摘要
目的：本课题以正常成年豚鼠为研究对象，通过对膀胱组织内Ｃａｊａｌ样间质细胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｃｅｌｌｓｏｆ
Ｃａｊａｌ，ＩＣＣｓ）超微结构及其与周围组织关系进行观察；对体外培养的ＩＣＣｓ样细胞进行电生理学特性研究，探讨其是否为膀胱的起博细胞，为临床上治疗某些疾病（如ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）提供新的切
入点。
友法：本实验运用透射电镜观察正常成年豚鼠膀胱组织ＩＣＣｓ样细胞的超微结构及其与周围组织关系；采用酶消化法，得到体外培养状态下的ＩＣＣｓ样细胞，并运用膜片钳技术，在全细胞记录模式下
观察其是否具有起博细胞的电流特性，以验证其是否为膀胱的起博细胞。
缝墨！透射电镜观察到ＩＣＣｓ样细胞具有样细胞有丰富的线粒体，发达的粗面内质网、滑面内质网、
高尔基体，ＩＣＣｓ样细胞与其它的ＩＣＣｓ样细胞之问、ＩＣＣｓ样细胞与平滑肌细胞和神经细胞之间多见
由紧密并置的质膜形成的缝隙连接；膜片钳试验记录到成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞具有起搏细胞的特
征电流ｎｌ电流，并且起搏电流特异性阻断剂ＺＤ７２８８对ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流有明显抑制作用，并
呈剂量依赖性。
结论：电镜观察到ＩＣＣｓ样细胞具有独特的超微结构，其与膀胱神经与平滑肌之间的解剖与结构上的
特殊关系可能是ＩＣＣｓ样细胞调节膀胱动力功能的基础；及记录到成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞具有起
搏细胞的特征电流ｍ，特异性阻断剂ＺＤ７２８８对ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流有明显抑制作用，并呈剂量依
赖性。提示ＩＣＣｓ样细胞在膀胱可能起着起搏作用。
关键词：ＩＣＣｓ样细胞，ＫＩＴ蛋白，超微结构，Ｉｌｌ电流论文类型：Ａ（基础研究）
Ａｂｓｔｒａｃｔ
．Ｐｕｒｐｏｓｅ：Ｔｈｉｓｓｕｂｊｅｃｔｓｔｕｄｙｔｈｅｃａｊａｌ－ｌｉｋｅｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｃｅｌｌｓ（ＩＣｅｓ）ｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒ．Ｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｗｅｏｂｓｅｒｖｅ
ＩＣＣｓｕｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｒｅｃｏｒｄＩＣＣｓ
ａ
ｏｆＩＣＣｓｗｉｔｈｔｈｅ
ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ
ｂｙｐｉｇ
ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｂｙ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｗｅ
ｐｒｏｖｉｄｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｅｌｅｃｔｒｉｃｃｕｒｒｅｎｔ
ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐａｔｃｈｃｌａｍｐｔｅｓｔ．ＩｎｔｈｉｓｓｕｂｊｅｃｔＣａｎ
ｐｒｏｏｆ
ｔｏ
ｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａ
ｂｌａｄｄｅｒｉｓｔｈｅｐａｃｅｍａｋｅｒ．ＩｔＣａｎｏｆｆｅｒｔｈｅｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）．
ａ
ｎｅｗｓｔａｒｔｉｎｇｐｏｉｎｔｌｉｎｉｃａｌａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｅｒｔａｉｎｄｉｓｅａｓｅｓ（ｓｕｃｈａｓ
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｎ
ｔｈｉｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｗｅｏｂｓｅｒｖｅＩＣＣｓｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｏｆＩＣＣｓｗｉｔｈｔｈｅ
ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＢｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｐａｔｃｈｃｌａｍｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷｅｏｂｓｅｒｖｅｃｕｒｒｅｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＩＣＣｓｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅ．ｅｅｌｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇｍｏｄｅ．ＩｔＣａｎ
ｐｒｏｖｉｄｅ
ａ
ｐｒｏｏｆｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈａｔｔｈｅＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｉｓｔｈｅ
ｔｏ
ｐａｃｅｍａｋｅｒ．
ｊｕｎｃｔｉｏｎｉｎ
ｎｅＩ＇ｖｅ
Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＩｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｈｅＩＣＣｓＣａｎｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｔｈｅｓｌｉｄｉｎｇｓｕｒｆａｃｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，Ｇｏｒｋｙ
ｈａｖｅｒｉｃｈｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ。ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｈｅＲＥＲ．
ａ
ｂｏｄｙ．Ｉｔｅｘｉｓｔ
ａｎｄ
ｇｒｅａｔｄｅａｌｏｆｔｈｅｇａｐ
ＩＣＣｓ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍ
ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅＩＣＣｓａｓｋｅｄ，ＩＣＣｓ．１ｉｋｅｃｅｌｌｓＡｎｄｔｈｅｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓａｎｄ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ
ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ
ｐａｔｃｈ
ｃｌａｍｐ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｗｅｏｂｓｅｒｖｅｃｕｒｒｅｎｔ
ａｒｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＩＣＣｓｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅ．ｅｅｌｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇ
ｂｙｐａｃｉｎｇＢｌｏｃｋｉｎｇａｇｅｎｔＺＤ７２８８ｉｎ
ａ
ｍｏｄｅ．ａｎｄｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｄｏｓｅ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．
ａ
ｏｆｔｈｅＩＣＣｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ
ａｎｄｔｈｅ
ＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｈａｖｅ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａ
ｐｉｇｂｌａｄｄｅｒ
ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｉｓｔｈｅｓｐｅｃｉａｌ
ｂｌａｄｄｅｒｗｉｔｈｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｎｄｎｅｒｖｅｉｎｔｈｅａｎａｔｏｍｙ
ｕｎｉｑｕｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｎｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｓｐｅｃｉａｌｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｍａｙｂｅｔｈｅ
ｄｙｎａｍｉｃ
ａ
ｂａｓｉｓ
ｒｅｇｕｌａｔｅ
ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｌａｄｄｅｒ．ＷｅｏｂｓｅｒｖｅｃｕｒｒｅｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＩＣＣｓｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇｍｏｄｅ．
ａｎｄｔｈｅ
Ｔｈｉｓ
ｃｕｒｒｅｎｔ
ｏｆｔｈｅＩＣＣｓａｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｐａｃｉｎｇＢｌｏｃｋｉｎｇ
ａｇｅｎｔ
ＺＤ７２８８ｉｎ
ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．
ｓｕｂｊｅｃｔ
ｐｒｏｖｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅＩＣＣｓｉｎ
ｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｍａｙｂｅｔｈｅ
ｐａｃｅｍａｋｅｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＩＣＣｓ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｓ，ＫＩＴｐｒｏｔｅｉｎ，ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｉｈｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｙｐｅｏｆ
Ｔｈｅｓｉｓ：Ａ（ｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ）
ＩＩ
英文缩写
ＤＩ
ａ．ＳＭＡＤＭＥＭ
ＫＩＴ
ＮＯＭＭＩＨＳ
ＢＥＲ
ＤＳＭＣ
ＦＩＴＣ
ＢＳＡＰＢＳ
ＥＧＴＡ
ＩＣＣｓ
ＳＣＦ
ＨＥＰＥＳ
ｍ
Ｉｆ
ＩＱ
英文缩略词表
英文全称
中文对照
Ｄｃｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ
逼尿肌不稳定
ａ—ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ
ａ．平滑肌肌动蛋白Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ
改良基础培养基Ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ
酪氨酸蛋白激酶受体Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ
一氧化氮
Ｍｅｇａｃｙｓｔｉｓ－ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎ・・ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｈｙｐｏｐｅｒｉ・－
巨膀胱．小结肠．肠蠕动迟缓综ｓｔａｌｓｉｓｓｙｎｄｒｏｍｅ合症
Ｂａｓｉｃｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｈｙｔｈｍ
胃肠基本电节律
Ｄｅｔｒｕｓｏｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ
逼尿肌细胞
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ
异硫氰酸荧光素ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ
牛血清白蛋白ｂｕｆｆｅｒｅｄ
ｓａｌｉｎｅ
磷酸盐缓冲液
Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅ）
ａｃｉｄ
乙二醇双（２－氨基乙醚）四乙酸ＩｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｃｅｌｌｓｏｆＣａｊａｌＣａｊａｌｌ司质细胞Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ
干细胞因子
ｐｉｐｅｒａｚｌ∞
ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｍｃ羟乙基哌嗪乙磺酸
ｉｎｗａｒｄｃｕｒｒｅｎｔ
超级化激活的内向电流
ｃｕｒｒｅｎｔ
有趣电流ｃｕｒｒｅｎｔ
奇特电流
ｎＩ
ＢｏＶｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔｅ
ｔｅ臼ｍｃｅｔｉｃ
Ｈ中ｘｙｅｔｈｙｌ
ａＣｌｄ
Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｆｕｎｎｙ
Ｑｕｅｅｒ
石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明
学位论文独创性声明
本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。
研究生签名：
≥葛劫时间：ｕ・稗占月
’ｌＥｌ
使用授权声明
本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。
研究生签名：导师签名：
王葛易
时间：１ｐ俾‘月ｆ『日
Ｉ
铂蕃
吣吼：铷国辞，Ａ／ｌ黾
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
刖舌
（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）
生理状态下，在体膀胱可记录到起源于膀胱顶，向膀胱颈方向传播的自发性、规律性收缩；而离体的膀胱平滑肌肌条在完全阻断了神经影响（切断神经支配以及加入神经阻滞剂）的情况下，仍然存在有节律的自发性收缩。该现象表明离体膀胱平滑肌的收缩不依赖于神经因素而与膀胱平滑肌本身特性有关，是一种由起搏细胞控制的肌源性的自发兴奋、收缩。
膀胱组织所包含的多种细胞成分中，哪一种细胞在膀胱起着起搏作用呢？Ｃａｊａｌ间质细胞在胃肠道的起搏功能为我们探寻膀胱起搏细胞提供了一个理想的切入点。Ｃａｊａｌ间质细胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｃｅｌｌｓ
ｏｆｌＣＣｓ，ＩＣＣｓ）是西班牙神经解剖学家Ｃａｊａｌ于１８９３年率先在肠
道发现的一种特殊的间质细胞【ｌ】。目前人们已证实胃肠道平滑肌组织自发性收缩活动的发生机制是由于其壁内存在一种具有起博功能的ＩＣＣｓ样细胞，这种细胞能够自发性地产生去极化波，通过缝隙连接传播到平滑肌细胞，诱发其产生动作电位。ＩＣＣｓ样细胞是胃肠基本电节律（ｂａｓｉｃｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｈｙｔｈｍ，ＢＥＲ）的起搏者，其突起形成的网络可传播ＢＥＲ；ＩＣＣｓ样细胞尚作为壁内神经信息向平滑肌传送的中转站，并对有关信号起整合作
用，尤其在调节一氧化氮（Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）依赖性的神经递质方面起重要的作用【２Ｊ。ＩＣＣｓ
样细胞结构完好、分布及功能正常，对胃肠动力的发生和功能调控至关重要【３ｌ，与一些
胃肠动力紊乱性疾病如先天性巨结肠【４】和假性肠道梗叫５】的发生密切相关。这种间质细胞特异性地表达虹受体酪氨酸激酶。
Ｃ—Ｋｉｔ为一种原癌基因，其编码产物ＫＩＴ，是位于细胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受体，
也是干细胞生长因子受体，可表达于造血细胞、肥大细胞及ＩＣＣｓ样细胞等多种细胞。由于平滑肌细胞、神经纤维和成纤维细胞不表达ＫＩＴ，ＫＩＴ免疫组织化学染色是在光镜水平鉴别胃肠道和泌尿道ＩＣＣｓ样细胞的可靠方法【６】。膀胱平滑肌具有和胃肠道平滑肌相似的、不受神经控制的自发性肌源性兴奋性，ＩＣＣｓ样细胞在胃肠道兴奋起源、动力产生和功能调控方面的重要作用以及泌尿道和胃肠道平滑肌相似的生理特性，让我们联想到该类细胞在泌尿道存在和发挥相似功能的可能性。采用ＫＩＴ免疫组织化学方法，ＫＩＴ阳性、形态与胃肠道ＩＣＣｓ样细胞相似的细胞被证实存在于豚鼠膀胱【＿７１，小鼠【８】、大鼠、猪和牛【９１的上尿路，人的全泌尿道【１０】及兔的尿道【儿】，由于该类细胞是否在泌尿道发挥其在胃肠道一样的功能尚有待进一步证实，泌尿道ＩＣＣｓ样细胞被称为ＩＣＣｓ样细胞以与胃肠道ＩＣＣｓ相区别。ＩＣＣｓ样细胞在膀胱可能起着重要作用。在病理状态下，Ｐｉａｓｅｃｚｎａ等１１２】发现巨膀胱一小结肠一肠道蠕动迟缓综合症（ｍｅｇａｃｙｓｔｉｓ．ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎ
ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｈｙｐｏｐｅｒｉｓｔａｌｓｉｓＳｙｎｄｒｏｍｅ，ＭＭＩＨＳ）患者的膀胱，其ＩＣＣｓ样细胞分布密度明显少于正常对照组，推测ＩＣＣｓ样细胞分布密度减少与ＭＭＩＨＳ患者膀胱排空障碍密切相关。ＫＩＴ受体抑制剂甲磺酸伊马替尼（ＩＭ）可明显抑制ＤＩ患者离体膀胱平滑肌肌条的自发兴奋性，并可提高在体豚鼠膀胱的膀胱容量和膀胱顺应性【ｌ３１，提示ＩＣＣｓ样细胞与膀胱平滑肌兴奋的起源和调控有密切的关系。
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
综上所述，存在于膀胱的ＩＣＣｓ样细胞与膀胱平滑肌肌源性兴奋的起源和调控关系密切，可能就是膀胱的起博细胞。本课题以成年豚鼠为研究对象，在证实ＩＣＣｓ样细胞存在于豚鼠膀胱的基础上，用透射电镜观察成年豚鼠膀胱组织ＩＣＣｓ样细胞的超微结构、分布及其与神经与平滑肌之间的关系，并采用酶消化法，体外得到培养状态下的ＩＣＣｓ样细胞，利用膜片钳技术，在全细胞记录模式下观察其是否具有起博细胞的电流特性，以证明其是否为膀胱的起博细胞。本研究结果对于理解与排尿有关的生理和病理机制都会增加全新的认识，并为临床上治疗某些膀胱动力性疾病（如ＤＩ）提供新的靶点。
２
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
材料与方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
１材料
１．１实验动物：
实验动物均采用健康１￣２个月龄豚鼠，雌雄不限，体重４００．６００９，２０只（新疆石ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ）
河子大学实验动物中心提供）。
１．２主要试剂：
常用试剂２５％戊二醛磷酸二氢钠磷酸氢二钠四氧化锇醋酸铀柠檬酸铅ＤＭＥＭ培养基
ＳＣＦ
Ｖ型胶原酶
兔抗大鼠ＦＩＴＣ标记荧光抗体
ＦＢＳ
大鼠抗小鼠ｃ．ｋｉｔ抗体
ＰＢＳＺＤ７２８８ＨＥＰＥＳ
无水氯化钙
磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰ０４・１２Ｈ２０）
葡萄糖
氢氧化钾
硫酸镁
氯化钾
氯化钠ｍａＣｌ）碳酸氢钠（ＮａＨＣ０３）
盐酸（ＨＣｌ）氢氧化钠
ＥＧＴＡ
ＭｇＣｌ２蔗糖
生产厂家
北京华美生物试剂公司
北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司
Ｓｉｇｍａ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｈｙｃ］ｏｎｅ公司ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｔｏｃｒｉｓ公司Ｓｉｇｍａ公司
上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司
正常豚鼠膀胱ｃａｊａｌ样间质细胞形态、机能学研究
１．３主要仪器设备：
主要仪器Ｈ．６００透射电镜
生产厂家日本光电
湖北恒丰医疗器械有限公司北京赛多利斯天平厂
上海南汇电讯器械厂
ＹＬＤ．２０００型电热恒温干燥箱ＢＳ．２０１Ｓ电子精密天平
７９１型磁力搅拌器ＴＹＫ．４０２１型超纯水机
乌鲁木齐超纯水机厂
上海浦东金环医疗用品有限公司苏州安泰空气技术有限公司
Ｆｏｒｍａ公司奥林巴斯公司
手术器械
ＳＷ．ＣＪ．２ＦＤ超净工作台
Ｓ／Ｎ２７７０９．１４６２
Ｃ０２培养箱
Ｉ＂７１倒置显微镜
Ａｎｋｅ．ＴＤＬ．４０Ｂ低温离心机Ｓ／Ｎ高压消毒锅ＧＩＬＳＯＮ移液管离心管
上海安亭医疗器械厂
日本三洋公司国产国产
培养瓶
玻璃微电极拉制仪９５．Ｂ倒置显微镜ＸＤ．１０１—２Ｂ
膜片钳放大器ＣＥＺ．２４００三维微操纵器ＭＰ．１
国产
华中科技大南京江南光电厂
日本光电厂
日本光电厂国产
医用内窥镜冷光源
膜片钳软件ＩＢＢｃｌａｍｐ
华中科技大
１．４常用试剂配制：
（１）缓冲液的配制
①磷酸缓冲液（０．２Ｍ）的配制方法如下：
甲液：Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２０
加蒸馏水溶解成
乙液：ＮａＨ２Ｐ０４．２Ｈ２０
加蒸馏水溶解成
７１．６４９
１０００ｍｌ
３１．２１９
１０００ｍｌ
②按如下混合甲、乙两液即得所需ＰＨ的磷酸缓冲液０．２Ｍ的磷酸缓冲液的配制（５０ｍ１）
ＰＨ
６．４１３．３
６．６１８．８３１．２
６．８２４．５２５．５
７．０３０．５１９．５
７．２３６．０１４．０
７．４４０．５９．５
甲液（ｍ１）
乙液（ｍ１）３６．７
（２）常用固定液的配制
Ｏ．１Ｍ磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为２５％的水溶液）
４
正常豚鼠膀胱ｃａｊａｌ样问质细胞形态、机能学研究
０．ＩＭ磷酸缓冲戊二醛的配制
戊二醛最终浓度（％）１．００．２Ｍ磷酸缓冲液（ｍ１）５０２５％戊二醛水溶液（ｍ１）４
双蒸水加至（ｍ１）
１００
１．５５０６１００
２．０５０８１００
２．５５０１０１００
３．０５０１２１００
４．０５０１６
５．０５０２０１００
１００
（３）０．０１ＭＰＢＳ（ＰＨ７．４）：取２０００ｒａｌ重蒸水于烧杯中，加一包ＰＢＳ干粉充分溶解，
测试ＰＨ７．４左右，分装于２个５００ｍｌ瓶中。
（４）Ｉ％ＢＳＡ６０ｍｇＢＳＡ，加６ｍｌ０．０１ＭＰＢＳ充分溶解。
（５）ＤＭＥＭ细胞培养液：ＤＭＥＭ粉１３．４９溶于９００ｍｌ去离子水中，加入碳酸氢钠３．０９，谷氨酰胺Ｏ．５９，ＨＥＰＥＳｌ．５９，加入青霉素，链霉素使其终浓度为ｌＯＯｕ／ｍｌ，补足容积１０００ｍｌ，抽滤除菌，分装成８０ｍｌ／瓶，使用时每瓶加入２０ｍｌ的胎牛血清和２５ｎｇ
的ＳＣＦ。
（６）Ｏ．１％胶原酶Ｐ液：将ｌＯＯｍｇ胶原酶Ｐ溶于ｌＯＯｍｌ无血清ＤＭＥＭ细胞培养液中，抽滤除菌，分装成１０ｍｌ／瓶，．２０＂Ｃ保存ｏ
（７）Ｈａｎｋｓ液：Ｎａ＋１３０ｍＭ，Ｋ＋５．８ｍＭ，Ｃ１．１３５ｍＭ，Ｈ２Ｐ０４．０．４４ｍＭ，ＨＰ０４２．０．３４ｍＭ，ＨＣ０３－４．１６ｍＭ，Ｓ０４２－０．４ｍＭ，Ｃａ２＋１．８ｍＭ，Ｍ９２＋Ｏ．９ｍＭ，ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ，
葡萄糖１０ｍＭ，蔗糖２．９ｍＭ，ＮａＯＨ调ｐＨ值至７．２—７．４，分装高压灭菌，４＂Ｃ储存待
用。
（８）Ｋ＋电流记录电极液：１３３ｍｍｏｌ／１ＫＣｌ，ｌｍｍｏｌ／１ＭｇＣｌ２，０．５ｒｅｔｏｏｌ／１
１０ｍＭ，ＫＯＨ调ｐＨ值至７．２．７．４。
ＥＧＴＡ，ＨＥＰＥＳ
５
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
２技术路线图
６
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
３方法
３．１豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞电镜标本制备
３．１．１电镜标本制备
（１）颈部脱臼法处死豚鼠，即刻由下腹部正中切口、于膀胱颈处离断取出膀胱，纵行剖开膀胱；
（２）用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液清洗，再将组织黏膜面朝上平铺于滤纸上，
刀片将其切成ｌｌｉｒａｌ３的小块；（双面）
（３）立即放人２％戊二醛固定液中固定；
（４）组织固定后，以Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液冲洗；
（５）１％四氧化锇后固定ｌｈ：
（６）０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液再次冲洗，在丙酮中梯度脱水；
（７）环氧树脂包埋，制成半薄切片定位；
（８）超薄切片醋酸铀．柠檬酸铅双重电了染色后。
３．１．２置透射电镜下观察
３．２豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的分离、培养及其鉴定
３．２．１原代成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的分离培养
（１）原代成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和平滑肌细胞的分离
①颈部脱臼法处死成年豚鼠，无菌条件下切取膀胱，置于含双抗（青霉素１００Ｕ／ｍＬ和链霉素１００９“／ｍＬ）的０．０１ＭＰＢＳ溶液中浸泡１０ｍｉｎ：
②室温下，无菌操作台上在０．０１ＭＰＢＳ溶液中将膀胱剪成１ｍｍ３小块；
③在含双抗的０．０１ＭＰＢＳ溶液中漂洗２次；
④换入ｌｍｇ／ｍＬ胶原酶Ｖ溶液（Ｓｉｇｍａ公司），盖紧瓶盖，置入３７＂Ｃ培养箱中消化３０ｍｉｎ；
（２）原代成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和平滑肌细胞的培养
①将消化好的絮状肌条液转移至消毒离心管中，１１０．２５０ｘｇ离心１分钟。去除上清液，重复３次，去除残余的酶及可能污染的细菌；
②轻轻吹打分散组织细胞片，转入３５ｍｍ培养瓶中，瓶内加入适量ＤＭＥＭ培养液，盖好瓶盖，于３７℃、５％Ｃ０２下培养：
③细胞接种后３个小时，可见胞体为梭形并有两个细胞突起的细胞贴壁，平滑肌细胞尚未贴壁。将未贴壁的平滑肌细胞转移至另一培养瓶，孵箱内静置３天后，可见平滑肌细胞贴壁。
（３）膀胱逼尿肌细胞的传代培养
①当逼尿肌细胞７０％．８０％细胞融合贴壁后，可消化传代；
②将培养瓶用无钙镁磷酸盐缓冲液漂洗３次；
④加入０．２％的胰蛋白酶消化液，保留１分钟，然后倒去消化酶液；⑤按常规方法，消化细胞，加入培养基，用细玻璃吸管轻轻反复吹打细胞，使之
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
分散成单细胞悬液；
⑥根据细胞密度，将单细胞悬液分置到２．３个新培养瓶中，分别补足培养液，置于３７℃、５％Ｃ０２下培养，传代完成。
３．２．２培养膀胱ＩＣＣｓ样细胞和平滑肌细胞的鉴定
３．２．２．１培养膀胱ＩＣＣｓ样细胞的鉴定
（１）细胞形态学鉴定：
根据ＩＣＣｓ样细胞的形态特点，相差显微镜常规观察细胞牛长形态及生长规律。
（２）免疫组织化学鉴定：
用特异性ＫＩＴ抗体（工作浓度为１：１００，购自Ｅｂｉｏｓｃｉｃｎｃｅ公司）进行免疫组织化学鉴定。主要步骤如下：６孔培养板孔中放入盖玻片，原代细胞接种于其上，当细胞贴壁后，行免疫组化染色：
①细胞爬片取出后０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
②１００％丙酮室温下固定ｌＯｍｉｎ，风干后同上清洗；
③０．０３％Ｈ２０２／甲醇封闭内源性过氧化物酶２０ｍｉｎ（２５℃）；
④０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
⑤Ｉ％ＢＳＡ室温下孵育３０ｍｉｎ：
⑥弃去多余孵育液，滴加０．２％ＢＳＡ／０．０１ＭＰＢＳ稀释的第一抗体（大鼠抗小鼠的单克隆ＫＩＴ抗体，１：１００，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司），湿盒内孵育２ｈ（室温），后４＂Ｃ
⑦０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
＠ＦＩＴＣ标记荧光抗体（１：１００，Ｓｉｇｍａ公司）室温孵育６０ｍｉｎ：
⑨０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
⑩将盖玻片反转，用７５％甘油封于载玻片上，荧光显微镜下观察。
对照实验以正常鼠血清代替一抗，或兔血清代替二抗，结果均为阴性。选取豚鼠肠壁切片作为阳性对照，染色方法同上。
３．２．２．２培养膀胱逼尿肌细胞的鉴定
（１）细胞形态学鉴定：４８ｈ：
根据逼尿肌细胞的形态特点，相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律。
（２）免疫组织化学鉴定：
用特异性ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ抗体（工作浓度为１：１００，Ｓｉｇｍａ公司）进行免疫组织化学鉴定。主要步骤同上，用ＣＹ３标记抗体（１：１００，Ｓｉｇｍａ公司）代替上述第二抗体。对照实验以正常鼠血清代替一抗，或兔血清代替二抗，结果均为阴性。选取豚鼠肠壁切片作为阳性对照，染色方法同上。
３．３豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的膜片钳实验
３．３．１微电极拉制
（１）材料准备：
厚壁有芯玻璃毛管（华中科大仪博生命科学仪器有限公司）。两端烧制圆滑。８
正常豚鼠膀胱ｅａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
（２）微电极拉制步骤：
垂直式拉制仪一步法拉制，ＨＥＡＴ值５８．４，拉制后微电极直径约ｌｇｍ。
３．３．２膜片钳实验程序【”Ｊ：
３．３．２．１具体操作步骤：
（１）将玻片取出置于细胞浴池中，含有５％０２的ＨＡＮＫｓ液持续灌流以维持细胞活性；
（２）微电极经０．２２９ｉｎ过滤器灌注电极液达全长的ｌ／３处，排尽气泡；
（３）将膜片微电极插入探头，腔内施以正压，然后将电极浸入浴液，以防止浴液气液面上积集的灰尘或溶液中的粒子附着在电极尖端而妨碍巨阻抗封接的形成，边将之驱除，边使电极接近细胞（图１）：
（４）运行ｐＣＬＡＭＰ９．０软件，产生一频率为１Ｈｚ，幅度为．１０ｍＶ，波宽为１０ｍｓ，时程为２５ｍｓ的方波脉冲；
（５）从示波器上监视电极阻抗，一般来说，电极电阻为４．６ＭＯ、封接电阻＞ＩＧＯ较为合适，如达不到要求，则需重新更换一根膜片电极；
（６）巨阻抗封接：从示波器监视电极阻抗、封接程度和瞬时电容电流补偿情况（图２）ｔ①首先确认微电极尖端轻触到细胞表面，此时可发现应变电流变小，根据电极尖端直径估算细胞大小。调节“电极失调控制”，消除液结电位。
②去除电极腔内正压，用注射器或口吸给微电极腔内施加负压（．１０．３０ｅｍＨ２０），如果在监视器上看到应变电流突然为零，电流噪声也随之减少，则提示将要形成巨阻抗封接。
③获得巨阻抗封接（封接电阻＞ＩＧＯ）后，则可去除负压，如稍等待一些时间巨阻抗封接仍不能形成，则需重新更换一根膜片电极（因为一旦接触到细胞表面的电极即不能再用），按上述步骤重新操作。
（７）调节膜片钳放大器的快电容电位补偿旋钮，抵消电极电容；
（８）破膜：在细胞吸附状态下，施加负压吸７１（．３０＂－＇２００ｃｒｎＨ２０）破坏膜片，或用大电流（＜２０ｎＡ）给予高电压电击以离断膜片，获得全细胞模式（ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌｌｍｏｄｅ）；
（９）调节膜片钳放大器的慢电容电位补偿旋钮，抵消膜电容；
⑩补偿电极电容、膜电容后，稳定５－－－１０ｍｉｎ，运行ｐＣＬＡＭＰ９．０，进行实验。
３．２．２．２超级化激活的内向电流（１１１）记录
微电极内灌充Ｋ＋电流记录电极液，选择电压钳模式，输出各类刺激信号。设置钳制电压（ＨＰ）为．６０ｍＶ；检测电压（ＴＰ）每步阶跃１０ｍＶ，从．１５０ｍＶ均跳至．４０ｍＶ，根据实验要求进行改变；时程５００ｍｓ：刺激脉冲刺激间隔５ｓ；实验温度２１℃。
３．２．２．３不同浓度ＺＤ７２８８对ＩＣＣｓ样细胞ｍ的影响
微电极内灌充Ｋ＋电流记录电极液，选择电压钳模式，设置钳制电压（ＨＰ）为一１５０ｍＶ，细胞浴池液中ＺＤ７２８８浓度分别为５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，记录ｍ，实验温度２ｌ℃。
耋口木结果
（Ｒｅｓｕｌｔｓ）
ｌ豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞超微结构及其与周围组织关系的电镜观察
１．１ＩＣＣｓ样细胞的形态特点
豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和周围平滑肌细胞有明显不同的形态特征，平滑肌细胞排列整齐．有肌原纤维肌、胞体和丰的富细胞器，线粒体的嵴较多。成年豚鼠膀胱组织ＩＣＣｓ样细胞胞体为梭形，在细胞两极有两个细长突起，有丰富的沿细胞膜分布的膜下小空腔，有较完整的基膜，有电子致密度高的巨大卵圆形核，占细胞大部分，核周胞质少．胞质内线粒体非常丰富，常紧密排列在胞浆里，游离核糖体与多聚核糖体多见，可见到发达的粗面内质网、滑面内质网、高尔基体（图３）。ＩＣＣｓ样细胞与其它的ＩＣＣｓ样细胞之问、ＩＣＣｓ样细胞与平滑肌细胞和神经细胞之间多见由紧密并置的质膜形成的缝隙连接（图４）。
１．２ＩＣＣｓ样细胞的分布特点
豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞主要位于黏膜下区域，逼尿肌平滑肌肌束边缘和肌束间的组织间隙【ｌ６。，并呈星形网状分布。黏膜下层分布多于肌层，膀胱体多于其他部位，这种分布与其收缩功能密切相关。ＩＣＣｓ样细胞突触之间相互连接形成网络状结构，也和平滑肌细胞形成紧密关系。
１．３ＩＣＣｓ样细胞与周围组织的关系
ＩＣＣｓ样细胞往往与神经纤维末梢及神经束伴随存在，并由许多的缝隙连接紧密连接在一起【１７】，粘膜下、肌间ＩＣＣｓ样细胞与神经系统关系最为密切，其突起通常穿过肌层围绕神经纤维，其胞质突起绕神经束形成完整的“鞘”样结构（图５．６）。ＩＣＣｓ样细胞突起之间相互连接形成网络，分布均匀。ＩＣＣｓ样细胞胞体与平滑肌细胞平行相随，也和平滑肌细胞形成紧密缝隙连接。
２分离、培养后的豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的鉴定
２．１原代ＩＣＣｓ样细胞培养及细胞特征鉴定：
（１）细胞生长形态
培养细胞置于倒置显微镜下观察，培养３ｈ后细胞已开始贴附在瓶底，胞体为梭形，细胞两极有２个细长突起（图７）。细胞增殖能力较弱，培养一周细胞数目无明显增加。
（２）免疫组化鉴定
ＩＣＣｓ样细胞爬片ＫＩＴ免疫组化染色为阳性（图９），ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ染色阴性（图ｌｏ）。２．２原代膀胱逼尿肌培养及细胞特征鉴定：
（１）细胞生长形态
培养细胞置于倒置显微镜下观察，培养２４ｈ后细胞已开始贴附在瓶底，呈成纤维形或短棒状，４．５天后可观察到肌细胞融合现象，大约７天时间可覆盖培养瓶底部７５％．８０％以上（图８），此时可以进行细胞传代。
（２）免疫组化鉴定
逼尿肌细胞爬片ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ免疫组化染色阳性（图１１），ＫＩＴ染色阴性（图１２）。
３膜片钳下豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的特性电流记录
３．１全细胞模式下ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流
（１）ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流
被检测的ＩＣＣｓ样细胞均可记录到ｍ电流（ｎ＝１６）。激活电压．５０ｍｖ，呈电压依赖性（图１３）。
（２）当浴池中加入ｍ通道特异阻滞剂ＺＤ７２８８时，发现其幅度明显减小，并呈剂量依赖性（图１４）。
３．２全细胞模式下逼尿肌细胞ｍ电流
相同条件下被检测的逼尿肌细胞中记录不到ｍ电流。
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图１３：全细胞模式下ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流
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图１４：ＪＪＨ入Ｉｌｌ特异性阻滞剂Ⅱｌ电流明显减小
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讨论
（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）
１豚鼠膀胱ＩＣｅｓ样细胞超微结构及其与周围组织的关系
１．１Ｉｃｅｓ样细胞的功能
大量研究显示，一方面Ｉｃｅｓ样细胞是产生慢波活动，是膀胱运动的始动者，其突起形成的网络及肌间的缝隙连接可传播兴奋；另一方面ＩＣｅｓ样细胞尚作为神经信息向平滑肌传递的中转站，并对信号起整合作用。试验证明，当膀胱ＩＣｅｓ样细胞被拟胆碱药物或ＡＴＰ刺激时，神经递质产生应答，而用美兰对标本染色并将其暴露于光照下，选择性的破坏粘膜下ｉｃｅｓ样细胞的时候，可引起慢波消失【ｌ引，这证实在产生慢波的过程中ＩＣｅｓ样细胞起到了关键性的作用，慢波活动对平滑肌细胞的收缩功能起到制约、限制的作用，ＩＣＣｓ样细胞是产生慢波的细胞【１９】，这也有助于证明ＩＣＣｓ样细胞有膀胱运动起搏的功能；与神经细胞及平滑肌细胞缝隙连接丰富是ＩＣｅｓ样细胞的显著结构特点，反映了ＩＣｅｓ样细胞传递、整合信号的主要功能特点【２０１。因此应该说ＩＣＣｓ样细胞结构完好、分布及功能正常，对膀胱收缩功能调控至关重要，ＩＣＣｓ样细胞相互之间、与神经、平滑肌细胞之间的缝隙连接以及ＩＣｅｓ样细胞的超微结构与膀胱其运动功能相适应。
１．２ＩＣＣｓ样细胞超微结构与其功能的关系
ＩＣｅｓ样细胞的超微结构及其与周围组织的关系也与其运动中介的功能相适应：ＩＣｅｓ样细胞有丰富的线粒体，这说明其功能活跃，适应其作为膀胱慢波起搏细胞的需要；ＩＣｅｓ样细胞与ＩＣｅｓ样细胞之间、ＩＣＣｓ样细胞与平滑肌细胞之间、ＩＣｅｓ样细胞与神经细胞之间以及平滑肌之间形成很多的缝隙连接，这种结构特点适应ＩＣｅｓ样细胞在膀胱运动中起传递、整合信号的功能；滑面内质网、粗面内质网和高尔基体丰富，说明其具有活跃的合成功能。
１．３ｉｃｅｓ样细胞与疾病的关系
很多膀胱动力障碍性疾病还未发现明显的器质性病变，主要表现为膀胱舒缩功能的变化，结合ｉｃｅｓ样细胞的功能特点，我们可以认为在这类疾病中ＩＣＣｓ样细胞的功能与分布的变化可能是一重要的发病因素。最近的一些研究显示，膀胱ＩＣＣｓ样细胞可能与膀胱动力障碍性疾病有关。如许多ＩＣＣｓ样细胞胞在正常人的膀胱中被发现，但在巨膀胱－小结肠．肠蠕动迟缓综合征患者（ｍｅｇａｃｙｓｔｉ－ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎ—ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｈｙｐｏｐｃｒｉｓｔａｌｓｉｓｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＭＭＩＨＳ）的膀胱中ＩＣＣｓ样细胞却明显减少，提示膀胱ＩＣｅｓ样细胞的缺乏，可能影响了膀胱中平滑肌细胞间的信息传递、神经传递及自发性电活动的产生，而这些就可能导致ＭＭＩＨＳ的膀胱出现排泄功能障碍【２¨。进一步应对多种膀胱功能紊乱性疾病的ＩＣＣｓ样细胞的结构、分布的变化进行研究，以达到明确该类疾病发病机制的目的。２豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的分离、培养及其鉴定
２．１原代豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的培养
２．１．１培养方法膀胱ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的原代培养有酶消化法和组织块贴壁培养法两种。
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前者的优点在于可很快获得大量活细胞，原代培养出细胞的效率较高，主要有胰蛋白酶法和胶原酶法两种。胰蛋白酶是目前应用最多的消化试剂，适用于消化细胞间质较少的软组织，如脑组织等。而胶原酶对胶原的消化作用很强，它仪对细胞间质有消化作用，因此适于消化分离平滑肌组织。尽管该方法操作步骤繁琐、消化酶也较昂贵，实验成本相应较高，但其培养周期短，方便于实验需要，它能够比较干净除去组织表面的内皮细胞【１４１。另外，组织块培养，虽方法简单，花费少，但培养周期长，其成功率也低。
２．１．２ＩＣＣｓ样细胞培养
干细胞因子（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）是ＫＩＴ受体的配体，；由Ｓ１位点的基因编码，是一种糖基化非共价同型二聚体，也称Ｓｔｅｅｌ因子，肥大细胞生长因子等。ＳＣＦ在体内广泛表达，包括：角膜细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，在循环系统中也存在低浓度ＳＣＦ。根据外显子６的存在与否，ｍＲＮＡ分别编码２２０个氨基酸和２４８个氨基酸的两种跨膜ＳＣＦ，被称为膜结合型ＳＣＦ，而后者可迅速发生蛋白裂解，而释放出可溶型ＳＣＦ，前者的裂解速度较慢【２２１。一般认为膜结合型ＳＣＦ在功能上比可溶型ＳＣＦ重要。ＳＣＦ．ＫＩＴ信号通路对ＩＣＣｓ的正常发育、分化有重要的作用。当编码ＫＩＴ蛋白的基因ｃ．ｋｉｔ发生突变时，ＫＩＴ信号途径被阻断，ＩＣＣｓ的发育将出现异常怛３Ｊ：同样编码ＳＣＦ的基因ｓｔｅｅｌ的突变亦可见相似的结果，研究发现在１０号染色体Ｓｔｅｅｌ突变的Ｓ１／Ｓｌｄｄ、鼠，ＳＣＦ合成障碍，导致小肠ＩＣＣｓ明显减少甚至缺如，ＩＣＣｓ的发育、增殖和成熟都需要ＳＣＦ，如果阻断ＳＣＦ．ＫＩＴ通路，将不能分化为成熟的ＩＣＣｓ［２４１。离体实验发现，分离培养的胚胎第１５．１７周小鼠小肠，肌间神经丛周围ＩＣＣｓ细胞（ｍｙｅｎｔｅｒｉｃｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｃｅｌｌｓｏｆＩＣＣｓ，ＩＣ．ＭＹ）网络基本形成，有一定的电节律活动，而加入ＫＩＴ蛋白中和抗体后，ＩＣ．ＭＹ网络断裂，电慢波消失。由此可见，ＫＩＴ／ＳＣＦ信号途径对ＩＣＣｓ的正常发育和功能维持具有非常重要的作用。在本研究中，我们在ＩＣＣｓ样细胞体外培养液中加入浓度为５ｎｇ／ｍｌ的ＳＣＦ，以保证其正常生长和细胞表型表达。
２．１．３逼尿肌细胞培养
逼尿肌细胞是一种平滑肌细胞，影响膀胱逼尿肌细胞培养成功的因素很多，总结我们的经验，以下几点是关键：①取材方法：取材时应平双侧输尿管进入膀胱壁处将膀胱横断，以避免同时取到膀胱底部较多的血管、外膜等组织，于解剖显微镜镜下将外膜仔细剔除。②细胞接种量：接种量一般为２０ｘ１０４／ｍｌ，接种密度以３ｘ１０４／ｃｍ２最为适宜，如细胞接种过少，细胞生长难于铺满瓶壁，直接影响细胞传代。⑧掌握好组织快的消化程度也是成功的关键，组织块应尽量剪碎以利消化，严格控制胶原酶浓度和消化时间，见消化液混浊、组织块呈絮状，或在显微镜下见消化液中有较多单个细胞或细胞小团块时应终止消化。细胞传代培养时也应掌握好消化时间，即当均匀、透亮、没有间隙的薄层变成不透亮，并有间隙出现时，即可终止消化。④由于逼尿肌细胞属于平滑肌细胞，贴壁能力相对弱于其它类型的细胞，因此在培养开始的３天以内，应当绝对静止，避免振动和移动，以免细胞漂浮死亡。
２．２原代培养状态下ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的差别１３
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
２．２．１形态差别
倒置显微镜下，ＩＣＣｓ样细胞在培养状态下的形态和组织切片相似，胞体均为梭形，胞体两极有两个细胞突起。该特点易与培养状态下的逼尿肌细胞相区别。逼尿肌细胞培养状态下呈成纤维样生长，细胞突起不规则。用免疫组织化学方法，可鉴定和区别这两类细胞：ＩＣＣｓ样细胞ＫＩＴ染色阳性，ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ染色阴性；而逼尿肌细胞ＫＩＴ染色阴性，ａ．ＳＭ－Ａｃｔｉｎ染色阳性。
２．２．２增殖情况差别
有研究证明ＩＣＣｓ主要来源于间充质细胞【２５１，在发育过程中出现于消化管壁内后，数量逐渐增加，突起和分支逐渐增多延长，但一般出生以后，这种增殖能力逐渐下降，细胞数量保持相对恒定；胎儿小肠壁内ＩＣＣｓ在妊娠９～１２周出现后，数量随胎龄增加而增多，突起逐渐延长，至胚胎中晚期ＩＣＣｓ彼此间形成完整的细胞网络【２６１。Ｋｌｕｐｐｅｌ报告小鼠ＩＣＣｓ在胚胎第１２一１４周出现，随后ＩＣＣｓ逐渐增多，分别构成ＩＣ．ＭＹ和粘膜下的ＩＣＣｓ细胞细胞群，出生后数日内ＩＣＣｓ的数量可迅速增加到出生时的３倍以上。体外培养研究也表明，在ＳＣＦ存在下，小鼠胚胎第１８周和出生后第２周的ＩＣＣｓ具有增殖能力，且在一定范围内与ＳＣＦ的浓度呈正相关，但小鼠出生后第６周的ＩＣＣｓ体外培养未见增剃２７】。以上结果提示在胚胎发育阶段，ＩＣＣｓ具有一定的增殖能力，细胞突起亦能生长延长，而成体ＩＣＣｓ似乎不具有增殖能力。本实验研究发现成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞在原代培养状态下的增殖情况与胃肠道ＩＣＣｓ相同，培养７天，细胞数目无明显增加；而相同培养条件下的逼尿肌细胞增殖速度明显快于ＩＣＣｓ样细胞，约７天以后即可传代。
２．３ＩＣＣｓ样细胞的纯化
成年豚鼠膀胱中ＩＣＣｓ样细胞分布密度明显小于逼尿肌细胞。若不将两种细胞分离，混合培养时，由于逼尿肌细胞的优势生长，培养一定时间后ＩＣＣｓ样细胞将死亡。国外报道采用免疫磁珠分选法，分离、纯化后得到培养状态下的肠道ＩＣＣｓ纯度高、细胞数目多，可提供充足的细胞用于ＲＴ－ＰＣＲ实验、大规模的基因学研究以及ＩＣＣｓ网络的功能分析。本部分实验的目的在于建立成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的原代培养方法，为下一步部分的膜片钳实验提供目的细胞。实验中发现由于逼尿肌细胞属于平滑肌细胞，贴壁能力相对弱于其它类型的细胞（接种后２４小时）；而ＩＣＣｓ样细胞贴壁能力明显强于逼尿肌细胞（接种后３小时即可贴壁）。利用培养初期两种细胞贴壁能力的差异，在混合培养中，ＩＣＣｓ样细胞贴壁后将尚未贴壁、漂浮的平滑肌细胞转移至另一培养瓶中，在培养初期即可分离两种细胞，分别得到相对纯化的ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞。单独培养的ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞均可用于行膜片钳实验。与免疫磁珠分选法相比，实验步骤更为简单和经济。
３豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的电流特性研究
３．１起搏细胞的电生理特征
可产生自发性动作电位（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＳＡＰ）是起搏细胞区别于其他可１４
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样问质细胞形态、机能学研究
兴奋细胞的基本特征。ＳＡＰ通过细胞间的传导系统（在心脏，传递兴奋的丰要结构是闰盘；在胃肠道和输尿管，传递兴奋的丰要结构是缝隙连接）传递到周围的可兴奋细胞，使其产牛动作电位（ａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＡＰ）。在不予任何刺激的情况下，可产生ＳＡＰ是证明起搏细胞的最直接证据。起搏细胞的ＳＡＰ与其他可兴奋细胞ＡＰ的不同之处在于ＳＡＰ存在独特的４期自动去极化。众多研究已证实，超级化激活的内向电流（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ａｃｔｉｖａｔｅｄｉｎｗａｒｄｃｕｒｒｅｎｔ．Ｉｈ）是产生ＳＡＰ４期自动去极化的离子基础，是起搏细胞的特征电流【２引。
３．１．１ｍ概述：
１１１是指在膜片钳全细胞记录模式下，细胞膜钳制电位向超级化阶跃时，所记录到的内向电流。它于１９７９年首先被发现存在于兔心脏的窦房结细胞，由于其被激活方式与其他电流不同，Ｂｒｏｗｎ等称其为“ｆｕｎｎｙｃｕｒｒｅｎｔ”，简称Ｉ一２９】。随后在中枢和外周神元等其他可产生自发性兴奋性的细胞中也记录到了这种电流，为与心脏相区别，存在于心脏外其他组织的超级化内向电流被称为“ｑｕｅｅｒｃｕｒｒｅｎｔ”，简称ＩＱ［３０】。超级化激活的内向电流特征：１．由超级化激活，呈电压依赖性；２．由慢开慢关的电流组成。对ｍ的深入研究结果提示该电流对胃肠道ＩＣＣｓ、窦房结、普肯野氏纤维、神经元等细胞的兴奋起源和频率调控起着极其重要的作用。
３．１．２１１ｌ是起搏细胞的特征电流
①ＩＯ是胃肠道ＩＣＣｓ细胞、中枢及外周可记录到该电流的神经细胞的起搏电流，新鲜分离的小鼠小肠【３１】和狗近端结肠【３２】的ＩＣＣｓ均可记录到ＩＱ，细胞浴池液中加入３０ｍＭＺＤ７２２８选择性阻断ＩＱ后，ＩＣＣｓ的自发性动作电位消失，提示该电流为ＩＣＣｓ的起搏电流。丘脑皮层传播神经元，在缺少突触输入的情况下，仍可产生自发性节律性动作电位。该动作电位的上升支由Ｌ型Ｃａ电流组成，在动作电位的下降支，膜电位复极化到Ｌ型Ｃａ通道失活电压的时候，ＩＱ使细胞膜产生一缓慢的起博去极化，再次激活Ｌ型Ｃａ通道，引发下一次动作电位【３３】。脑干的下橄榄核神经元自发性动作电位产生机理与丘脑皮层传播神经元相同瞰ｌ。因此ＩＱ是上述两种神经元产生自发性动作电位的基础电流，选择性阻断ＩＱ将使得这些神经元的起博活动完全消失。
②Ｉｆ与心脏起搏，Ｉｆ发现以前，一种外向延迟钾电流（ｔｈｅｄｅｃａｙｏｆｔｈｅｄｅｃａｙｅｄＫｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）被认为是导致窦房结细胞舒张期自动去极化的主要电流【３习（１９５１年一１９７８年）。支持该理论的依据为：（１）该电流在膜电位去极化时激活，激活电压在窦房结细胞舒张期电压范围之内；（２）该电流反转电位与钾离子平衡电位相近；（３）该电流受儿茶酚胺调节，与交感神经刺激引起的心率加快有关。然而，７０年代末Ｉｆ的发现及后继相关研究表明上述理论是完全错误的。与以前理论相反，窦房结的起博电流并不是以前所认为的去极化激活的外向电流，而是超级化激活的内向电流【３６】；之前所记录到的外向电流是超级化激活的内向电流的补偿电流（内向电流引发的钾离子外流）ｐ１７１。Ｉｆ是是心脏窦房结起博电流的证据（图３－－９）：（１）Ｉｆ激活电压在舒张期电压范围之内【３８１；（２）在成年哺乳动物的心脏，表达Ｉｆ的窦房结和房室结细胞有自发性博动，不表达Ｉｆ的心房和心室１５
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肌细胞无自发性博动【３９】；（３）在新生哺乳动物心脏的发育早期，Ｉｆ存在于心室肌细胞，此时心室肌细胞可记录到自发性动作电位；在发育成熟以后，Ｉｆ与自发性动作电位同时消失ｍ】。Ｉｆ在心脏窦房结自发性动作电位产生中的作用示意图Ｉｆ不仅对于心脏起博是必不可少的，它在交感和副交感神经的支配Ｉｆ不仪对于心脏起博是必不可少的，它在交感和副交感神经的支配下，通过细胞内ｃＡＭＰ途径介导的信号传导，可调控心脏的博动频率。在副交感神经的作用下，激活曲线向左移，减慢心率；在交感神经的作用下，激活曲线向右移，增加心率【４１１。早期关于心率调控的研究结果提示乙酰胆碱激活的钾电流（ＩＫ，Ａｃｈ）是胆碱能受体激活后减慢心率的主要机制。Ｉｆ同样受胆碱能神经支配，因此Ｉｆ也参与了胆碱能受体激活后心率减慢的过程【４２】。由于抑制Ｉｆ所需的乙酰胆碱浓度仅为抑制ＩＫ，Ａｃｈ所需浓度的１／２０，Ｉｆ被认为在该过程中起着主导作用。因为在不能产生自发性动作电位的组织记录不到ｍ，Ⅱｌ被认为是起博细胞的特征电流（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｃｅｍａｋｅｒｃｕｒｒｅｎｔ）
３．２成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流的记录
３．２．１电流特性研究应以新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞为研究对象
细胞的体外培养是单独研究细胞功能所常用的一种实验方法。但细胞在体外条件下生长，由于外环境的改变，培养时间过长或经过传代以后，其细胞特性将发生变化。对比研究胃肠道新鲜分离（贴壁后不久）和培养三天以后的ＩＣＣｓ表面膜抗原，发现后者ＫＩＴ、ａ．ＳＭ．Ａｃｆｉｎ和ＩＩ型血管活性肠肽受体（ＶＩＰ．２）染色均为阳性，而新鲜分离的ＩＣＣｓ仅ＫＩＴ染色为阳性，提示ＩＣＣｓ在体外长时间的培养过程中，其胞膜表面分子标记物将发生变化【４３１。在第二部分实验中我们对新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞行ＫＩＴ和ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ染色，提示用于膜片钳实验的新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞ＫＩＴ染色阳性，ａ－ＳＭ—Ａｃｔｉｎ染色为阴性。对新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞的电流特性研究结果可代表其在体情况。
３．２．２．ＩＣＣｓ样细胞在成年豚鼠膀胱可能具有起博功能
本实验在电流钳模式下，ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞均未记录到自发性动作电位产生，其原因可能是膜片钳实验温度（２１℃）难以达到在体温度（３７℃）。理论上，离体实验条件应尽可能模拟在体情况，但随着实验温度的升高，全细胞模式下，细胞封接难度会大大增加，实验温度在３７℃时，细胞几乎难以形成巨阻封接。这就造成了本身具有产生ＳＡＰ能力的细胞在体外有时记录不到电位的自发性去极化。超级化激活的内向电流是起博细胞的特征电流，使得ｍ成为证实细胞具有起博功能的另一间接证据。本实验发现ＩＣＣｓ样细胞具有ｍ，而在相同模式下逼尿肌细胞无ｍ产生；Ｉｈ特异性阻断剂ＺＤ７２８８１４４Ｊ对ＩＣＣｓ样细胞ｍ有明显抑制作用，并呈剂量依赖性。ＩＣＣｓ样细胞存在有ｍ提示该类细胞在成年豚鼠膀胱可能具有起博作用。
３．３ＩＣＣｓ样细胞可成为临床治疗某些膀胱功能障碍性疾病的新靶点
本研究首次发现在膀胱的ＩＣＣｓ样细胞存在有起博特征电流，ＩＣＣｓ样细胞可能就是理论上存在于膀胱的起博细胞。膀胱逼尿肌具有神经源性和肌源性兴奋性，对于肌源性兴奋性理论中的重要组成部分一一膀胱起搏理论的认识和深入了解，具有重大的理论和
摘要
目的：本课题以正常成年豚鼠为研究对象，通过对膀胱组织内Ｃａｊａｌ样间质细胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｃｅｌｌｓｏｆ
Ｃａｊａｌ，ＩＣＣｓ）超微结构及其与周围组织关系进行观察；对体外培养的ＩＣＣｓ样细胞进行电生理学特性研究，探讨其是否为膀胱的起博细胞，为临床上治疗某些疾病（如ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）提供新的切
入点。
友法：本实验运用透射电镜观察正常成年豚鼠膀胱组织ＩＣＣｓ样细胞的超微结构及其与周围组织关系；采用酶消化法，得到体外培养状态下的ＩＣＣｓ样细胞，并运用膜片钳技术，在全细胞记录模式下
观察其是否具有起博细胞的电流特性，以验证其是否为膀胱的起博细胞。
缝墨！透射电镜观察到ＩＣＣｓ样细胞具有样细胞有丰富的线粒体，发达的粗面内质网、滑面内质网、
高尔基体，ＩＣＣｓ样细胞与其它的ＩＣＣｓ样细胞之问、ＩＣＣｓ样细胞与平滑肌细胞和神经细胞之间多见
由紧密并置的质膜形成的缝隙连接；膜片钳试验记录到成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞具有起搏细胞的特
征电流ｎｌ电流，并且起搏电流特异性阻断剂ＺＤ７２８８对ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流有明显抑制作用，并
呈剂量依赖性。
结论：电镜观察到ＩＣＣｓ样细胞具有独特的超微结构，其与膀胱神经与平滑肌之间的解剖与结构上的
特殊关系可能是ＩＣＣｓ样细胞调节膀胱动力功能的基础；及记录到成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞具有起
搏细胞的特征电流ｍ，特异性阻断剂ＺＤ７２８８对ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流有明显抑制作用，并呈剂量依
赖性。提示ＩＣＣｓ样细胞在膀胱可能起着起搏作用。
关键词：ＩＣＣｓ样细胞，ＫＩＴ蛋白，超微结构，Ｉｌｌ电流论文类型：Ａ（基础研究）
Ａｂｓｔｒａｃｔ
．Ｐｕｒｐｏｓｅ：Ｔｈｉｓｓｕｂｊｅｃｔｓｔｕｄｙｔｈｅｃａｊａｌ－ｌｉｋｅｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｃｅｌｌｓ（ＩＣｅｓ）ｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒ．Ｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｗｅｏｂｓｅｒｖｅ
ＩＣＣｓｕｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｒｅｃｏｒｄＩＣＣｓ
ａ
ｏｆＩＣＣｓｗｉｔｈｔｈｅ
ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ
ｂｙｐｉｇ
ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｂｙ
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｗｅ
ｐｒｏｖｉｄｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｅｌｅｃｔｒｉｃｃｕｒｒｅｎｔ
ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐａｔｃｈｃｌａｍｐｔｅｓｔ．ＩｎｔｈｉｓｓｕｂｊｅｃｔＣａｎ
ｐｒｏｏｆ
ｔｏ
ｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａ
ｂｌａｄｄｅｒｉｓｔｈｅｐａｃｅｍａｋｅｒ．ＩｔＣａｎｏｆｆｅｒｔｈｅｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）．
ａ
ｎｅｗｓｔａｒｔｉｎｇｐｏｉｎｔｌｉｎｉｃａｌａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｅｒｔａｉｎｄｉｓｅａｓｅｓ（ｓｕｃｈａｓ
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｎ
ｔｈｉｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｗｅｏｂｓｅｒｖｅＩＣＣｓｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｏｆＩＣＣｓｗｉｔｈｔｈｅ
ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＢｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｐａｔｃｈｃｌａｍｐｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷｅｏｂｓｅｒｖｅｃｕｒｒｅｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＩＣＣｓｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅ．ｅｅｌｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇｍｏｄｅ．ＩｔＣａｎ
ｐｒｏｖｉｄｅ
ａ
ｐｒｏｏｆｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈａｔｔｈｅＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｉｓｔｈｅ
ｔｏ
ｐａｃｅｍａｋｅｒ．
ｊｕｎｃｔｉｏｎｉｎ
ｎｅＩ＇ｖｅ
Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＩｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｈｅＩＣＣｓＣａｎｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｔｈｅｓｌｉｄｉｎｇｓｕｒｆａｃｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，Ｇｏｒｋｙ
ｈａｖｅｒｉｃｈｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ。ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｈｅＲＥＲ．
ａ
ｂｏｄｙ．Ｉｔｅｘｉｓｔ
ａｎｄ
ｇｒｅａｔｄｅａｌｏｆｔｈｅｇａｐ
ＩＣＣｓ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍ
ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅＩＣＣｓａｓｋｅｄ，ＩＣＣｓ．１ｉｋｅｃｅｌｌｓＡｎｄｔｈｅｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓａｎｄ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ
ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ
ｐａｔｃｈ
ｃｌａｍｐ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｗｅｏｂｓｅｒｖｅｃｕｒｒｅｎｔ
ａｒｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＩＣＣｓｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅ．ｅｅｌｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇ
ｂｙｐａｃｉｎｇＢｌｏｃｋｉｎｇａｇｅｎｔＺＤ７２８８ｉｎ
ａ
ｍｏｄｅ．ａｎｄｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｄｏｓｅ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．
ａ
ｏｆｔｈｅＩＣＣｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ
ａｎｄｔｈｅ
ＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｈａｖｅ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａ
ｐｉｇｂｌａｄｄｅｒ
ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｉｓｔｈｅｓｐｅｃｉａｌ
ｂｌａｄｄｅｒｗｉｔｈｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｎｄｎｅｒｖｅｉｎｔｈｅａｎａｔｏｍｙ
ｕｎｉｑｕｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｎｅ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｓｐｅｃｉａｌｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐＩＣＣｓｉｎｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｍａｙｂｅｔｈｅ
ｄｙｎａｍｉｃ
ａ
ｂａｓｉｓ
ｒｅｇｕｌａｔｅ
ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｌａｄｄｅｒ．ＷｅｏｂｓｅｒｖｅｃｕｒｒｅｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＩＣＣｓｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇｍｏｄｅ．
ａｎｄｔｈｅ
Ｔｈｉｓ
ｃｕｒｒｅｎｔ
ｏｆｔｈｅＩＣＣｓａｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｐａｃｉｎｇＢｌｏｃｋｉｎｇ
ａｇｅｎｔ
ＺＤ７２８８ｉｎ
ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．
ｓｕｂｊｅｃｔ
ｐｒｏｖｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅＩＣＣｓｉｎ
ｇｕｉｎｅａｐｉｇｂｌａｄｄｅｒｍａｙｂｅｔｈｅ
ｐａｃｅｍａｋｅｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＩＣＣｓ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｓ，ＫＩＴｐｒｏｔｅｉｎ，ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｉｈｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｙｐｅｏｆ
Ｔｈｅｓｉｓ：Ａ（ｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ）
ＩＩ
英文缩写
ＤＩ
ａ．ＳＭＡＤＭＥＭ
ＫＩＴ
ＮＯＭＭＩＨＳ
ＢＥＲ
ＤＳＭＣ
ＦＩＴＣ
ＢＳＡＰＢＳ
ＥＧＴＡ
ＩＣＣｓ
ＳＣＦ
ＨＥＰＥＳ
ｍ
Ｉｆ
ＩＱ
英文缩略词表
英文全称
中文对照
Ｄｃｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ
逼尿肌不稳定
ａ—ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ
ａ．平滑肌肌动蛋白Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ
改良基础培养基Ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ
酪氨酸蛋白激酶受体Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ
一氧化氮
Ｍｅｇａｃｙｓｔｉｓ－ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎ・・ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｈｙｐｏｐｅｒｉ・－
巨膀胱．小结肠．肠蠕动迟缓综ｓｔａｌｓｉｓｓｙｎｄｒｏｍｅ合症
Ｂａｓｉｃｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｈｙｔｈｍ
胃肠基本电节律
Ｄｅｔｒｕｓｏｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ
逼尿肌细胞
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ
异硫氰酸荧光素ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ
牛血清白蛋白ｂｕｆｆｅｒｅｄ
ｓａｌｉｎｅ
磷酸盐缓冲液
Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅ）
ａｃｉｄ
乙二醇双（２－氨基乙醚）四乙酸ＩｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｃｅｌｌｓｏｆＣａｊａｌＣａｊａｌｌ司质细胞Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ
干细胞因子
ｐｉｐｅｒａｚｌ∞
ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｍｃ羟乙基哌嗪乙磺酸
ｉｎｗａｒｄｃｕｒｒｅｎｔ
超级化激活的内向电流
ｃｕｒｒｅｎｔ
有趣电流ｃｕｒｒｅｎｔ
奇特电流
ｎＩ
ＢｏＶｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔｅ
ｔｅ臼ｍｃｅｔｉｃ
Ｈ中ｘｙｅｔｈｙｌ
ａＣｌｄ
Ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｆｕｎｎｙ
Ｑｕｅｅｒ
石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明
学位论文独创性声明
本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。
研究生签名：
≥葛劫时间：ｕ・稗占月
’ｌＥｌ
使用授权声明
本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。
研究生签名：导师签名：
王葛易
时间：１ｐ俾‘月ｆ『日
Ｉ
铂蕃
吣吼：铷国辞，Ａ／ｌ黾
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
刖舌
（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）
生理状态下，在体膀胱可记录到起源于膀胱顶，向膀胱颈方向传播的自发性、规律性收缩；而离体的膀胱平滑肌肌条在完全阻断了神经影响（切断神经支配以及加入神经阻滞剂）的情况下，仍然存在有节律的自发性收缩。该现象表明离体膀胱平滑肌的收缩不依赖于神经因素而与膀胱平滑肌本身特性有关，是一种由起搏细胞控制的肌源性的自发兴奋、收缩。
膀胱组织所包含的多种细胞成分中，哪一种细胞在膀胱起着起搏作用呢？Ｃａｊａｌ间质细胞在胃肠道的起搏功能为我们探寻膀胱起搏细胞提供了一个理想的切入点。Ｃａｊａｌ间质细胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
ｃｅｌｌｓ
ｏｆｌＣＣｓ，ＩＣＣｓ）是西班牙神经解剖学家Ｃａｊａｌ于１８９３年率先在肠
道发现的一种特殊的间质细胞【ｌ】。目前人们已证实胃肠道平滑肌组织自发性收缩活动的发生机制是由于其壁内存在一种具有起博功能的ＩＣＣｓ样细胞，这种细胞能够自发性地产生去极化波，通过缝隙连接传播到平滑肌细胞，诱发其产生动作电位。ＩＣＣｓ样细胞是胃肠基本电节律（ｂａｓｉｃｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｒｈｙｔｈｍ，ＢＥＲ）的起搏者，其突起形成的网络可传播ＢＥＲ；ＩＣＣｓ样细胞尚作为壁内神经信息向平滑肌传送的中转站，并对有关信号起整合作
用，尤其在调节一氧化氮（Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）依赖性的神经递质方面起重要的作用【２Ｊ。ＩＣＣｓ
样细胞结构完好、分布及功能正常，对胃肠动力的发生和功能调控至关重要【３ｌ，与一些
胃肠动力紊乱性疾病如先天性巨结肠【４】和假性肠道梗叫５】的发生密切相关。这种间质细胞特异性地表达虹受体酪氨酸激酶。
Ｃ—Ｋｉｔ为一种原癌基因，其编码产物ＫＩＴ，是位于细胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受体，
也是干细胞生长因子受体，可表达于造血细胞、肥大细胞及ＩＣＣｓ样细胞等多种细胞。由于平滑肌细胞、神经纤维和成纤维细胞不表达ＫＩＴ，ＫＩＴ免疫组织化学染色是在光镜水平鉴别胃肠道和泌尿道ＩＣＣｓ样细胞的可靠方法【６】。膀胱平滑肌具有和胃肠道平滑肌相似的、不受神经控制的自发性肌源性兴奋性，ＩＣＣｓ样细胞在胃肠道兴奋起源、动力产生和功能调控方面的重要作用以及泌尿道和胃肠道平滑肌相似的生理特性，让我们联想到该类细胞在泌尿道存在和发挥相似功能的可能性。采用ＫＩＴ免疫组织化学方法，ＫＩＴ阳性、形态与胃肠道ＩＣＣｓ样细胞相似的细胞被证实存在于豚鼠膀胱【＿７１，小鼠【８】、大鼠、猪和牛【９１的上尿路，人的全泌尿道【１０】及兔的尿道【儿】，由于该类细胞是否在泌尿道发挥其在胃肠道一样的功能尚有待进一步证实，泌尿道ＩＣＣｓ样细胞被称为ＩＣＣｓ样细胞以与胃肠道ＩＣＣｓ相区别。ＩＣＣｓ样细胞在膀胱可能起着重要作用。在病理状态下，Ｐｉａｓｅｃｚｎａ等１１２】发现巨膀胱一小结肠一肠道蠕动迟缓综合症（ｍｅｇａｃｙｓｔｉｓ．ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎ
ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｈｙｐｏｐｅｒｉｓｔａｌｓｉｓＳｙｎｄｒｏｍｅ，ＭＭＩＨＳ）患者的膀胱，其ＩＣＣｓ样细胞分布密度明显少于正常对照组，推测ＩＣＣｓ样细胞分布密度减少与ＭＭＩＨＳ患者膀胱排空障碍密切相关。ＫＩＴ受体抑制剂甲磺酸伊马替尼（ＩＭ）可明显抑制ＤＩ患者离体膀胱平滑肌肌条的自发兴奋性，并可提高在体豚鼠膀胱的膀胱容量和膀胱顺应性【ｌ３１，提示ＩＣＣｓ样细胞与膀胱平滑肌兴奋的起源和调控有密切的关系。
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
综上所述，存在于膀胱的ＩＣＣｓ样细胞与膀胱平滑肌肌源性兴奋的起源和调控关系密切，可能就是膀胱的起博细胞。本课题以成年豚鼠为研究对象，在证实ＩＣＣｓ样细胞存在于豚鼠膀胱的基础上，用透射电镜观察成年豚鼠膀胱组织ＩＣＣｓ样细胞的超微结构、分布及其与神经与平滑肌之间的关系，并采用酶消化法，体外得到培养状态下的ＩＣＣｓ样细胞，利用膜片钳技术，在全细胞记录模式下观察其是否具有起博细胞的电流特性，以证明其是否为膀胱的起博细胞。本研究结果对于理解与排尿有关的生理和病理机制都会增加全新的认识，并为临床上治疗某些膀胱动力性疾病（如ＤＩ）提供新的靶点。
２
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
材料与方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
１材料
１．１实验动物：
实验动物均采用健康１￣２个月龄豚鼠，雌雄不限，体重４００．６００９，２０只（新疆石ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ）
河子大学实验动物中心提供）。
１．２主要试剂：
常用试剂２５％戊二醛磷酸二氢钠磷酸氢二钠四氧化锇醋酸铀柠檬酸铅ＤＭＥＭ培养基
ＳＣＦ
Ｖ型胶原酶
兔抗大鼠ＦＩＴＣ标记荧光抗体
ＦＢＳ
大鼠抗小鼠ｃ．ｋｉｔ抗体
ＰＢＳＺＤ７２８８ＨＥＰＥＳ
无水氯化钙
磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰ０４・１２Ｈ２０）
葡萄糖
氢氧化钾
硫酸镁
氯化钾
氯化钠ｍａＣｌ）碳酸氢钠（ＮａＨＣ０３）
盐酸（ＨＣｌ）氢氧化钠
ＥＧＴＡ
ＭｇＣｌ２蔗糖
生产厂家
北京华美生物试剂公司
北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司北京华美生物试剂公司
Ｓｉｇｍａ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｈｙｃ］ｏｎｅ公司ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｔｏｃｒｉｓ公司Ｓｉｇｍａ公司
上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司
上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司上海优维宁试剂公司
正常豚鼠膀胱ｃａｊａｌ样间质细胞形态、机能学研究
１．３主要仪器设备：
主要仪器Ｈ．６００透射电镜
生产厂家日本光电
湖北恒丰医疗器械有限公司北京赛多利斯天平厂
上海南汇电讯器械厂
ＹＬＤ．２０００型电热恒温干燥箱ＢＳ．２０１Ｓ电子精密天平
７９１型磁力搅拌器ＴＹＫ．４０２１型超纯水机
乌鲁木齐超纯水机厂
上海浦东金环医疗用品有限公司苏州安泰空气技术有限公司
Ｆｏｒｍａ公司奥林巴斯公司
手术器械
ＳＷ．ＣＪ．２ＦＤ超净工作台
Ｓ／Ｎ２７７０９．１４６２
Ｃ０２培养箱
Ｉ＂７１倒置显微镜
Ａｎｋｅ．ＴＤＬ．４０Ｂ低温离心机Ｓ／Ｎ高压消毒锅ＧＩＬＳＯＮ移液管离心管
上海安亭医疗器械厂
日本三洋公司国产国产
培养瓶
玻璃微电极拉制仪９５．Ｂ倒置显微镜ＸＤ．１０１—２Ｂ
膜片钳放大器ＣＥＺ．２４００三维微操纵器ＭＰ．１
国产
华中科技大南京江南光电厂
日本光电厂
日本光电厂国产
医用内窥镜冷光源
膜片钳软件ＩＢＢｃｌａｍｐ
华中科技大
１．４常用试剂配制：
（１）缓冲液的配制
①磷酸缓冲液（０．２Ｍ）的配制方法如下：
甲液：Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈ２０
加蒸馏水溶解成
乙液：ＮａＨ２Ｐ０４．２Ｈ２０
加蒸馏水溶解成
７１．６４９
１０００ｍｌ
３１．２１９
１０００ｍｌ
②按如下混合甲、乙两液即得所需ＰＨ的磷酸缓冲液０．２Ｍ的磷酸缓冲液的配制（５０ｍ１）
ＰＨ
６．４１３．３
６．６１８．８３１．２
６．８２４．５２５．５
７．０３０．５１９．５
７．２３６．０１４．０
７．４４０．５９．５
甲液（ｍ１）
乙液（ｍ１）３６．７
（２）常用固定液的配制
Ｏ．１Ｍ磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为２５％的水溶液）
４
正常豚鼠膀胱ｃａｊａｌ样问质细胞形态、机能学研究
０．ＩＭ磷酸缓冲戊二醛的配制
戊二醛最终浓度（％）１．００．２Ｍ磷酸缓冲液（ｍ１）５０２５％戊二醛水溶液（ｍ１）４
双蒸水加至（ｍ１）
１００
１．５５０６１００
２．０５０８１００
２．５５０１０１００
３．０５０１２１００
４．０５０１６
５．０５０２０１００
１００
（３）０．０１ＭＰＢＳ（ＰＨ７．４）：取２０００ｒａｌ重蒸水于烧杯中，加一包ＰＢＳ干粉充分溶解，
测试ＰＨ７．４左右，分装于２个５００ｍｌ瓶中。
（４）Ｉ％ＢＳＡ６０ｍｇＢＳＡ，加６ｍｌ０．０１ＭＰＢＳ充分溶解。
（５）ＤＭＥＭ细胞培养液：ＤＭＥＭ粉１３．４９溶于９００ｍｌ去离子水中，加入碳酸氢钠３．０９，谷氨酰胺Ｏ．５９，ＨＥＰＥＳｌ．５９，加入青霉素，链霉素使其终浓度为ｌＯＯｕ／ｍｌ，补足容积１０００ｍｌ，抽滤除菌，分装成８０ｍｌ／瓶，使用时每瓶加入２０ｍｌ的胎牛血清和２５ｎｇ
的ＳＣＦ。
（６）Ｏ．１％胶原酶Ｐ液：将ｌＯＯｍｇ胶原酶Ｐ溶于ｌＯＯｍｌ无血清ＤＭＥＭ细胞培养液中，抽滤除菌，分装成１０ｍｌ／瓶，．２０＂Ｃ保存ｏ
（７）Ｈａｎｋｓ液：Ｎａ＋１３０ｍＭ，Ｋ＋５．８ｍＭ，Ｃ１．１３５ｍＭ，Ｈ２Ｐ０４．０．４４ｍＭ，ＨＰ０４２．０．３４ｍＭ，ＨＣ０３－４．１６ｍＭ，Ｓ０４２－０．４ｍＭ，Ｃａ２＋１．８ｍＭ，Ｍ９２＋Ｏ．９ｍＭ，ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ，
葡萄糖１０ｍＭ，蔗糖２．９ｍＭ，ＮａＯＨ调ｐＨ值至７．２—７．４，分装高压灭菌，４＂Ｃ储存待
用。
（８）Ｋ＋电流记录电极液：１３３ｍｍｏｌ／１ＫＣｌ，ｌｍｍｏｌ／１ＭｇＣｌ２，０．５ｒｅｔｏｏｌ／１
１０ｍＭ，ＫＯＨ调ｐＨ值至７．２．７．４。
ＥＧＴＡ，ＨＥＰＥＳ
５
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
２技术路线图
６
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
３方法
３．１豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞电镜标本制备
３．１．１电镜标本制备
（１）颈部脱臼法处死豚鼠，即刻由下腹部正中切口、于膀胱颈处离断取出膀胱，纵行剖开膀胱；
（２）用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液清洗，再将组织黏膜面朝上平铺于滤纸上，
刀片将其切成ｌｌｉｒａｌ３的小块；（双面）
（３）立即放人２％戊二醛固定液中固定；
（４）组织固定后，以Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液冲洗；
（５）１％四氧化锇后固定ｌｈ：
（６）０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液再次冲洗，在丙酮中梯度脱水；
（７）环氧树脂包埋，制成半薄切片定位；
（８）超薄切片醋酸铀．柠檬酸铅双重电了染色后。
３．１．２置透射电镜下观察
３．２豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的分离、培养及其鉴定
３．２．１原代成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的分离培养
（１）原代成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和平滑肌细胞的分离
①颈部脱臼法处死成年豚鼠，无菌条件下切取膀胱，置于含双抗（青霉素１００Ｕ／ｍＬ和链霉素１００９“／ｍＬ）的０．０１ＭＰＢＳ溶液中浸泡１０ｍｉｎ：
②室温下，无菌操作台上在０．０１ＭＰＢＳ溶液中将膀胱剪成１ｍｍ３小块；
③在含双抗的０．０１ＭＰＢＳ溶液中漂洗２次；
④换入ｌｍｇ／ｍＬ胶原酶Ｖ溶液（Ｓｉｇｍａ公司），盖紧瓶盖，置入３７＂Ｃ培养箱中消化３０ｍｉｎ；
（２）原代成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和平滑肌细胞的培养
①将消化好的絮状肌条液转移至消毒离心管中，１１０．２５０ｘｇ离心１分钟。去除上清液，重复３次，去除残余的酶及可能污染的细菌；
②轻轻吹打分散组织细胞片，转入３５ｍｍ培养瓶中，瓶内加入适量ＤＭＥＭ培养液，盖好瓶盖，于３７℃、５％Ｃ０２下培养：
③细胞接种后３个小时，可见胞体为梭形并有两个细胞突起的细胞贴壁，平滑肌细胞尚未贴壁。将未贴壁的平滑肌细胞转移至另一培养瓶，孵箱内静置３天后，可见平滑肌细胞贴壁。
（３）膀胱逼尿肌细胞的传代培养
①当逼尿肌细胞７０％．８０％细胞融合贴壁后，可消化传代；
②将培养瓶用无钙镁磷酸盐缓冲液漂洗３次；
④加入０．２％的胰蛋白酶消化液，保留１分钟，然后倒去消化酶液；⑤按常规方法，消化细胞，加入培养基，用细玻璃吸管轻轻反复吹打细胞，使之
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
分散成单细胞悬液；
⑥根据细胞密度，将单细胞悬液分置到２．３个新培养瓶中，分别补足培养液，置于３７℃、５％Ｃ０２下培养，传代完成。
３．２．２培养膀胱ＩＣＣｓ样细胞和平滑肌细胞的鉴定
３．２．２．１培养膀胱ＩＣＣｓ样细胞的鉴定
（１）细胞形态学鉴定：
根据ＩＣＣｓ样细胞的形态特点，相差显微镜常规观察细胞牛长形态及生长规律。
（２）免疫组织化学鉴定：
用特异性ＫＩＴ抗体（工作浓度为１：１００，购自Ｅｂｉｏｓｃｉｃｎｃｅ公司）进行免疫组织化学鉴定。主要步骤如下：６孔培养板孔中放入盖玻片，原代细胞接种于其上，当细胞贴壁后，行免疫组化染色：
①细胞爬片取出后０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
②１００％丙酮室温下固定ｌＯｍｉｎ，风干后同上清洗；
③０．０３％Ｈ２０２／甲醇封闭内源性过氧化物酶２０ｍｉｎ（２５℃）；
④０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
⑤Ｉ％ＢＳＡ室温下孵育３０ｍｉｎ：
⑥弃去多余孵育液，滴加０．２％ＢＳＡ／０．０１ＭＰＢＳ稀释的第一抗体（大鼠抗小鼠的单克隆ＫＩＴ抗体，１：１００，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司），湿盒内孵育２ｈ（室温），后４＂Ｃ
⑦０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
＠ＦＩＴＣ标记荧光抗体（１：１００，Ｓｉｇｍａ公司）室温孵育６０ｍｉｎ：
⑨０．０１ＭＰＢＳ漂洗５ｍｉｎｘ３次；
⑩将盖玻片反转，用７５％甘油封于载玻片上，荧光显微镜下观察。
对照实验以正常鼠血清代替一抗，或兔血清代替二抗，结果均为阴性。选取豚鼠肠壁切片作为阳性对照，染色方法同上。
３．２．２．２培养膀胱逼尿肌细胞的鉴定
（１）细胞形态学鉴定：４８ｈ：
根据逼尿肌细胞的形态特点，相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律。
（２）免疫组织化学鉴定：
用特异性ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ抗体（工作浓度为１：１００，Ｓｉｇｍａ公司）进行免疫组织化学鉴定。主要步骤同上，用ＣＹ３标记抗体（１：１００，Ｓｉｇｍａ公司）代替上述第二抗体。对照实验以正常鼠血清代替一抗，或兔血清代替二抗，结果均为阴性。选取豚鼠肠壁切片作为阳性对照，染色方法同上。
３．３豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的膜片钳实验
３．３．１微电极拉制
（１）材料准备：
厚壁有芯玻璃毛管（华中科大仪博生命科学仪器有限公司）。两端烧制圆滑。８
正常豚鼠膀胱ｅａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
（２）微电极拉制步骤：
垂直式拉制仪一步法拉制，ＨＥＡＴ值５８．４，拉制后微电极直径约ｌｇｍ。
３．３．２膜片钳实验程序【”Ｊ：
３．３．２．１具体操作步骤：
（１）将玻片取出置于细胞浴池中，含有５％０２的ＨＡＮＫｓ液持续灌流以维持细胞活性；
（２）微电极经０．２２９ｉｎ过滤器灌注电极液达全长的ｌ／３处，排尽气泡；
（３）将膜片微电极插入探头，腔内施以正压，然后将电极浸入浴液，以防止浴液气液面上积集的灰尘或溶液中的粒子附着在电极尖端而妨碍巨阻抗封接的形成，边将之驱除，边使电极接近细胞（图１）：
（４）运行ｐＣＬＡＭＰ９．０软件，产生一频率为１Ｈｚ，幅度为．１０ｍＶ，波宽为１０ｍｓ，时程为２５ｍｓ的方波脉冲；
（５）从示波器上监视电极阻抗，一般来说，电极电阻为４．６ＭＯ、封接电阻＞ＩＧＯ较为合适，如达不到要求，则需重新更换一根膜片电极；
（６）巨阻抗封接：从示波器监视电极阻抗、封接程度和瞬时电容电流补偿情况（图２）ｔ①首先确认微电极尖端轻触到细胞表面，此时可发现应变电流变小，根据电极尖端直径估算细胞大小。调节“电极失调控制”，消除液结电位。
②去除电极腔内正压，用注射器或口吸给微电极腔内施加负压（．１０．３０ｅｍＨ２０），如果在监视器上看到应变电流突然为零，电流噪声也随之减少，则提示将要形成巨阻抗封接。
③获得巨阻抗封接（封接电阻＞ＩＧＯ）后，则可去除负压，如稍等待一些时间巨阻抗封接仍不能形成，则需重新更换一根膜片电极（因为一旦接触到细胞表面的电极即不能再用），按上述步骤重新操作。
（７）调节膜片钳放大器的快电容电位补偿旋钮，抵消电极电容；
（８）破膜：在细胞吸附状态下，施加负压吸７１（．３０＂－＇２００ｃｒｎＨ２０）破坏膜片，或用大电流（＜２０ｎＡ）给予高电压电击以离断膜片，获得全细胞模式（ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌｌｍｏｄｅ）；
（９）调节膜片钳放大器的慢电容电位补偿旋钮，抵消膜电容；
⑩补偿电极电容、膜电容后，稳定５－－－１０ｍｉｎ，运行ｐＣＬＡＭＰ９．０，进行实验。
３．２．２．２超级化激活的内向电流（１１１）记录
微电极内灌充Ｋ＋电流记录电极液，选择电压钳模式，输出各类刺激信号。设置钳制电压（ＨＰ）为．６０ｍＶ；检测电压（ＴＰ）每步阶跃１０ｍＶ，从．１５０ｍＶ均跳至．４０ｍＶ，根据实验要求进行改变；时程５００ｍｓ：刺激脉冲刺激间隔５ｓ；实验温度２１℃。
３．２．２．３不同浓度ＺＤ７２８８对ＩＣＣｓ样细胞ｍ的影响
微电极内灌充Ｋ＋电流记录电极液，选择电压钳模式，设置钳制电压（ＨＰ）为一１５０ｍＶ，细胞浴池液中ＺＤ７２８８浓度分别为５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，记录ｍ，实验温度２ｌ℃。
耋口木结果
（Ｒｅｓｕｌｔｓ）
ｌ豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞超微结构及其与周围组织关系的电镜观察
１．１ＩＣＣｓ样细胞的形态特点
豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和周围平滑肌细胞有明显不同的形态特征，平滑肌细胞排列整齐．有肌原纤维肌、胞体和丰的富细胞器，线粒体的嵴较多。成年豚鼠膀胱组织ＩＣＣｓ样细胞胞体为梭形，在细胞两极有两个细长突起，有丰富的沿细胞膜分布的膜下小空腔，有较完整的基膜，有电子致密度高的巨大卵圆形核，占细胞大部分，核周胞质少．胞质内线粒体非常丰富，常紧密排列在胞浆里，游离核糖体与多聚核糖体多见，可见到发达的粗面内质网、滑面内质网、高尔基体（图３）。ＩＣＣｓ样细胞与其它的ＩＣＣｓ样细胞之问、ＩＣＣｓ样细胞与平滑肌细胞和神经细胞之间多见由紧密并置的质膜形成的缝隙连接（图４）。
１．２ＩＣＣｓ样细胞的分布特点
豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞主要位于黏膜下区域，逼尿肌平滑肌肌束边缘和肌束间的组织间隙【ｌ６。，并呈星形网状分布。黏膜下层分布多于肌层，膀胱体多于其他部位，这种分布与其收缩功能密切相关。ＩＣＣｓ样细胞突触之间相互连接形成网络状结构，也和平滑肌细胞形成紧密关系。
１．３ＩＣＣｓ样细胞与周围组织的关系
ＩＣＣｓ样细胞往往与神经纤维末梢及神经束伴随存在，并由许多的缝隙连接紧密连接在一起【１７】，粘膜下、肌间ＩＣＣｓ样细胞与神经系统关系最为密切，其突起通常穿过肌层围绕神经纤维，其胞质突起绕神经束形成完整的“鞘”样结构（图５．６）。ＩＣＣｓ样细胞突起之间相互连接形成网络，分布均匀。ＩＣＣｓ样细胞胞体与平滑肌细胞平行相随，也和平滑肌细胞形成紧密缝隙连接。
２分离、培养后的豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的鉴定
２．１原代ＩＣＣｓ样细胞培养及细胞特征鉴定：
（１）细胞生长形态
培养细胞置于倒置显微镜下观察，培养３ｈ后细胞已开始贴附在瓶底，胞体为梭形，细胞两极有２个细长突起（图７）。细胞增殖能力较弱，培养一周细胞数目无明显增加。
（２）免疫组化鉴定
ＩＣＣｓ样细胞爬片ＫＩＴ免疫组化染色为阳性（图９），ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ染色阴性（图ｌｏ）。２．２原代膀胱逼尿肌培养及细胞特征鉴定：
（１）细胞生长形态
培养细胞置于倒置显微镜下观察，培养２４ｈ后细胞已开始贴附在瓶底，呈成纤维形或短棒状，４．５天后可观察到肌细胞融合现象，大约７天时间可覆盖培养瓶底部７５％．８０％以上（图８），此时可以进行细胞传代。
（２）免疫组化鉴定
逼尿肌细胞爬片ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ免疫组化染色阳性（图１１），ＫＩＴ染色阴性（图１２）。
３膜片钳下豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的特性电流记录
３．１全细胞模式下ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流
（１）ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流
被检测的ＩＣＣｓ样细胞均可记录到ｍ电流（ｎ＝１６）。激活电压．５０ｍｖ，呈电压依赖性（图１３）。
（２）当浴池中加入ｍ通道特异阻滞剂ＺＤ７２８８时，发现其幅度明显减小，并呈剂量依赖性（图１４）。
３．２全细胞模式下逼尿肌细胞ｍ电流
相同条件下被检测的逼尿肌细胞中记录不到ｍ电流。
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图１３：全细胞模式下ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流
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图１４：ＪＪＨ入Ｉｌｌ特异性阻滞剂Ⅱｌ电流明显减小
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
讨论
（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）
１豚鼠膀胱ＩＣｅｓ样细胞超微结构及其与周围组织的关系
１．１Ｉｃｅｓ样细胞的功能
大量研究显示，一方面Ｉｃｅｓ样细胞是产生慢波活动，是膀胱运动的始动者，其突起形成的网络及肌间的缝隙连接可传播兴奋；另一方面ＩＣｅｓ样细胞尚作为神经信息向平滑肌传递的中转站，并对信号起整合作用。试验证明，当膀胱ＩＣｅｓ样细胞被拟胆碱药物或ＡＴＰ刺激时，神经递质产生应答，而用美兰对标本染色并将其暴露于光照下，选择性的破坏粘膜下ｉｃｅｓ样细胞的时候，可引起慢波消失【ｌ引，这证实在产生慢波的过程中ＩＣｅｓ样细胞起到了关键性的作用，慢波活动对平滑肌细胞的收缩功能起到制约、限制的作用，ＩＣＣｓ样细胞是产生慢波的细胞【１９】，这也有助于证明ＩＣＣｓ样细胞有膀胱运动起搏的功能；与神经细胞及平滑肌细胞缝隙连接丰富是ＩＣｅｓ样细胞的显著结构特点，反映了ＩＣｅｓ样细胞传递、整合信号的主要功能特点【２０１。因此应该说ＩＣＣｓ样细胞结构完好、分布及功能正常，对膀胱收缩功能调控至关重要，ＩＣＣｓ样细胞相互之间、与神经、平滑肌细胞之间的缝隙连接以及ＩＣｅｓ样细胞的超微结构与膀胱其运动功能相适应。
１．２ＩＣＣｓ样细胞超微结构与其功能的关系
ＩＣｅｓ样细胞的超微结构及其与周围组织的关系也与其运动中介的功能相适应：ＩＣｅｓ样细胞有丰富的线粒体，这说明其功能活跃，适应其作为膀胱慢波起搏细胞的需要；ＩＣｅｓ样细胞与ＩＣｅｓ样细胞之间、ＩＣＣｓ样细胞与平滑肌细胞之间、ＩＣｅｓ样细胞与神经细胞之间以及平滑肌之间形成很多的缝隙连接，这种结构特点适应ＩＣｅｓ样细胞在膀胱运动中起传递、整合信号的功能；滑面内质网、粗面内质网和高尔基体丰富，说明其具有活跃的合成功能。
１．３ｉｃｅｓ样细胞与疾病的关系
很多膀胱动力障碍性疾病还未发现明显的器质性病变，主要表现为膀胱舒缩功能的变化，结合ｉｃｅｓ样细胞的功能特点，我们可以认为在这类疾病中ＩＣＣｓ样细胞的功能与分布的变化可能是一重要的发病因素。最近的一些研究显示，膀胱ＩＣＣｓ样细胞可能与膀胱动力障碍性疾病有关。如许多ＩＣＣｓ样细胞胞在正常人的膀胱中被发现，但在巨膀胱－小结肠．肠蠕动迟缓综合征患者（ｍｅｇａｃｙｓｔｉ－ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎ—ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｈｙｐｏｐｃｒｉｓｔａｌｓｉｓｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＭＭＩＨＳ）的膀胱中ＩＣＣｓ样细胞却明显减少，提示膀胱ＩＣｅｓ样细胞的缺乏，可能影响了膀胱中平滑肌细胞间的信息传递、神经传递及自发性电活动的产生，而这些就可能导致ＭＭＩＨＳ的膀胱出现排泄功能障碍【２¨。进一步应对多种膀胱功能紊乱性疾病的ＩＣＣｓ样细胞的结构、分布的变化进行研究，以达到明确该类疾病发病机制的目的。２豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的分离、培养及其鉴定
２．１原代豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的培养
２．１．１培养方法膀胱ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的原代培养有酶消化法和组织块贴壁培养法两种。
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
前者的优点在于可很快获得大量活细胞，原代培养出细胞的效率较高，主要有胰蛋白酶法和胶原酶法两种。胰蛋白酶是目前应用最多的消化试剂，适用于消化细胞间质较少的软组织，如脑组织等。而胶原酶对胶原的消化作用很强，它仪对细胞间质有消化作用，因此适于消化分离平滑肌组织。尽管该方法操作步骤繁琐、消化酶也较昂贵，实验成本相应较高，但其培养周期短，方便于实验需要，它能够比较干净除去组织表面的内皮细胞【１４１。另外，组织块培养，虽方法简单，花费少，但培养周期长，其成功率也低。
２．１．２ＩＣＣｓ样细胞培养
干细胞因子（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）是ＫＩＴ受体的配体，；由Ｓ１位点的基因编码，是一种糖基化非共价同型二聚体，也称Ｓｔｅｅｌ因子，肥大细胞生长因子等。ＳＣＦ在体内广泛表达，包括：角膜细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，在循环系统中也存在低浓度ＳＣＦ。根据外显子６的存在与否，ｍＲＮＡ分别编码２２０个氨基酸和２４８个氨基酸的两种跨膜ＳＣＦ，被称为膜结合型ＳＣＦ，而后者可迅速发生蛋白裂解，而释放出可溶型ＳＣＦ，前者的裂解速度较慢【２２１。一般认为膜结合型ＳＣＦ在功能上比可溶型ＳＣＦ重要。ＳＣＦ．ＫＩＴ信号通路对ＩＣＣｓ的正常发育、分化有重要的作用。当编码ＫＩＴ蛋白的基因ｃ．ｋｉｔ发生突变时，ＫＩＴ信号途径被阻断，ＩＣＣｓ的发育将出现异常怛３Ｊ：同样编码ＳＣＦ的基因ｓｔｅｅｌ的突变亦可见相似的结果，研究发现在１０号染色体Ｓｔｅｅｌ突变的Ｓ１／Ｓｌｄｄ、鼠，ＳＣＦ合成障碍，导致小肠ＩＣＣｓ明显减少甚至缺如，ＩＣＣｓ的发育、增殖和成熟都需要ＳＣＦ，如果阻断ＳＣＦ．ＫＩＴ通路，将不能分化为成熟的ＩＣＣｓ［２４１。离体实验发现，分离培养的胚胎第１５．１７周小鼠小肠，肌间神经丛周围ＩＣＣｓ细胞（ｍｙｅｎｔｅｒｉｃｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｃｅｌｌｓｏｆＩＣＣｓ，ＩＣ．ＭＹ）网络基本形成，有一定的电节律活动，而加入ＫＩＴ蛋白中和抗体后，ＩＣ．ＭＹ网络断裂，电慢波消失。由此可见，ＫＩＴ／ＳＣＦ信号途径对ＩＣＣｓ的正常发育和功能维持具有非常重要的作用。在本研究中，我们在ＩＣＣｓ样细胞体外培养液中加入浓度为５ｎｇ／ｍｌ的ＳＣＦ，以保证其正常生长和细胞表型表达。
２．１．３逼尿肌细胞培养
逼尿肌细胞是一种平滑肌细胞，影响膀胱逼尿肌细胞培养成功的因素很多，总结我们的经验，以下几点是关键：①取材方法：取材时应平双侧输尿管进入膀胱壁处将膀胱横断，以避免同时取到膀胱底部较多的血管、外膜等组织，于解剖显微镜镜下将外膜仔细剔除。②细胞接种量：接种量一般为２０ｘ１０４／ｍｌ，接种密度以３ｘ１０４／ｃｍ２最为适宜，如细胞接种过少，细胞生长难于铺满瓶壁，直接影响细胞传代。⑧掌握好组织快的消化程度也是成功的关键，组织块应尽量剪碎以利消化，严格控制胶原酶浓度和消化时间，见消化液混浊、组织块呈絮状，或在显微镜下见消化液中有较多单个细胞或细胞小团块时应终止消化。细胞传代培养时也应掌握好消化时间，即当均匀、透亮、没有间隙的薄层变成不透亮，并有间隙出现时，即可终止消化。④由于逼尿肌细胞属于平滑肌细胞，贴壁能力相对弱于其它类型的细胞，因此在培养开始的３天以内，应当绝对静止，避免振动和移动，以免细胞漂浮死亡。
２．２原代培养状态下ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞的差别１３
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
２．２．１形态差别
倒置显微镜下，ＩＣＣｓ样细胞在培养状态下的形态和组织切片相似，胞体均为梭形，胞体两极有两个细胞突起。该特点易与培养状态下的逼尿肌细胞相区别。逼尿肌细胞培养状态下呈成纤维样生长，细胞突起不规则。用免疫组织化学方法，可鉴定和区别这两类细胞：ＩＣＣｓ样细胞ＫＩＴ染色阳性，ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ染色阴性；而逼尿肌细胞ＫＩＴ染色阴性，ａ．ＳＭ－Ａｃｔｉｎ染色阳性。
２．２．２增殖情况差别
有研究证明ＩＣＣｓ主要来源于间充质细胞【２５１，在发育过程中出现于消化管壁内后，数量逐渐增加，突起和分支逐渐增多延长，但一般出生以后，这种增殖能力逐渐下降，细胞数量保持相对恒定；胎儿小肠壁内ＩＣＣｓ在妊娠９～１２周出现后，数量随胎龄增加而增多，突起逐渐延长，至胚胎中晚期ＩＣＣｓ彼此间形成完整的细胞网络【２６１。Ｋｌｕｐｐｅｌ报告小鼠ＩＣＣｓ在胚胎第１２一１４周出现，随后ＩＣＣｓ逐渐增多，分别构成ＩＣ．ＭＹ和粘膜下的ＩＣＣｓ细胞细胞群，出生后数日内ＩＣＣｓ的数量可迅速增加到出生时的３倍以上。体外培养研究也表明，在ＳＣＦ存在下，小鼠胚胎第１８周和出生后第２周的ＩＣＣｓ具有增殖能力，且在一定范围内与ＳＣＦ的浓度呈正相关，但小鼠出生后第６周的ＩＣＣｓ体外培养未见增剃２７】。以上结果提示在胚胎发育阶段，ＩＣＣｓ具有一定的增殖能力，细胞突起亦能生长延长，而成体ＩＣＣｓ似乎不具有增殖能力。本实验研究发现成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞在原代培养状态下的增殖情况与胃肠道ＩＣＣｓ相同，培养７天，细胞数目无明显增加；而相同培养条件下的逼尿肌细胞增殖速度明显快于ＩＣＣｓ样细胞，约７天以后即可传代。
２．３ＩＣＣｓ样细胞的纯化
成年豚鼠膀胱中ＩＣＣｓ样细胞分布密度明显小于逼尿肌细胞。若不将两种细胞分离，混合培养时，由于逼尿肌细胞的优势生长，培养一定时间后ＩＣＣｓ样细胞将死亡。国外报道采用免疫磁珠分选法，分离、纯化后得到培养状态下的肠道ＩＣＣｓ纯度高、细胞数目多，可提供充足的细胞用于ＲＴ－ＰＣＲ实验、大规模的基因学研究以及ＩＣＣｓ网络的功能分析。本部分实验的目的在于建立成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的原代培养方法，为下一步部分的膜片钳实验提供目的细胞。实验中发现由于逼尿肌细胞属于平滑肌细胞，贴壁能力相对弱于其它类型的细胞（接种后２４小时）；而ＩＣＣｓ样细胞贴壁能力明显强于逼尿肌细胞（接种后３小时即可贴壁）。利用培养初期两种细胞贴壁能力的差异，在混合培养中，ＩＣＣｓ样细胞贴壁后将尚未贴壁、漂浮的平滑肌细胞转移至另一培养瓶中，在培养初期即可分离两种细胞，分别得到相对纯化的ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞。单独培养的ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞均可用于行膜片钳实验。与免疫磁珠分选法相比，实验步骤更为简单和经济。
３豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞的电流特性研究
３．１起搏细胞的电生理特征
可产生自发性动作电位（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＳＡＰ）是起搏细胞区别于其他可１４
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样问质细胞形态、机能学研究
兴奋细胞的基本特征。ＳＡＰ通过细胞间的传导系统（在心脏，传递兴奋的丰要结构是闰盘；在胃肠道和输尿管，传递兴奋的丰要结构是缝隙连接）传递到周围的可兴奋细胞，使其产牛动作电位（ａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＡＰ）。在不予任何刺激的情况下，可产生ＳＡＰ是证明起搏细胞的最直接证据。起搏细胞的ＳＡＰ与其他可兴奋细胞ＡＰ的不同之处在于ＳＡＰ存在独特的４期自动去极化。众多研究已证实，超级化激活的内向电流（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ａｃｔｉｖａｔｅｄｉｎｗａｒｄｃｕｒｒｅｎｔ．Ｉｈ）是产生ＳＡＰ４期自动去极化的离子基础，是起搏细胞的特征电流【２引。
３．１．１ｍ概述：
１１１是指在膜片钳全细胞记录模式下，细胞膜钳制电位向超级化阶跃时，所记录到的内向电流。它于１９７９年首先被发现存在于兔心脏的窦房结细胞，由于其被激活方式与其他电流不同，Ｂｒｏｗｎ等称其为“ｆｕｎｎｙｃｕｒｒｅｎｔ”，简称Ｉ一２９】。随后在中枢和外周神元等其他可产生自发性兴奋性的细胞中也记录到了这种电流，为与心脏相区别，存在于心脏外其他组织的超级化内向电流被称为“ｑｕｅｅｒｃｕｒｒｅｎｔ”，简称ＩＱ［３０】。超级化激活的内向电流特征：１．由超级化激活，呈电压依赖性；２．由慢开慢关的电流组成。对ｍ的深入研究结果提示该电流对胃肠道ＩＣＣｓ、窦房结、普肯野氏纤维、神经元等细胞的兴奋起源和频率调控起着极其重要的作用。
３．１．２１１ｌ是起搏细胞的特征电流
①ＩＯ是胃肠道ＩＣＣｓ细胞、中枢及外周可记录到该电流的神经细胞的起搏电流，新鲜分离的小鼠小肠【３１】和狗近端结肠【３２】的ＩＣＣｓ均可记录到ＩＱ，细胞浴池液中加入３０ｍＭＺＤ７２２８选择性阻断ＩＱ后，ＩＣＣｓ的自发性动作电位消失，提示该电流为ＩＣＣｓ的起搏电流。丘脑皮层传播神经元，在缺少突触输入的情况下，仍可产生自发性节律性动作电位。该动作电位的上升支由Ｌ型Ｃａ电流组成，在动作电位的下降支，膜电位复极化到Ｌ型Ｃａ通道失活电压的时候，ＩＱ使细胞膜产生一缓慢的起博去极化，再次激活Ｌ型Ｃａ通道，引发下一次动作电位【３３】。脑干的下橄榄核神经元自发性动作电位产生机理与丘脑皮层传播神经元相同瞰ｌ。因此ＩＱ是上述两种神经元产生自发性动作电位的基础电流，选择性阻断ＩＱ将使得这些神经元的起博活动完全消失。
②Ｉｆ与心脏起搏，Ｉｆ发现以前，一种外向延迟钾电流（ｔｈｅｄｅｃａｙｏｆｔｈｅｄｅｃａｙｅｄＫｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）被认为是导致窦房结细胞舒张期自动去极化的主要电流【３习（１９５１年一１９７８年）。支持该理论的依据为：（１）该电流在膜电位去极化时激活，激活电压在窦房结细胞舒张期电压范围之内；（２）该电流反转电位与钾离子平衡电位相近；（３）该电流受儿茶酚胺调节，与交感神经刺激引起的心率加快有关。然而，７０年代末Ｉｆ的发现及后继相关研究表明上述理论是完全错误的。与以前理论相反，窦房结的起博电流并不是以前所认为的去极化激活的外向电流，而是超级化激活的内向电流【３６】；之前所记录到的外向电流是超级化激活的内向电流的补偿电流（内向电流引发的钾离子外流）ｐ１７１。Ｉｆ是是心脏窦房结起博电流的证据（图３－－９）：（１）Ｉｆ激活电压在舒张期电压范围之内【３８１；（２）在成年哺乳动物的心脏，表达Ｉｆ的窦房结和房室结细胞有自发性博动，不表达Ｉｆ的心房和心室１５
正常豚鼠膀胱ｃａｊａＩ样间质细胞形态、机能学研究
肌细胞无自发性博动【３９】；（３）在新生哺乳动物心脏的发育早期，Ｉｆ存在于心室肌细胞，此时心室肌细胞可记录到自发性动作电位；在发育成熟以后，Ｉｆ与自发性动作电位同时消失ｍ】。Ｉｆ在心脏窦房结自发性动作电位产生中的作用示意图Ｉｆ不仅对于心脏起博是必不可少的，它在交感和副交感神经的支配Ｉｆ不仪对于心脏起博是必不可少的，它在交感和副交感神经的支配下，通过细胞内ｃＡＭＰ途径介导的信号传导，可调控心脏的博动频率。在副交感神经的作用下，激活曲线向左移，减慢心率；在交感神经的作用下，激活曲线向右移，增加心率【４１１。早期关于心率调控的研究结果提示乙酰胆碱激活的钾电流（ＩＫ，Ａｃｈ）是胆碱能受体激活后减慢心率的主要机制。Ｉｆ同样受胆碱能神经支配，因此Ｉｆ也参与了胆碱能受体激活后心率减慢的过程【４２】。由于抑制Ｉｆ所需的乙酰胆碱浓度仅为抑制ＩＫ，Ａｃｈ所需浓度的１／２０，Ｉｆ被认为在该过程中起着主导作用。因为在不能产生自发性动作电位的组织记录不到ｍ，Ⅱｌ被认为是起博细胞的特征电流（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｃｅｍａｋｅｒｃｕｒｒｅｎｔ）
３．２成年豚鼠膀胱ＩＣＣｓ样细胞ｍ电流的记录
３．２．１电流特性研究应以新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞为研究对象
细胞的体外培养是单独研究细胞功能所常用的一种实验方法。但细胞在体外条件下生长，由于外环境的改变，培养时间过长或经过传代以后，其细胞特性将发生变化。对比研究胃肠道新鲜分离（贴壁后不久）和培养三天以后的ＩＣＣｓ表面膜抗原，发现后者ＫＩＴ、ａ．ＳＭ．Ａｃｆｉｎ和ＩＩ型血管活性肠肽受体（ＶＩＰ．２）染色均为阳性，而新鲜分离的ＩＣＣｓ仅ＫＩＴ染色为阳性，提示ＩＣＣｓ在体外长时间的培养过程中，其胞膜表面分子标记物将发生变化【４３１。在第二部分实验中我们对新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞行ＫＩＴ和ａ．ＳＭ．Ａｃｔｉｎ染色，提示用于膜片钳实验的新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞ＫＩＴ染色阳性，ａ－ＳＭ—Ａｃｔｉｎ染色为阴性。对新鲜分离的ＩＣＣｓ样细胞的电流特性研究结果可代表其在体情况。
３．２．２．ＩＣＣｓ样细胞在成年豚鼠膀胱可能具有起博功能
本实验在电流钳模式下，ＩＣＣｓ样细胞和逼尿肌细胞均未记录到自发性动作电位产生，其原因可能是膜片钳实验温度（２１℃）难以达到在体温度（３７℃）。理论上，离体实验条件应尽可能模拟在体情况，但随着实验温度的升高，全细胞模式下，细胞封接难度会大大增加，实验温度在３７℃时，细胞几乎难以形成巨阻封接。这就造成了本身具有产生ＳＡＰ能力的细胞在体外有时记录不到电位的自发性去极化。超级化激活的内向电流是起博细胞的特征电流，使得ｍ成为证实细胞具有起博功能的另一间接证据。本实验发现ＩＣＣｓ样细胞具有ｍ，而在相同模式下逼尿肌细胞无ｍ产生；Ｉｈ特异性阻断剂ＺＤ７２８８１４４Ｊ对ＩＣＣｓ样细胞ｍ有明显抑制作用，并呈剂量依赖性。ＩＣＣｓ样细胞存在有ｍ提示该类细胞在成年豚鼠膀胱可能具有起博作用。
３．３ＩＣＣｓ样细胞可成为临床治疗某些膀胱功能障碍性疾病的新靶点
本研究首次发现在膀胱的ＩＣＣｓ样细胞存在有起博特征电流，ＩＣＣｓ样细胞可能就是理论上存在于膀胱的起博细胞。膀胱逼尿肌具有神经源性和肌源性兴奋性，对于肌源性兴奋性理论中的重要组成部分一一膀胱起搏理论的认识和深入了解，具有重大的理论和