实验三 3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖
一、实验目的
1、掌握还原糖定量测定的原理和方法。 2、掌握分光光度计的使用方法。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单
糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖10257 RP麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验器材
1、实验仪器 1）恒温水浴锅 2）可见光分光光度计 3）电子天平 4）三角瓶（100ml ） 5）容量瓶（100ml ） 6）胶头滴管 7）移液管
2、实验材料 1）食用面粉
2）1 mg/ ml 葡萄糖标准液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在 8 0 ℃ 烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml 的容量瓶中，以馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
3）3, 5- 二硝基水杨酸试剂：将 6.3g 3, 5- 硝基水杨酸和 262ml 2mol/NaOH 溶液，加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000ml ，贮于棕色瓶中备用。
4）碘-碘化钾溶液：称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100 ml 蒸馏水中。 5）酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250ml 70 ％乙醇中。 6）6mol/L HCl 。 7）6mol/L NaOH 。
四、实验步骤
（一）制作葡萄糖标准曲线
取7支试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
管 号
1mg/mL葡萄糖标准液
（mL ）
0 1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水 （mL ） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
DNS （mL ） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
葡萄糖含量 （mg ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
光密度值 （OD 540nm ）
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min ，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL ，在分光光度计上进行比色。调波长540nm ，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg ）为横坐标，做出标准曲线。 （二）样品中还原糖和总糖含量的测定
1、样品中还原糖的提取：
准确称取 2g 食用面粉，放在 100ml 三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加 50ml 蒸馏水，搅匀，置于 5 0 ℃ 恒温水浴中保温 20min ，自然冷却后，定容至50ml 。静置后取上清液，即可作为还原糖待测液。 2、样品中总糖的水解和提取：
准确称取 1g 食用面粉，放在 100ml 的三角瓶中，加入 10ml 6mol/ LHCl 及 15ml 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解 30min, 取出水解液自然冷却后，加入 1 滴酚酞指示剂，以 6mol/ LNaOH 中和至微红色，定容至100ml ，混匀，作为总糖待测液。 3、显色和比色：
取 4 支 试管，编号，按下表所示的量操作。 管号
还原糖待测管号 ①
还原糖待测液（ml ） 总糖待测液（ml ）
2 0
② 2 0
I 0 1
总糖待测管号
Ⅱ 0 1
再分别向每支试管中加入1.5mlDNS ，摇匀，测定OD 值。
五、实验结果
1、绘制标准曲线
2、以管①、②的吸光度平均值和管 I 、Ⅱ的吸光度平均值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
六、注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。
七、思考题
1、可用不同材料，以比较含糖量的差异。 2、在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？
实验三 3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖
一、实验目的
1、掌握还原糖定量测定的原理和方法。 2、掌握分光光度计的使用方法。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单
糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖10257 RP麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验器材
1、实验仪器 1）恒温水浴锅 2）可见光分光光度计 3）电子天平 4）三角瓶（100ml ） 5）容量瓶（100ml ） 6）胶头滴管 7）移液管
2、实验材料 1）食用面粉
2）1 mg/ ml 葡萄糖标准液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在 8 0 ℃ 烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml 的容量瓶中，以馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
3）3, 5- 二硝基水杨酸试剂：将 6.3g 3, 5- 硝基水杨酸和 262ml 2mol/NaOH 溶液，加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000ml ，贮于棕色瓶中备用。
4）碘-碘化钾溶液：称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100 ml 蒸馏水中。 5）酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250ml 70 ％乙醇中。 6）6mol/L HCl 。 7）6mol/L NaOH 。
四、实验步骤
（一）制作葡萄糖标准曲线
取7支试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
管 号
1mg/mL葡萄糖标准液
（mL ）
0 1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水 （mL ） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
DNS （mL ） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
葡萄糖含量 （mg ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
光密度值 （OD 540nm ）
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min ，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL ，在分光光度计上进行比色。调波长540nm ，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg ）为横坐标，做出标准曲线。 （二）样品中还原糖和总糖含量的测定
1、样品中还原糖的提取：
准确称取 2g 食用面粉，放在 100ml 三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加 50ml 蒸馏水，搅匀，置于 5 0 ℃ 恒温水浴中保温 20min ，自然冷却后，定容至50ml 。静置后取上清液，即可作为还原糖待测液。 2、样品中总糖的水解和提取：
准确称取 1g 食用面粉，放在 100ml 的三角瓶中，加入 10ml 6mol/ LHCl 及 15ml 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解 30min, 取出水解液自然冷却后，加入 1 滴酚酞指示剂，以 6mol/ LNaOH 中和至微红色，定容至100ml ，混匀，作为总糖待测液。 3、显色和比色：
取 4 支 试管，编号，按下表所示的量操作。 管号
还原糖待测管号 ①
还原糖待测液（ml ） 总糖待测液（ml ）
2 0
② 2 0
I 0 1
总糖待测管号
Ⅱ 0 1
再分别向每支试管中加入1.5mlDNS ，摇匀，测定OD 值。
五、实验结果
1、绘制标准曲线
2、以管①、②的吸光度平均值和管 I 、Ⅱ的吸光度平均值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
六、注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。
七、思考题
1、可用不同材料，以比较含糖量的差异。 2、在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？