降低皮肤中的自由基可以使皮肤变得光滑
Control of free radicals for smoother skin
Mio Murakami，Shuichi Yamana--Vitamin BioResearch Corporation,Japan
文献来源：Published January 2011 personal care
翻译：吕晓滕
摘要
油溶性富勒烯已经被维他命C60公司开发出来了，这个公司是活性成分研究的先驱，专门研究富勒烯。在用油溶性的富勒烯进行小鼠体外实验的时候，发现其能够显著的降低小鼠前脂肪细胞和淋巴瘤细胞培养体系中的超氧阴离子自由基的含量，并可以保护细胞免受伤害或由2,4-壬二烯醛诱导的细胞凋亡。另外，我们招募了23名女性志愿者对油溶性富勒烯混合霜进行了长达八个星期的配对双盲研究，结果显示与安慰剂相比，1%的油溶性富勒烯混合霜与安慰剂相比能够显著降低皱纹区的比例，而没有任何副作用。这些结果显示油溶性富勒烯能够能够降低皮肤中自由基的含量，并防止皮肤形成皱纹。
衰老和长时间的紫外线照射能够降低皮肤的抗氧化能力，皮肤中会因为产生脂质过氧化物和活性羰基化合物，而生成大量的活性氧碎片。大量的报道显示，这些活性分子不仅能够导致皮肤老化，产生色素沉积，皱纹，斑疹等，还能导致一些皮肤病，如一些恶性皮肤肿瘤，皮肤脉管炎和痤疮等。表1列举了一些由自由基引起的皮肤细胞细胞学和组织学上的改变以及由此导致的皮肤老化问题，如皱纹的形成和色素的沉积等等。如今，自由基导致衰老的理论已经成为最为大众接受的衰老理论。
表1 由光老化和衰老导致的氧化应激结果
人们相信局部的抗氧化剂能够有效的清除皮肤组织中的自由基和活性氧。以下的点就是在开发这样的皮肤护理配方时应该优先考虑的。首先，产品的稳定性至关重要。抗氧化体系是一个非常不稳定的体系，可能会被氧化，这就要求他们在被皮肤吸收之前是一种没有活性的状态；其次，抗氧化剂必须能够被皮肤吸收，并且以活性形式到达目标组织，并且能够在目标组织中存在较长的时间易产生预期的效果。
虽然很多化妆品公司在很早以前就已经开发出了许多新奇的配方来克服这两点，但是只有少数化妆品公司通过临床控制实验来研究抗氧化剂在延缓皮肤衰老方面所发挥的作用。 什么是富勒烯
富勒烯跟钻石一样，是一种碳的同素异形体（只有一种元素构成），这是化学上对由60个碳原子组成的多面体的一个统称，一个C60分子的直径大约为0.7nm 的，截面结构类似足球的二十面体，富勒烯由Droto 博士于1985年发现，那时候他正在英国苏赛克斯大学研究恒星分子（太空中的示踪物质），美国莱斯大学的Curl 和Smalley 博士也几乎同时发现了富勒烯，那时候他们正在研究光谱学。这三位科学家由于发现了富勒烯并阐明了富勒稀的分子结构而获得了1996年的诺贝尔化学奖。早在1991年，一片论文的science 杂志上
的一篇论文就震惊了整个生命科学界：据报道富勒烯能够降低自由基的含量并解除由自由基造成的毒害作用。
维他命C60生物技术公司建立于2003年，它是第一家以商业化应用富勒烯生物功能为目的的公司。在我们的研究中有一个聚乙烯吡咯烷酮溶解性的富勒烯（PVP-富勒烯）项目，并不表现出铜离子或亚铁离子的助氧化作用。另外, 据报道抗坏血酸在UV 照射48h 后仍然可以继续产生抗坏血酸自由基，而使用PVP-富勒烯可以消除抗坏血酸自由基。这些数据显示，富勒烯在使用48小时候仍然具有抗氧化活性。
尽管富勒烯在烃（如角鲨烯）中的溶解度很低，不过我们还是成功的将富勒烯制成了稳定的植物角鲨烷溶液，并由此开发出了脂溶性富勒烯。
为了进一步评估富勒烯通过清除自由基来保护皮肤的效果，我们进行了一次体外实验和临床试验来检测富勒烯是否具有去皱的效果（现在称为抗衰老活性物质）。
体外试验
抗衰老活性物质的抗氧化活性
为了评价潜在的抗衰老物质的活性，我们通过改良后的氮蓝四唑比色法（NBT ）来进行了降低抗超氧阴离子自由基的实验，超氧阴离子自由基将NBT 还原成为深蓝色的，不能溶解的甲臜然后再610nm 处测吸光值。人们发现共同培养的OP9细胞（小鼠前脂肪细胞）和U937鼠单核细胞能够诱导超氧阴离子自由基前体的产生。抗氧化活性物质能够显著的降低OP9细胞中的超氧阴离子自由基的浓度（1%-8%），而空白对照（角鲨烯）则没有这种效果。结果见图1
抗氧化活性物质阻止细胞损伤
2,4-壬二烯醛毒性很大，它是不饱和脂肪族醛氢过氧化物自动氧化的次级产物，其可以诱导细胞损伤。我们通过WST 测试技术检测了细胞的活力，这种技术是基于线粒体功能构建起来的。
人们发现2,4-壬二烯醛能够损害人类的角化细胞的细胞膜并降低细胞的活性。抗衰老活性物质提前5小时使用抗衰老活性物质能够阻止2,4-壬二烯醛对细胞膜的伤害并提高细胞的活力。结果见图2。
利用末端转移酶dUTP 缺口末端标记技术来探测DNA 碎片，这是凋亡细胞的标志性特征。2,4-壬二烯醛也能够诱导形成DNA 碎片，如图3b 所示。另外，抗衰老活性物质能够比2,4-壬二烯醛提前5小时发挥作用，从而抑制细胞凋亡。见图
3d
结果显示抗衰老活性物质在皮肤细胞中扮演自由基清除者的角色，能够保护皮肤细胞，比如其中的线粒体和DNA ，使其免受自由基的损伤。
通过临床试验来评估抗衰老活性物质的抗皱纹作用
在体外试验的基础上，我们开始评估抗衰老活性物质是否具有抗皱纹的作用，结果见图4。23位开始时具有2--3道皱纹的妇女，用1%的抗衰老活性物质面霜进行了8周的双盲配对实验。在这8周的时间里，这些妇女半边脸使用1%抗衰老活性物质面霜，另外半边脸使用不含抗衰老活性物质的面霜。然后通过的皮肤复制分析的方法来评估眼角鱼尾纹的变化。在这个分析中，皱纹区的百分比与超过平均深度的皱纹通过对复制皮肤表面目标区的二维分析来计算，方法如前所述。
结果
皮肤复制分析图显示抗衰老活性物质面霜能够减少皱纹，使用抗衰老活性物质面霜4周和8周后，皱纹区所占的比例额明显低于刚开始时的比例，而使用安慰剂的皱纹区域所占的比例明显上升。（P=0.021，见图5）
使用抗衰老活性物质面霜的皱纹深度也明显降低，而使用安慰剂的则明显变得更深。在0--8周的使用过程中，使用抗氧化活性物质者的皱纹深度有下降的趋势。并且比使用安慰
剂者多出一半多（见图6）。
所有的受试者都被要求填一张调查问卷，上面是关于抗衰老活性物质面霜使用感觉，效果以及受试者个人信息的问题。在整个测试期间没有人出现严重的不良反应。
在测试期间出现的几次不适事件都是由于受试者本人原因造成的，而医生参与了整个测试过程，并认为在测试过程中出现的所有的不良反应都是轻微的。在整个测试过程中总共出现了5起不良反应，其中两起皮肤粗糙，一起油性皮肤，两起丘疹，我们认为，这些症状的出现与使用抗衰老活性物质面霜之间并不存在必然或可能的关系。并且出现这些不良反应都是瞬间的。医生排除了使用抗衰老活性物质面霜与不良反应之间存在因果关系的可能性。因此，医生证明使用抗衰老活性物质面霜不会引起任何的安全问题。
受试者并不知道他们哪半边脸用的是抗衰老活性物质面霜。尽管如此，我们还是在调查问卷中向受试者暗示，他们使用了抗衰老活性物质面霜，这种面霜的效果是安慰剂的6倍。于是受试者使用了抗衰老活性物质面霜的半边脸有以下感觉：干燥降低（4），皱纹形成减缓（2），皮肤变白（1），皮肤质感上升（1），减少化妆恶化（1）（见图7）。而在使用安慰剂的半边脸则没有这样的感觉。
抗衰老活性物质的安全性
前面我们评估了抗衰老活性物质面霜的主要成分---生物富勒烯的安全性。我们发现在所有的测试中生物富勒烯用于化妆品都是安全的。
然后，然后我们还进行了单剂量口服毒性试验，初级皮肤刺激试验，累积皮肤刺激实验，眼睛刺激试验，皮肤敏感性试验，皮肤光敏感试验，接触光毒性试验，微生物回复突变实验，染色体畸变试验，以及人类皮肤过敏性试验，这些都是在日本要求进行的准药学实验。在所有这些实验中，只有在将生物富勒烯粉末撒到兔子眼睛中的时候才会观察到轻微的不良反应（瞬间结膜发红和角膜上皮缺陷）。
我们也曾经报道过，抗衰老活性物质不存在任何严重的生物毒性效应，比如光激发细胞毒性和细菌回复突变效应。另外，抗氧化活性物质在使用后24h 还可以通过角质层渗透进入表皮，但不能进入人类皮肤活检标本的真皮。这表明富勒烯的毒性不论何时都不会侵害到人体内部器官。
根据我们的调查，到2010年12月，我们开发的含有富勒烯的化妆品原料已经应用在500
多种化妆品中，所有的化妆品生产商都对我们的产品感到满意。因此，我们相信我们的产品是安全的。
结论
油溶性富勒烯可以防止皮肤受到自由基引起的伤害，并可作为一种活性物质添加到抗皱纹的化妆品中。我们相信油溶性富勒烯能够从面霜中扩散到表皮之中，从而保护保护角质细胞免受紫外线，脂质氢过氧化物，活性羰基化合物的伤害，并维持细胞正常的分化与代谢，因此油溶性富勒烯可以减轻已经存在的皱纹，并预防生成新的皱纹。油溶性富勒烯可以应用于一系列的抗皱纹配方中，如面霜，凝胶以及液体化妆品中。虽然油溶性富勒烯抗氧化作用的发挥不是太快，但持续的时间很长。富勒烯能够长时间的保护皮肤免于衰老，也正是这个特性，使得它容易与其他的抗氧化产品区分开。
降低皮肤中的自由基可以使皮肤变得光滑
Control of free radicals for smoother skin
Mio Murakami，Shuichi Yamana--Vitamin BioResearch Corporation,Japan
文献来源：Published January 2011 personal care
翻译：吕晓滕
摘要
油溶性富勒烯已经被维他命C60公司开发出来了，这个公司是活性成分研究的先驱，专门研究富勒烯。在用油溶性的富勒烯进行小鼠体外实验的时候，发现其能够显著的降低小鼠前脂肪细胞和淋巴瘤细胞培养体系中的超氧阴离子自由基的含量，并可以保护细胞免受伤害或由2,4-壬二烯醛诱导的细胞凋亡。另外，我们招募了23名女性志愿者对油溶性富勒烯混合霜进行了长达八个星期的配对双盲研究，结果显示与安慰剂相比，1%的油溶性富勒烯混合霜与安慰剂相比能够显著降低皱纹区的比例，而没有任何副作用。这些结果显示油溶性富勒烯能够能够降低皮肤中自由基的含量，并防止皮肤形成皱纹。
衰老和长时间的紫外线照射能够降低皮肤的抗氧化能力，皮肤中会因为产生脂质过氧化物和活性羰基化合物，而生成大量的活性氧碎片。大量的报道显示，这些活性分子不仅能够导致皮肤老化，产生色素沉积，皱纹，斑疹等，还能导致一些皮肤病，如一些恶性皮肤肿瘤，皮肤脉管炎和痤疮等。表1列举了一些由自由基引起的皮肤细胞细胞学和组织学上的改变以及由此导致的皮肤老化问题，如皱纹的形成和色素的沉积等等。如今，自由基导致衰老的理论已经成为最为大众接受的衰老理论。
表1 由光老化和衰老导致的氧化应激结果
人们相信局部的抗氧化剂能够有效的清除皮肤组织中的自由基和活性氧。以下的点就是在开发这样的皮肤护理配方时应该优先考虑的。首先，产品的稳定性至关重要。抗氧化体系是一个非常不稳定的体系，可能会被氧化，这就要求他们在被皮肤吸收之前是一种没有活性的状态；其次，抗氧化剂必须能够被皮肤吸收，并且以活性形式到达目标组织，并且能够在目标组织中存在较长的时间易产生预期的效果。
虽然很多化妆品公司在很早以前就已经开发出了许多新奇的配方来克服这两点，但是只有少数化妆品公司通过临床控制实验来研究抗氧化剂在延缓皮肤衰老方面所发挥的作用。 什么是富勒烯
富勒烯跟钻石一样，是一种碳的同素异形体（只有一种元素构成），这是化学上对由60个碳原子组成的多面体的一个统称，一个C60分子的直径大约为0.7nm 的，截面结构类似足球的二十面体，富勒烯由Droto 博士于1985年发现，那时候他正在英国苏赛克斯大学研究恒星分子（太空中的示踪物质），美国莱斯大学的Curl 和Smalley 博士也几乎同时发现了富勒烯，那时候他们正在研究光谱学。这三位科学家由于发现了富勒烯并阐明了富勒稀的分子结构而获得了1996年的诺贝尔化学奖。早在1991年，一片论文的science 杂志上
的一篇论文就震惊了整个生命科学界：据报道富勒烯能够降低自由基的含量并解除由自由基造成的毒害作用。
维他命C60生物技术公司建立于2003年，它是第一家以商业化应用富勒烯生物功能为目的的公司。在我们的研究中有一个聚乙烯吡咯烷酮溶解性的富勒烯（PVP-富勒烯）项目，并不表现出铜离子或亚铁离子的助氧化作用。另外, 据报道抗坏血酸在UV 照射48h 后仍然可以继续产生抗坏血酸自由基，而使用PVP-富勒烯可以消除抗坏血酸自由基。这些数据显示，富勒烯在使用48小时候仍然具有抗氧化活性。
尽管富勒烯在烃（如角鲨烯）中的溶解度很低，不过我们还是成功的将富勒烯制成了稳定的植物角鲨烷溶液，并由此开发出了脂溶性富勒烯。
为了进一步评估富勒烯通过清除自由基来保护皮肤的效果，我们进行了一次体外实验和临床试验来检测富勒烯是否具有去皱的效果（现在称为抗衰老活性物质）。
体外试验
抗衰老活性物质的抗氧化活性
为了评价潜在的抗衰老物质的活性，我们通过改良后的氮蓝四唑比色法（NBT ）来进行了降低抗超氧阴离子自由基的实验，超氧阴离子自由基将NBT 还原成为深蓝色的，不能溶解的甲臜然后再610nm 处测吸光值。人们发现共同培养的OP9细胞（小鼠前脂肪细胞）和U937鼠单核细胞能够诱导超氧阴离子自由基前体的产生。抗氧化活性物质能够显著的降低OP9细胞中的超氧阴离子自由基的浓度（1%-8%），而空白对照（角鲨烯）则没有这种效果。结果见图1
抗氧化活性物质阻止细胞损伤
2,4-壬二烯醛毒性很大，它是不饱和脂肪族醛氢过氧化物自动氧化的次级产物，其可以诱导细胞损伤。我们通过WST 测试技术检测了细胞的活力，这种技术是基于线粒体功能构建起来的。
人们发现2,4-壬二烯醛能够损害人类的角化细胞的细胞膜并降低细胞的活性。抗衰老活性物质提前5小时使用抗衰老活性物质能够阻止2,4-壬二烯醛对细胞膜的伤害并提高细胞的活力。结果见图2。
利用末端转移酶dUTP 缺口末端标记技术来探测DNA 碎片，这是凋亡细胞的标志性特征。2,4-壬二烯醛也能够诱导形成DNA 碎片，如图3b 所示。另外，抗衰老活性物质能够比2,4-壬二烯醛提前5小时发挥作用，从而抑制细胞凋亡。见图
3d
结果显示抗衰老活性物质在皮肤细胞中扮演自由基清除者的角色，能够保护皮肤细胞，比如其中的线粒体和DNA ，使其免受自由基的损伤。
通过临床试验来评估抗衰老活性物质的抗皱纹作用
在体外试验的基础上，我们开始评估抗衰老活性物质是否具有抗皱纹的作用，结果见图4。23位开始时具有2--3道皱纹的妇女，用1%的抗衰老活性物质面霜进行了8周的双盲配对实验。在这8周的时间里，这些妇女半边脸使用1%抗衰老活性物质面霜，另外半边脸使用不含抗衰老活性物质的面霜。然后通过的皮肤复制分析的方法来评估眼角鱼尾纹的变化。在这个分析中，皱纹区的百分比与超过平均深度的皱纹通过对复制皮肤表面目标区的二维分析来计算，方法如前所述。
结果
皮肤复制分析图显示抗衰老活性物质面霜能够减少皱纹，使用抗衰老活性物质面霜4周和8周后，皱纹区所占的比例额明显低于刚开始时的比例，而使用安慰剂的皱纹区域所占的比例明显上升。（P=0.021，见图5）
使用抗衰老活性物质面霜的皱纹深度也明显降低，而使用安慰剂的则明显变得更深。在0--8周的使用过程中，使用抗氧化活性物质者的皱纹深度有下降的趋势。并且比使用安慰
剂者多出一半多（见图6）。
所有的受试者都被要求填一张调查问卷，上面是关于抗衰老活性物质面霜使用感觉，效果以及受试者个人信息的问题。在整个测试期间没有人出现严重的不良反应。
在测试期间出现的几次不适事件都是由于受试者本人原因造成的，而医生参与了整个测试过程，并认为在测试过程中出现的所有的不良反应都是轻微的。在整个测试过程中总共出现了5起不良反应，其中两起皮肤粗糙，一起油性皮肤，两起丘疹，我们认为，这些症状的出现与使用抗衰老活性物质面霜之间并不存在必然或可能的关系。并且出现这些不良反应都是瞬间的。医生排除了使用抗衰老活性物质面霜与不良反应之间存在因果关系的可能性。因此，医生证明使用抗衰老活性物质面霜不会引起任何的安全问题。
受试者并不知道他们哪半边脸用的是抗衰老活性物质面霜。尽管如此，我们还是在调查问卷中向受试者暗示，他们使用了抗衰老活性物质面霜，这种面霜的效果是安慰剂的6倍。于是受试者使用了抗衰老活性物质面霜的半边脸有以下感觉：干燥降低（4），皱纹形成减缓（2），皮肤变白（1），皮肤质感上升（1），减少化妆恶化（1）（见图7）。而在使用安慰剂的半边脸则没有这样的感觉。
抗衰老活性物质的安全性
前面我们评估了抗衰老活性物质面霜的主要成分---生物富勒烯的安全性。我们发现在所有的测试中生物富勒烯用于化妆品都是安全的。
然后，然后我们还进行了单剂量口服毒性试验，初级皮肤刺激试验，累积皮肤刺激实验，眼睛刺激试验，皮肤敏感性试验，皮肤光敏感试验，接触光毒性试验，微生物回复突变实验，染色体畸变试验，以及人类皮肤过敏性试验，这些都是在日本要求进行的准药学实验。在所有这些实验中，只有在将生物富勒烯粉末撒到兔子眼睛中的时候才会观察到轻微的不良反应（瞬间结膜发红和角膜上皮缺陷）。
我们也曾经报道过，抗衰老活性物质不存在任何严重的生物毒性效应，比如光激发细胞毒性和细菌回复突变效应。另外，抗氧化活性物质在使用后24h 还可以通过角质层渗透进入表皮，但不能进入人类皮肤活检标本的真皮。这表明富勒烯的毒性不论何时都不会侵害到人体内部器官。
根据我们的调查，到2010年12月，我们开发的含有富勒烯的化妆品原料已经应用在500
多种化妆品中，所有的化妆品生产商都对我们的产品感到满意。因此，我们相信我们的产品是安全的。
结论
油溶性富勒烯可以防止皮肤受到自由基引起的伤害，并可作为一种活性物质添加到抗皱纹的化妆品中。我们相信油溶性富勒烯能够从面霜中扩散到表皮之中，从而保护保护角质细胞免受紫外线，脂质氢过氧化物，活性羰基化合物的伤害，并维持细胞正常的分化与代谢，因此油溶性富勒烯可以减轻已经存在的皱纹，并预防生成新的皱纹。油溶性富勒烯可以应用于一系列的抗皱纹配方中，如面霜，凝胶以及液体化妆品中。虽然油溶性富勒烯抗氧化作用的发挥不是太快，但持续的时间很长。富勒烯能够长时间的保护皮肤免于衰老，也正是这个特性，使得它容易与其他的抗氧化产品区分开。