹅ND 预防的疫苗。重组新城疫病毒灭活疫苗(A~VII株) 于2014年成功获得了国家一类新兽药证书，该疫苗毒株与当前我国禽群中流行毒株的基因型完全一致，因此，该疫苗的使用，在控制我国新城疫的流行中显示出了广阔的应用前景。
[参 考 文 献]
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第28卷 第3期2016年3月生命科学
Chinese Bulletin of Life SciencesV ol. 28, No. 3Mar., 2016
DOI: 10.13376/j.cbls/2016038
文章编号：1004-0374(2016)03-0295-08
刘秀梵，教授，博士生导师，动物传染病学专家。2005年当选为中国工程院院士，2015年入选世界兽医家禽协会荣誉堂。他主要从事畜禽传染病流行病学与发病机理研究。在禽流感、新城疫等重要动物传染病的流行病学与致病机理方面开展了系统的研究工作，先后研制出用于禽流感(H9N2亚型) 、鸡传染性法氏囊病和新城疫等疫病预防的7种新型疫苗，取得了新兽药注册证书，并在全国范围内得到了推广应用，产生了显著的经济与社会效益。先后获国家科技进步奖二等奖1项、部省级科技进步奖一等奖3项；曾获中国农业英才奖和何梁和利科技创新奖。他主编了《兽医流行病学》和《单克隆抗体在农业上的应用》，在国内外学术刊物发表论文400多篇，培养博、硕士研究生160多名，指导1篇博士论文被评为全国百篇优秀博士学位论文
。
新城疫病毒的遗传进化
胡顺林，刘秀梵*
(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州 225009)
摘 要：新城疫病毒属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属(Avulavirus ) ，病毒的基因组为单股、负链、不分节段
的RNA ，因此，病毒基因组自身变异的频率较高，是新城疫病毒进化的主要因素。同时，新城疫病毒的多宿主特性和疫苗的频繁使用等因素对病毒的进化也起到了促进作用。病毒在进化过程中出现了多个基因型和基因亚型，并导致了病毒宿主感染范围的扩大、毒力的多样性和抗原性的变异。关键词：新城疫病毒；基因组；进化；基因型
S852.65 文献标志码：A 中图分类号：Q939.47；
The heredity and evolution of Newcastle disease virus
HU Shun-Lin, LIU Xiu-Fan*
(Key Laboratory of Animal Infectious Disease, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract: Newcastle disease virus (NDV) is a member of the genus Avulavirus in the family Paramyxoviridae. The genome of NDV is a non-segmented, single-stranded, negative-sense RNA. Therefore, the frequency of genomic variation is relatively high due to the inherent error rate of the RNA polymerase-dependent RNA replication, which is the main driving force for virus evolution. Additionally, the multiple host range for NDV and frequent vaccination for the control of ND also promote the NDV evolution. During the evolution, NDV has generated variants of multi-genotypes and subgenotypes, resulting in expanded host range, virulence diversity and antigenic variations. Key words: Newcastle disease virus; genome; evolution; genotype
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) 是一个持续进化的病毒，虽然只有一个血清型，但有多个基因型，而不同基因型毒株的生物学特性之间
存在较明显的差异。自1926年以来，新城疫在世
收稿日期：2016-01-03
基金项目：公益性行业(农业) 科研专项(201303033)；国家科技支撑计划(2015BAD12B03)*通信作者：E-mail: xfl[email protected]
296生命科学第28卷
界范围内已发生四次大流行，对家禽养殖业造成了极大的经济损失，每次流行都由新的基因型或基因亚型的毒株所引发。NDV 属于副黏病毒科禽腮腺炎病毒属，是一种有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA 病毒。NDV 的复制依靠RNA 依赖性的RNA 聚合酶，在复制过程中该聚合酶缺乏校对功能，因此，病毒基因组的突变率相对较高，在复制中会产生大量的准种。在自然选择条件下，部分准种的生存优势逐步显现，并得以在自然界中传播，一定程度上促进了病毒的进化，同时，宿主、环境、免疫压力等因素的作用也会对病毒的进化产生影响。
生突变，特别是F 和HN 基因编码的蛋白位于病毒粒子的表面，面临的免疫选择压力相对较大。山东农业大学巩艳艳等[4]通过抗体与病毒同时孵育的方
法，在细胞上研究了新城疫抗体对NDV HN基因和F 基因变异的影响。其研究结果发现，有抗体组HN 基因发生突变的位点数明显多于无抗体组，且非同义突变(NS ) 与同义突变(S ) 比值NS/S为6，明显高于无抗体组的NS/S比值3.4；在有抗体组，有5个核苷酸位点发生稳定的非同义突变，而且其中3个与已知的抗原表位密切相关。F 基因在有抗体组也出现了2个稳定的突变，而在无抗体组未发
[5]
生变化。扬州大学Gu 等通过序列分析后发现，HN 蛋白上存在3个阳性选择位点(266、347 和 540位) ，且这3个位点在疫苗株与流行株上存在明显
1 病毒进化动力学
1.1 新城疫病毒的基因突变
NDV 属于单股负链RNA 病毒，具有RNA 病毒共有的特征，其RNA 聚合酶缺乏有效的RNA 校正功能，病毒自我纠错能力有限，加上病毒本身具有较高的复制效率，使得病毒基因自身的变异率相对于DNA 病毒来讲要高得多。1.1.1 自然状态下的NDV 变异
点突变是NDV 变异的主要方式，其根本原因是RNA 聚合酶缺乏校正能力，NDV 的基因组结构模式为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP ) 、磷蛋白(P ) 、基质蛋白(M ) 、融合蛋白(F ) 、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN ) 和聚合酶蛋白(L ) [1]。Chong 等[2]对世界上不同时期、不同地域、不同宿主来源的54个NDV 代表株全基因组中的各基因片段，分别进行了生物信息学统计分析，发现NDV 病毒各基因均存在核苷酸的突变，且不同基因之间的突变率有一定差异，其中P 基因变异的频率最大，其次是F 和HN 基因。美国农业
[3]
部东南禽病研究所Miller 等利用生物信息学方法，结合大量的NDV 基因组序列，对影响NDV 基因
差异。
1.2 NDV 的重组
NDV 基因组为单股负链不分节段的RNA ，一般认为发生基因重组的概率较低。2003年，Chare 等[6]最早报道了NDV 重组的现象。他们在进行负链RNA 遗传进化的研究中，对来源于35个负链RNA 病毒中79个不同基因片段的2 154条序列进行了分析，发现至少有5种病毒有重组现象，其中就包括NDV 。最早发现的两株重组NDV ，一株来自中国的鹅源新城疫强毒GPMV/QY97-1 (简写QY97-1) ，是最早在国内分离的基因VII 型NDV 之一；另一株则是来自墨西哥的chicken/Mexico/ 37822/96。序列分析表明，QY97-1 株HN 蛋白5′端1~273个氨基酸序列与我国目前广泛流行的VII 型NDV 代表株ZJ/1/00/Go同源性达97.7%，而274~570氨基酸序列则与我国的经典强毒株F 48E 9的同源性达99.7%，因此，认为QY97-1株的HN 基因是F 48E 9和基因VII 型NDV 的 HN基因发生重组的产物。而Mexico 毒株的重组则发生在NP 基因，是chicken/Mexico/37822/96和chicken/Italy/Milano/45的重组，这两个亲代毒株分别来自欧洲和美洲且时间跨度超过了50年。2010年，Chong [2]
等通过对GenBank 中NDV 基因组序列的分析发现，来自中国的基因VII 型鹅源毒株NA-1 (其L 基因有基因VI 型片段的重组) 、来自印尼的基因VII 型Cockatoo 源毒株(NP 基因有基因II 型片段重组) 、来自意大利的鸽源基因VIb 亚型毒株(M 基因有基因II 型片段重组) 和来自中国的HB92株(M 和L 基因源于V4，其他基因源于LaSota ) 均发生了重组。
组变异的进化因素进行了分析和评估，发现在NDV 基因组编码的6个蛋白中，以F 蛋白的变异频率最高。除少数蛋白上的位点处于阳性选择外，总体来说，病毒的6个主要结构蛋白均处于较强的阴性选择状态。同时，Miller 等[3]的研究还发现在来源于野鸟的毒株中，强毒株基因组的年变异率要高于弱毒株，由此推测病毒毒力的增强可以加速NDV 毒株的进化。
1.1.2 免疫选择压造成的影响
疫苗免疫是预防新城疫的重要途径和方法。在长期的疫苗免疫选择压下，病毒的基因组往往会发
第3期胡顺林，等：新城疫病毒的遗传进化297
近年来，关于NDV 重组的报道不断增多，而
2008—2011年期间，且大多数重组病毒发生在中国。
国内至少有5个实验室在国际上报道了NDV 的重组事件
，这引起研究者的广泛关注。
从上述有关NDV 重组的报道来看，似乎NDV
[7-12]
为V 型和VI 型，病原来源于鹦鹉类禽种；第三次新城疫大流行源头在中东的鸽，时间为1980—1990年，基因型为VIb 亚型；自20世纪90年代以来，新城疫一直处于第四次大流行，源头在亚洲远东地
[15]
区，基因型主要是VII 型。除基因型发生变化外，NDV 进化还表现在感染宿主范围的扩大、病毒毒力和抗原性改变等方面。2.1 NDV 基因组的演化
目前，一般将NDV 分为两个大的谱系I 类(class I ) 和II 类(class II) 。I 类毒株基因组全长均为15 198 nt；而II 类病毒的基因组长度有15 186 nt和15 192 nt两种，基因组长度的差异是NDV 进化过程中出现的重要历史特征[16]。按传统的NDV 分类，class II中的NDV 主要有基因I~IX 9个基因型，包括了1960年之前出现的基因I~IV型病毒，即早期
1960年之后出现病毒，其基因组全长为15 186 nt；
的基因V~VIII型病毒，即晚期病毒，其基因组全
长为15 192 nt；而基因IX 型病毒在出现时间上和遗传发生上属早期病毒，但其具有晚期病毒的基因组全长，即15 192 nt。IX 型NDV 毒株与基因V~VIII型毒株一样，NP 基因5′ NCR也存在6 nt的插入，因此，其基因组长度为15 192 nt。IX 型NDV 中的 F48分离于1946年，是目前最早分离到的15 192 nt基因组长度毒株，暗示15 192 nt基因组长度的毒株早在20世纪40年代就已经出现，基因组长度的改变是一个早期事件[17]。
由此，可以推测基因IX 型是介于早期毒株和晚期毒株之间的过渡毒株。晚期基因型毒株可能由此类过渡性病毒进化而来，15 192 nt基因组的出现归于早期毒株在NP 基因5′ NCR插入了6 nt
[18]
基因重组不是稀有事件，而是普遍发生的事件，概率比较高的事件。但是，这些作者都忽视了这样的事实：他们判定发生重组的依据是这些毒株的RNA 经RT-PCR 方法扩增所测得的基因序列，而如果样品中混有两种NDV 毒株，则PCR 扩增时聚合酶模板变换，就可导致人为重组；同时，实验室内也可能产生重组体。美国农业部东南家禽研究所资深
[13]
研究员Afonso ，于2008年在中国学者连续报道3篇NDV 重组的文章后，就写信给Journal of Virology指出了这一点。同时，他还强调，还没有一个报告能确定NDV 的重组事件产生了自然子代病毒。为了进一步搞清楚所报道的NDV 重组事件是否都是真正自然发生的重组事件，还是混有实验室发生的
[14]
人工重组，Song 等进行了一系列研究。他们用5种不同的统计学方法分析了GenBank 中80株
NDV 的全基因组序列，发现至少有8株病毒有重组事件，重组率高达10%，而且其中的5株病毒有多个重组事件发生在基因I 、II 、III 型疫苗毒株和当前呈优势流行的基因VII 型毒株之间。但对根据GenBank 中公布的序列被确定为重组的两株病毒，China/Guangxi09/2003和NDV/03/018，进行蚀斑纯化后重新测序，发现原先的重组根本不存在，证明其是PCR 扩增过程中模板改变而引起的人工重组，因为原先的China/Guangxi09/2003和NDV/03/018样品中经验证的确混有基因III 型病毒[14]。Song 等的研究说明，在GenBank 上登录的NDV 基因序列有一些是不准确的，这会影响对NDV 进化的生物信息学分析。所以，对NDV 重组事件的判定应持慎重态度，为避免出错，第一要检查测序的原始样品是否混有不同基因型的病毒；第二是将重组病毒传代、纯化后测序，证明其后代也是重组病毒。
。I
类毒株的基因组的特点也可以作为间接的证据证明
15 192 nt长度的基因组由15 186 nt长度的进化而来，I 类毒株被认为是NDV 的原始病毒，其 NP基因和II 类的基因I~IV型NDV 一样，不存在6 nt的插入。
I 类NDV 基因组的长度为15 198 nt，与II 类毒 I类病毒的P 基因阅读框内多出了12个nt [16]。株相比，
由于I 类毒株是NDV 的原始病毒库，由此推测I 类病毒在鸡群内广泛传播后产生了II 类的毒株，在此过程中P 基因丢失了12 nt 。根据NDV 发生的历史事件，推测自然界中最早出现了病毒基因组长度为15 198 nt的I 类病毒，该病毒在P 基因缺失12 nt 后出现了基因组的长度为15 186 nt的早期的基因型II 类毒株，之后的进化过程中早期基因型毒株在NP 基因5′ NCR插入了6 nt，进而产生了晚期的基
2 NDV 的进化
自从1926年以来，新城疫在世界范围内共发生了4次大流行。第一次新城疫大流行发生在20世纪60年代以前，NDV 流行株主要是基因II 、III 和IV 型的毒株，危害的对象主要是鸡，历时近30年，经亚洲和欧洲传至世界各地；第二次新城疫大流行的源头在中东，时间在1960—1970年代，基因型
298生命科学第28卷
因V~VIII型毒株。
2012年，在西非出现了基因组长度为15 198 nt的基因VII 型NDV ，该毒株完全符合晚期基因型毒株的特征，只不过在HN 与L 基因的间隔区又插入了6 nt [19]。
研究表明，根据NDV 毒株的基因组全长绘制的遗传发生树，与6个基因的编码区核酸序列分别绘制遗传发生树，和基于F 基因47~420 nt位核苷酸序列的遗传发生树所显示的NDV 的演化规律基本一致，说明NDV 的演化是在基因组的整体水平上同步进行的，基因组在演化过程中先后出现了I 类和 II类两大分支，同时出现了上述的多个基因型。2.2 NDV 宿主范围的演化
随着4次世界范围内NDV 的大流行和疫苗的广泛和频繁使用，NDV 的宿主范围随之明显扩大。由于NDV 的毒力不同、宿主的年龄和品种等原因，导致NDV 对不同遗传背景宿主的致病性差异较大。2.2.1 水禽
水禽是新城疫弱毒株的天然贮存库，水禽和海岸鸟感染NDV 无毒株的比例较高，这些病毒在禽类中不引起任何临床症状。关于美国活禽市场和海岸鸟的无毒新城疫分离株的遗传进化分析显示，这些病毒中的70%属于I 类病毒，30%属于II 类病毒。其中近乎半数的 I类病毒来源于野鸭。水禽和海岸鸟同时也是 II类 NDV的携带者，这些II 类
[20]
病毒主要属于基因I 型和II 型。
水禽曾被认为对NDV 强毒具有极强的抵抗力，
该病毒在全世界范围内很多国家分离到，说明自从1980年代以来该病毒已经在全世界范围内长期存在和流行。鸽NDV 不同的分离株对鸡的致病性有较大的差别。根据核苷酸序列推导的氨基酸序列组成来看，所有鸽NDV 分离株的F 基因裂解位点都具有强毒特性，但有些鸽NDV 分离株却对鸡表现出中等毒力或者低毒力[23]。虽然其他基因型的NDV 也可感染鸽，特别是基因VIId 亚型人工感染时，甚至比VIb 亚型对鸽的致病性还要强，但从鸽分离到的NDV 绝大多数为基因VIb 亚型，因此，该亚型对鸽有明显的宿主特异性。研究表明，虽然基因VIb 亚型NDV 对鸽的致病性没有基因VIId 亚型强，但是其感染鸽后的病毒载量和带毒排毒时间均大于基因VIId 亚型病毒，从另一侧面说明基因VIb 亚型病毒对鸽的特殊嗜性。
Chong 等[24]对鸽VIb 亚型NDV 的起源和进化进行了较详细的研究，表明早期的VIb 亚型鸽NDV 与1960年代出现的鸡源基因VIa 亚型的亲缘关系很近，这与根据全基因组进化速率推算出的其最近祖先病毒出现时间完全一致，因此，证实VIb 型鸽NDV 是鸡源基因VIa 亚型感染鸽后产生适应性进化的产物。2.2.3 其他禽鸟类
到目前为止，除了鸡、家养水禽、鸽外，鸵鸟、麻雀、鹦鹉、鹌鹑、山鸡、鸬鹚、鹧鸪、孔雀等均可感染NDV 强毒并发病，已知能自然或人工感染NDV 的鸟类超过了250多种，种种现象表明，NDV 感染的宿主范围正在逐渐扩大。2.2.4 哺乳动物
我国自1999 年以来局部地区也不断有猪副黏病毒病发生的报道[25-26]。采集死亡猪的肠道内容物和内脏组织进行负染电镜观察，可见病毒粒子有典型的副黏病毒特征。我国猪源NDV 的出现可能是由于一些地区存在猪和鸡混养的模式，造成使用在家禽上的疫苗株感染。另外，有一些基层兽医人员把ND 疫苗作为干扰素诱导剂使用，如报道在临床上使用新城疫I 系苗预防或治疗新生仔猪流行性腹泻或其他疾病。因此，有可能是在临床上使用了新城疫疫苗防治猪病而造成猪的感染。由于分离到的猪源NDV 的F 及HN 基因与使用的NDV 疫苗株，如LaSota 疫苗株存在很高的同源性，其来源于家禽的疫苗病毒是没有疑问的。但是对所有从猪分离到NDV 与发生猪病的联系，都必须进一步研究才能下结论，目前没有任何证据说明NDV 可以引发
鹅、鸭等能携带NDV ，但通常状态下不表现任何的临床症状，即使是强毒感染也不表现明显症状，仅表现为带毒。但是近年来，NDV 出现了某些新的致病特点，特别是对鹅表现出较强的致病性，其致病类似于鸡新城疫。1997年，在我国华南和华东地区爆发引起鹅高发病率和高死亡率的新城疫疫情后，科研人员才开始重视水禽在NDV 储存和传播
[21]
中的作用。引起鹅大面积发病的NDV 主要为基因VII 型，它们与鸡源VII 型NDV 在遗传发生、
免疫原性和致病性上均无明显差异，且无宿主特异[22]
性，推测是新出现的基因VII 型病毒对鹅具有强致病性。近年来鸭感染NDV 的报道也屡见不鲜，提示NDV 对水禽的危害进一步增加。2.2.2 鸽
鸽NDV 被认为是经典新城疫病毒的变异株，这种变异株病毒最早出现于中东地区，后迅速传播到欧洲并造成1980年代初的大流行。最近几年，
第3期胡顺林，等：新城疫病毒的遗传进化299
猪的临床疾病。我们应密切关注在猪群中使用大剂量NDV 疫苗可能产生的严重后果。
人也能感染NDV ，可引起急性结膜炎，偶尔也可侵害角膜。多数病例病程为7~10 d，不经治疗就可康复，目前还没有人传染人的报道。2007年报道了从一肺炎死亡病例中分离出一株NDV ，剖检后免疫组化确认了在脱落的肺泡细胞中存在这种NDV [27]，分离株F 蛋白裂解位点具有典型的NDV 强毒特征。
2.3 NDV 毒力的进化
在NDV 中，class I病毒主要为无毒和弱毒型；class II病毒的9个基因型中，I 型为弱毒(1998—2000II 型中有强毒、年澳大利亚出现的I 型强毒株除外) ；
III型至IX 型中除了部分鸽源中强毒和弱毒株；
VIb 亚型病毒为中等毒力外，其他分离株均为强毒。2.3.1 NDV 弱毒的进化
NDV 最早以弱毒的形式在自然界中广泛传播，在某种自然条件下，弱毒株可以通过基因组突变进化成为强毒株。甚至，从流行病学资料和间接的实验证据都可以看出，弱毒株向强毒株的演化并非是偶然事件。
1998年，澳大利亚发生了NDV 强毒的爆发流行，证明分离到的强毒株是从原先鸡群中的弱毒株演变进化而来的。澳大利亚曾于1930年左右分离到无毒的NDV 毒株——AV 株，1933—1966年间，澳大利亚被认为是无NDV 感染国家。20世纪80年代到1998年期间，澳大利亚又分离到数株低毒力NDV 毒株。1998年，在悉尼市的Peat’s Ridge发生了以晚期呼吸道症状为主的新城疫，经鉴定为弱毒(ICPI 值为0.41，F 蛋白裂解位点序列为：
112
NDV 病毒均为无毒株或弱毒株，但是一些实验室在对早期收集的新城疫毒株进行追溯性研究时发现，I 类NDV 强毒株也曾出现过流行。1992年，在非新城疫疫区的爱尔兰爆发的NDV 强毒感染，造成了严重的经济损失，序列分析显示引起此次流行的强毒株属于I 类病毒分支，与此前分离的I 类NDV 弱毒株高度同源，说明I 类毒株中出现的NDV 强毒株由弱毒株进化而来[29]。
Yu 等[30]将水禽中分离到的无致病性裂解位点序列为112ERQERL 117的I 类NDV 无毒株经鸡气囊连续传代(a ) ，第8代(8a ) 之前所得病毒均无明显致病力，但传至第9代(9a ) 时，病毒呈现出了中等毒力。再将第9代病毒经鸡脑内进行传代(b ) 后发现，第1代(9a1b ) 病毒的毒力基本没变，而传至第5代(9a5b ) 时病毒表现出标准的强毒株特征(MDT 、ICPI 、IVPl 分别为56 h、1.88 、2.67) ，能感染鸡的各种组织，且毒株9a5b F蛋白裂解位点序列由最初的
112
ERQERL 117变为了112KRQKRF 117，上述结
果同样表明，F 蛋白的裂解位点序列对毒力影响至关重要。
由上可知，不管通过人工传代还是自然选择，弱毒NDV 的毒力均可能发生增强，并且这种毒力的改变与F 基因裂解位点的核苷酸突变相关。因此，对弱毒NDV 进行持续的监测与病原生态学研究也是十分必要的。
2.3.2 NDV 强毒的进化
2009年，仇旭升等[31]从发病禽群中分离到了两株III 型NDV (JS/7/05/Ch 和JS/9/05/Go) ，虽然两株基因III 型NDV 与Mukteswar 株基因和蛋白序列的同源性均高达99%以上，表明该分离株由I 系苗
JS/7/05/Ch (IVPI = 2.18) 进化而来，但就其毒力而言，和JS/9/05/Go (IVPI = 1.33) 明显高于疫苗株Mukteswar
(IVPI = 0.08)，说明I 系苗在使用过程中出现了毒力增强
[31]
RRQGRL 117) 。两个月后在悉尼的Dean Park分离
1.60~1.70，F 蛋白裂解到了NDV 强毒株(ICPI 为：
112
RRQRRF 117) 。在随后的两年间，澳位点序列为：
大利亚多个地区相继发生了ND ，并分离到多株
NDV 强毒，虽然这些毒株的F 蛋白裂解位点序列为112RRQRRF 117，但在遗传关系上与Peat’s Ridge株密切相关，而且在许多鸡场分离到NDV 强毒株前，都曾检测到Peat’s Ridge株的感染，从而进一步证实澳大利亚1998—2000年发生的NDV 强毒爆发流行与之前分离到的弱毒NDV 有着紧密的遗传关系，在此期间NDV 经历了由弱毒到强毒的演化过程。澳大利亚发生的此起事件，是II 类毒株中基因I 型NDV 在自然界由弱毒进化为强毒的最经典例子[28]。
虽然目前从野生水鸟和活禽市场分离到的I 类
。
在墨西哥，1998—2006年间分离到的NDV 都属于class II中的基因V 型。但是，这些病毒却在遗传进化上明显的分属于两个分支，一个归为早期分支(1998—2001年) ，另一个归为近期分支(2004—2006年) 。研究发现1998—2001年间分离的病毒与2004—2006年分离的病毒只有93%~94%的同源性，这说明1998—2001年间的病毒受到了某种选择压力的作用，这种作用导致了新分支病毒的出现，进一步研究发现2004—2006年分离病毒的毒力与1998—2001年分离毒株相比出现了明显
300生命科学第28卷
的增强[32]。
在基因VI 型NDV 中最早出现的毒株为VIa
VIc 和VId 亚型。研究表明，亚型，之后出现了VIb 、后面3个亚型的毒株均由VIa 亚型毒株进化而来。
VIb 亚型NDV 是VIa 亚型感染鸽后在鸽体内进化的产物，VIc 和VId 亚型毒株仍为鸡源毒株，但毒力与VIa 亚型毒株相比有所增强。
基因VII 型NDV 是当前世界上的优势流行株，虽然VII 型NDV 的毒力指标和其他强毒株相似，但该型对脾脏和肠道淋巴组织的损伤程度明显重于
[33]
早期基因型的强毒株，如Herts33 (基因IV 型) 等。VII 型NDV 感染SPF 试验鸡和鹅后，试验动物的脾脏会表现严重的坏死病变，出现大理石样的白色坏死灶；肠道主要表现为出血及坏死病变，严重者遍及整个肠道和泄殖腔，肠黏膜表面有数量不等、大小不一的黄白色坏死点[21]。2011年，美国佐治亚大学Susta 等[34]分别用基因II 型、V 型和VII 型新城疫强毒感染4周龄SPF 试验鸡，试验结果同样显示，VII 型毒株感染鸡的脾脏、胸腺、法氏囊及盲肠扁桃体的病变程度均明显重于II 型和V 型毒株。同时，美国农业部东南禽病研究所研究的结果还证实，基因VII 型NDV 感染后可诱发强烈的宿IL-6等细胞因子主应答反应，产生大量的IFN-γ 、
[35]
将 35 株NDV 分为7个群，同一群内NDV 的重要
流行病学特征和生物学特性极其相似。在2004年，Tsai 等[38]对1969—1996年间分离自台湾的36株NDV 进行抗原性分析，22株单抗将36株NDV 分为C1、P 、E 、G 、H 群以及1个未定型群。
但近年来，新城疫疫苗在鸡群中频繁使用，在高强度持续的免疫压力下病毒的抗原发生了变化。交叉中和试验结果表明，常用疫苗株与部分流行株之间的抗原性存在差异。台湾学者Lin 等[39]对基因II 型疫苗株与流行株之间进行了交叉中和试验，数据显示，流行毒株与B1和克隆30株之间的抗原性差异值(R ) 主要在0.15~0.5之间，从而证明流行株与疫苗株之间存在明显的抗原差异。韩国学者Cho 等[40]对一株基因VIId 亚型NDV 和疫苗株LaSota 进行了交叉中和试验，结果发现它们之间的R 值仅为0.18，并且发现该流行株与疫苗株制备的血清与流行株进行中和试验时，流行株血清对自身的中和效价竟是疫苗株血清对其效价的128倍，表2008年，Qin 等[11]明毒株之间存在明显的抗原差异。
通过疫苗的交叉保护试验发现，疫苗株对部分流行株不能提供理想的免疫保护。目前普遍认为，疫苗株与流行株之间的基因型和抗原性差异是引起免疫鸡群感染强毒的主要原因之一。
HN 蛋白是NDV 囊膜上最大的纤突糖蛋白，具有识别靶细胞上的唾液酸受体，介导病毒对靶细胞的吸附，并促使新生的病毒子从感染细胞膜表面
[41]
释放的功能，在免疫反应中扮演着重要的角色。作为重要的保护性抗原蛋白，HN 蛋白始终被研究
，
并且可以诱导明显的细胞凋亡，宿主细胞强烈的应答与机体组织病理学的变化具有明显的相关性。与早期毒株相比，基因VII 型毒株更易在免疫鸡群中感染和传播，推测这种现象可能与VII 型毒株对宿主免疫系统侵害能力的增强有关。2.4 新城疫病毒的抗原性进化
1983年，Russell 和Alexander [36]利用NDV Ulster 2C 制备了9株单克隆抗体，通过单抗排谱方法将40个1981年之前的NDV 分离株分为A~H 8个抗原群，同一群毒株与这些单抗的反应谱相同，且同群的毒株具有相同的生物学和流行病学特征。他们研究发现，上述9株单抗与鸽新城疫毒株的反应谱系不同于上述的8个抗原群毒株，因此，将鸽源NDV 分离株归为P 群，认为鸽源NDV 是鸡
[37]
源NDV 的变异株。徐秀龙和刘秀梵以3种不同毒力型的NDV 为免疫抗原，获得21株单克隆抗体，
者们所重视。Iorio 等[42]已证明在HN 蛋白上存在
5个最强的抗原区，345~353位、分别为193~201位、513~521位、494位及569位氨基酸区域，研究结果显示，这些区域或其邻近氨基酸序列的变化都会导致毒株与单抗的反应性发生根本性的改变。流行株与基因I 和II 型疫苗株的HN 蛋白序列的比对分析结果显示，流行株HN 蛋白在这些区域或邻近的氨基酸序列与疫苗株存在明显的不同，其中大部分氨基酸的改变都可涉及到极性、结构及所带电荷的变化，这些不同位点在疫苗株与流行株之间同时存在，表明它们之间在一定程度上存在着抗原性差异。
研究发现近年来HN 蛋白第347位残基发生E 到K 突变的毒株分离率正呈上升趋势，该变异点位于抗原显性决定簇的345~353位，对抗原性改变起
[43][44]
分析了10个关键作用。2010年，Cattoli 等
2008年非洲分离株的HN 序列，发现有6个毒株在
应用这些单克隆抗体与国内外的27株参考毒株和8株野外分离毒株进行中和试验、血凝抑制试验和溶血抑制试验，结果有15 株单克隆抗体能与所有被试的NDV 毒株发生反应。另外，6株单克隆抗体能够鉴别出NDV 毒株的抗原差异，根据试验结果
第3期胡顺林，等：新城疫病毒的遗传进化301
Cho 等[40]研究发现在2008该决定簇发生了突变；
年韩国流行分离株中该类变异株已占到80%。研究数据显示，2009年以来该变异株已占到了我国华东地区分离株的70%左右。上述结果表明，此类变异株在世界上已呈流行趋势，因此，该类变异株的出现应得到高度重视。
[3] [4]
[5]
3 新城疫病毒进化对疫苗免疫效力的影响
目前国内外使用的疫苗株主要属于基因I 型和II 型，其中使用最广泛的疫苗株LaSota 为基因II 型，其分离于1946年，距今已近70年。NDV 是一种持续进化的病毒，近70年来已先后出现了多个基因型，随着时间的推移，流行株与疫苗株的遗传距离越来越远，抗原性的差异也有所增大，因此，流行株与疫苗株基因型之间的差异被认为是免疫鸡群中发生非典型ND 的主要原因。国内外实验室研究业已证明，使用与流行株相同基因型的疫苗株可以
[45]
有效预防NDV 流行强毒株的感染。
目前我国NDV 流行毒株的优势基因型为VIId 亚型，研制和使用VIId 亚型ND 疫苗对我国ND 的控制将具有重要的现实意义，为此，扬州大学利用反向遗传技术从近10年来分离的NDV 强毒中筛选出遗传稳定、生物学特性优良的基因VIId 亚型毒株作为母本毒株，成功研制出了基因VII 型NDV
[46]
致弱株A-VII ，其毒力符合弱毒株的标准，且该
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
毒株在鸡胚中具有较强的繁殖性能。该毒株灭活疫苗的临床试验数据显示，与疫苗株LaSota 相比，该疫苗不仅能有效降低流行株攻毒后试验动物的排毒率，而且能显著减少喉气管和泄殖腔中的病毒含量；同时，该灭活疫苗诱导抗体产生的速度显著快于常规疫苗株LaSota ，且免疫后诱导产生的HI 抗体较LaSota 高2个滴度。该疫苗可有效预防我国NDV 流行株的感染，能有效控制免疫鸡群中的非典型ND ，同时也是第一个可用于鹅ND 预防的疫苗。重组新城疫病毒灭活疫苗(A~VII株) 于2014年成功获得了国家一类新兽药证书，该疫苗毒株与当前我国禽群中流行毒株的基因型完全一致，因此，该疫苗的使用，在控制我国新城疫的流行中显示出了广阔的应用前景。
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