生化分析
二．本课的重要性
1．二十世纪――物理的世纪 一．本课名称： 生物化学分析 分析生物化学
原子理论、量子力学、相对论
原子能、半导体、计算机、激光技术
2．分析化学——“分析科学”
多学科综合性交叉学科：
物理、电子、光学技术、计算机、生物、材料等
分析化学中物理内容越来越多：紫外、红外、核磁、
质谱、色谱、原子吸收、发射、荧光
纯化学？：四大平衡
“不管你信不信，化学正在走出分析化学” “不管你信不信，化学正在走回分析化学”
3．二十一世纪――生命科学世纪
二十世纪末（如基因组计划）已经能看出生命科学世纪的苗头：蛋白组、基因组、转基因、克隆
生物体――神奇之地，充满奥妙、未解之谜：自组织、人与机器人的对比
人类广阔的未知领域越来越集中于与生物有关的领域 趋势
4．新世纪的分析化学：
应用领域：工业、农业、采矿、冶金、环境、医药、卫生、食品，与生物有关的研究内容比例增加
原因：简单的问题解决了
生物体因其复杂性——未解之谜
分析化学向生物领域靠拢
生物科学离不了分析化学
分析化学在生命科学领域中，起到“眼睛”的重要作用
分析化学的作用举例：
（1）基因组计划
90年订计划 30亿＄ 15年
完成全部人类基因组基因测序
98年中期检查 完成6％
原因：不重视测序方法研究
经典方法：平板电泳速度慢 分析方法成为瓶颈
对策：投资 1亿＄用于方法研究 2000年基本完成（提前5年）
所用技术阵列毛细管电泳测序技术 （PE 公司）
Dovichi －分析化学技术
Kambara——日立公司
Nobel化学奖？
（2） 医药领域
医院临床检验很大一部分是生化分析
全世界：十亿次化验/天
（3） 人工胰 治疗糖尿病
传感器监测血糖变化是关键，分析仪器，关键作用
（4） 2002 Nobel化学奖 田中耕一 大分子质谱
生命科学
复杂、充满未知——充满机遇、充满挑战、大有可为
“生命分析化学” 重要作用，关键作用
5．学习本课的意义
很多分析化学专业同学毕业论文工作与生物有关
三． 本课主讲人
分析化学背景
药物分析学博士
自学生物化学知识
工作中接触过一些生化内容
能力有限，共同学习，希望有所启示
四．本课教材
找不到合适
原因：1．领域发展很快，来不及编写
2．老教材
重分析轻生化：=仪器分析 生化味淡
重生化轻分析：叙述多（操作规程），未与分析化学相管关连，生化思路：“不讲理”，看不懂，用不上
英文教材：还可以，也不是很理想，没有其它办法 ——分两部分 ――前部 分析方法
――后部 生化物质的测定
——优点：全、新、简 按分析化学思路，生化味浓 ——缺点：英文；有些未讲到， 要参考其它书（生物化学、FIA ）
——内容：不全讲，时间不够
——酶分析、免疫分析，氨基酸，蛋白质、核酸
第一章 酶分析法
Enzyme assay methods
第一节 酶学基础
一． 定义:酶是由生物体活细胞生成的具有选择性催化能力的蛋白质
二． 作用：生物催化剂
生长. 发育. 繁殖 合成. 分解. 氧化. 还原
如果没有酶, 生命就不复存在！
为什么？有机反应：加热，加压，副反应多，时间长
三. 特点:
1. 催化效率高
比非酶催化剂通常高10-10
如过氧化氢酶 催化H 2O 2分解 1min 5×10mol >10倍 Fe3+ 610613催化H 2O 2分解 1min 6×10mol -4
2. 高度专一性（选择性）
酶的催化作用物—底物（substrate ）
（1） 相对专一性——对一类物质底物, 如淀粉水解酶. 氨
基酸氧化酶
（2） 绝对专一性---一对一, 单一底物. 如葡萄糖氧化酶
（3） 立体专一性---对立体结构, 立体结构底物, 如L-氨基
酸氧化酶,L 型,D 型
3. 酶催化反应条件温和
通常:常温. 常压, 近中性
4. 酶催化活性受多种因素调控
归纳：催化特点:高效, 专一, 温和, 可调
四. 化学组成与结构
1. 组成
酶
= 酶蛋白 + 辅助因子辅基
conjugated protein cofactor
有催化活性 无 无
2. 结构
蛋白酶-蛋白质. （氨基酸-肽健-多肽-蛋白质）分子量>10000 真正起催化作用的----酶的活性中心, 体积很小
十几——几十氨基酸残基
五. 酶的催化机理-----至今尚未完全清楚
1．酶的基本催化机理---降低反应活化能
2．催化过程:
酶活性中心+底物---酶—底物中间复合物导致反应加速 活性中心（凹区）
结合部位---专一结合作用
催化部位---催化作用
——如何催化： 应力变形效应
诱导电荷变化效应 浓集定向效应
催化反应式 酶 底物 复合物 产物
钥匙一锁模型
六. 分类.
按催化反应类型
1. 氧化还原酶（Oxidoreductases ） H.O.电子转移
2. 转移酶（Transferases ）官能团转移
3. 水解酶（Hydrolases ）AB+H2O=AOH+BH
4. 裂合酶（Lyase ）[Laieis]专基因或双健
5. 异构酶（lsomerases ）同分异构互变
6. 连接酶（Ligases ）
七. 命名
1. 习惯命名 葡萄糖氧化酶, 乳酸脱氢酶, 胃蛋白酶（水解酶）
2. 国际命名. 不会有重名
1961,国际酶学会议
如:L-氨基酸氧化酶----EC1.4.3.2
八. 有关酶活性的基础知识
（一） 酶活性的概念
1. 定义
酶活性 = 酶的催化活性
= 催化能力
=（催化）酶促反应速度
= 单位时间底物减少或产物增加
即:酶活性高---催化能力强 定性表达
酶活性低---催化能力弱
2. 酶活性单位 人为规定的量化单位
① 惯用单位
方法作者, 自己规定或应用传统
——特定条件下, 单位时间生成一定量产物
——特点:不归一, 不同酶之间难以比较
② 国际单位（International Unit,IU）
1961年，国际生化学会酶学委员会建议:在规定的实验条
件下, 每分钟催化1µmol 底物的酶量为1IU 。
25℃，最适pH ，底物浓度[S]
1965年，规定25---30℃ 1972年取消温度要求
1976年，在特定条件下（specified condition），每分
钟转化1µmol 底物的酶量为1IU 。 （较普遍的定义）
③1972年， 国际酶学委员会; 新单位 Katal（催量） 在最适条件下每秒钟催化1 mol 底物发生反应酶量。 单位太大, 常用 µkatal
1 katal=60×10IU
1 IU=1/60 µkatal
逐步过渡
3. 酶的比活性（specific activity）
—对酶试剂而言, 单位质量蛋白质（mg ）所具有的酶活性 —(IU/mg)
—衡量酶试剂纯度的指标
—比活性下降, 纯度下降
4. 周转数（turnover number）
——单位时间内每分子酶转换底物的分子数
—一一般酶周转数50-105 min 1-2个/s
——最高碳酸酶 每秒10个
——理想的酶活性指标
5．酶含量
——实际浓度 摩尔mol/L 质量g/L
——活性浓度 IU/L特点:不管实际浓度含量, 只看最后催化效果
——示例: 1g/L酶1min 催化1µmol 底物
5-1 6
100g/L酶1min 催化100µmol 底物
——同一种酶 同样mol/L应有同样IU/L, mol/L增一倍,IU/L增一倍
——反过来不一定, IU/L相同, 不一定mol/L相同，可能相差很远 .由IU/L反推浓度不可
——理想情况:知摩尔, 质量浓度,
又知单分子酶的催化活性（周转数）
比较不同酶的活性单位
① 酶活性单位目的:
A:反应速度的度量
纯粹的反应速度度量---周转数
单位量酶, 在单位时间内. 催化的底物量 B:酶量的度量
② 酶的含量
A（理论） mol/l ,g/l
B（实际）IU/L U/L 含量以每g/ml酶制剂含多少个活性单位表示
C（酶制剂）IU/g U/g
酶量----通过酶活性间接表示出来，
酶的作用效果
③ 原因:目前活性浓度占主导, 摩尔质量浓度不常见,
——理由：酶蛋白难分离, 难定量, 难纯化制备
④ 注意: 酶分析法中，酶的含量测定=酶的活性测定, ——至少目前是如此
⑤由此, 引伸——生化分析与传统分析化学不同点
分析化学---标准溶液, 分析纯试剂
生物化学---生化试剂制剂 混合物 因分离困难
（要求）需要起作用的起作用, 不需要的不干扰
（二）影响酶活性（反应速度）的因素
1. 温度, 影响较大 两个因素起作用
① 升温——加速反应（增加分子运动）
② 升温——酶热变性失活
规律:10----30---40----50-----60----80----100 最适范围 开始变性 不可逆变性 （但不绝对）
100
80
R e l a t i v e A c t i v i t y (%) 6040
20
O Temperature C
2. 酸度pH
① pH 过高过低，蛋白质变性失活
② pH 中间部分，改变酶或底物解离状态
一般最适pH 在4.5---8
例外：胃蛋白酶pH 1.5 盐酸环境，仍具酶活性
3. 底物浓度----米氏方程
三阶段 近一级动力学——近似正比—[s]不足
混合动力学——正变—[s]稍过
近零级动力学——近不变—[s]过量
搬运工原理
一级动力学 正比 有多少[s]反应多少
混合动力学 正变 有多少[s]反应多少 s有点多 零级动力学 不变 有多少[s]反应多少 s足够. 过多
① 米氏方程 酶促反应速度----底物浓度关系曲线 V m —最大反应速度
Km —米氏常数，1/2Vm 对应的
[s]
产物 1913 Michaelis and Menten
V=Vm [s]/Km +[s] 米氏方程 米曼方程
反应速度----底物浓度 定量关系 ② 米氏常数 k m
—酶的特征常数 不同酶, k m 不同 —表示酶与底物的亲和力----物理意义
km 下降, 两者亲和力上升，反应速度上升 —实用意义:
A确定底物浓度
B不同酶鉴别依据
③ K m Vm 测定
求得一系列[s]---v数据
多种方法求得K m Vm
4. 激活剂activator
①定义:能提高酶活性的物质, 为激活剂
②种类:（1）无机离子:K Na Ca Mg Zn Fe H
（2）有机物:半胱氨酸 （看具体情况）
5.抑制剂inhibitor
①定义:能降低酶活性, 但并不引起酶蛋白变性的物质, 为抑制剂
②分类:可逆抑制剂—结合可逆, 可通过渗析可恢复
不可逆抑制剂—与酶蛋白共价结合, 不能通过渗析 恢复
③机理:
（1）竞争性抑制作用 competitive inhibition
抑制剂与底物结构相似, 不破坏酶，与底物竞争酶的活性点位
V m 不变, Km 增加
例:
二氢叶酸合成酶——底物：对氨基苯甲酸
＋＋2＋2＋2＋2＋＋
二氢叶酸——细菌生长所需 ——人体亦需要，但不能自身合成，只能由外 界获得
磺胺（药物）——结构与对氨基苯甲酸相似，竞争抑制 剂，阻断细菌生长；人体不需要此酶， 因而药物无害
（2）非竞争抑制作用 non-competitive inhibition
抑制剂与底物结构不同, 结合点位不同, 但S-E-I 结合后不能分解，（ V m 变, K m 不变）
（3）反竞争抑制作用 uncompetitive inhibition （V m 和 K m 齐下降）
④常见抑制剂
（1）有机汞, 有机砷, 抑制合巯基酶
（2）有机磷, （农药）抑制乙酰胆碱酯酶 催化乙酸胆碱（神经递质）水解
害虫体内乙酰胆碱如不能去除持续兴奋
（3）重金属 Ag Cu Hg Pb＋2＋2＋2＋
（4）氰化物 CO 生成络合物抑制
（5）药物 磺胺，青霉素
青霉素的作用：竞争抑制制造细菌细胞壁成份的酶 细菌不能合成完整细胞壁
人体没有合成细胞壁问题, 因而无害
生化分析
二．本课的重要性
1．二十世纪――物理的世纪 一．本课名称： 生物化学分析 分析生物化学
原子理论、量子力学、相对论
原子能、半导体、计算机、激光技术
2．分析化学——“分析科学”
多学科综合性交叉学科：
物理、电子、光学技术、计算机、生物、材料等
分析化学中物理内容越来越多：紫外、红外、核磁、
质谱、色谱、原子吸收、发射、荧光
纯化学？：四大平衡
“不管你信不信，化学正在走出分析化学” “不管你信不信，化学正在走回分析化学”
3．二十一世纪――生命科学世纪
二十世纪末（如基因组计划）已经能看出生命科学世纪的苗头：蛋白组、基因组、转基因、克隆
生物体――神奇之地，充满奥妙、未解之谜：自组织、人与机器人的对比
人类广阔的未知领域越来越集中于与生物有关的领域 趋势
4．新世纪的分析化学：
应用领域：工业、农业、采矿、冶金、环境、医药、卫生、食品，与生物有关的研究内容比例增加
原因：简单的问题解决了
生物体因其复杂性——未解之谜
分析化学向生物领域靠拢
生物科学离不了分析化学
分析化学在生命科学领域中，起到“眼睛”的重要作用
分析化学的作用举例：
（1）基因组计划
90年订计划 30亿＄ 15年
完成全部人类基因组基因测序
98年中期检查 完成6％
原因：不重视测序方法研究
经典方法：平板电泳速度慢 分析方法成为瓶颈
对策：投资 1亿＄用于方法研究 2000年基本完成（提前5年）
所用技术阵列毛细管电泳测序技术 （PE 公司）
Dovichi －分析化学技术
Kambara——日立公司
Nobel化学奖？
（2） 医药领域
医院临床检验很大一部分是生化分析
全世界：十亿次化验/天
（3） 人工胰 治疗糖尿病
传感器监测血糖变化是关键，分析仪器，关键作用
（4） 2002 Nobel化学奖 田中耕一 大分子质谱
生命科学
复杂、充满未知——充满机遇、充满挑战、大有可为
“生命分析化学” 重要作用，关键作用
5．学习本课的意义
很多分析化学专业同学毕业论文工作与生物有关
三． 本课主讲人
分析化学背景
药物分析学博士
自学生物化学知识
工作中接触过一些生化内容
能力有限，共同学习，希望有所启示
四．本课教材
找不到合适
原因：1．领域发展很快，来不及编写
2．老教材
重分析轻生化：=仪器分析 生化味淡
重生化轻分析：叙述多（操作规程），未与分析化学相管关连，生化思路：“不讲理”，看不懂，用不上
英文教材：还可以，也不是很理想，没有其它办法 ——分两部分 ――前部 分析方法
――后部 生化物质的测定
——优点：全、新、简 按分析化学思路，生化味浓 ——缺点：英文；有些未讲到， 要参考其它书（生物化学、FIA ）
——内容：不全讲，时间不够
——酶分析、免疫分析，氨基酸，蛋白质、核酸
第一章 酶分析法
Enzyme assay methods
第一节 酶学基础
一． 定义:酶是由生物体活细胞生成的具有选择性催化能力的蛋白质
二． 作用：生物催化剂
生长. 发育. 繁殖 合成. 分解. 氧化. 还原
如果没有酶, 生命就不复存在！
为什么？有机反应：加热，加压，副反应多，时间长
三. 特点:
1. 催化效率高
比非酶催化剂通常高10-10
如过氧化氢酶 催化H 2O 2分解 1min 5×10mol >10倍 Fe3+ 610613催化H 2O 2分解 1min 6×10mol -4
2. 高度专一性（选择性）
酶的催化作用物—底物（substrate ）
（1） 相对专一性——对一类物质底物, 如淀粉水解酶. 氨
基酸氧化酶
（2） 绝对专一性---一对一, 单一底物. 如葡萄糖氧化酶
（3） 立体专一性---对立体结构, 立体结构底物, 如L-氨基
酸氧化酶,L 型,D 型
3. 酶催化反应条件温和
通常:常温. 常压, 近中性
4. 酶催化活性受多种因素调控
归纳：催化特点:高效, 专一, 温和, 可调
四. 化学组成与结构
1. 组成
酶
= 酶蛋白 + 辅助因子辅基
conjugated protein cofactor
有催化活性 无 无
2. 结构
蛋白酶-蛋白质. （氨基酸-肽健-多肽-蛋白质）分子量>10000 真正起催化作用的----酶的活性中心, 体积很小
十几——几十氨基酸残基
五. 酶的催化机理-----至今尚未完全清楚
1．酶的基本催化机理---降低反应活化能
2．催化过程:
酶活性中心+底物---酶—底物中间复合物导致反应加速 活性中心（凹区）
结合部位---专一结合作用
催化部位---催化作用
——如何催化： 应力变形效应
诱导电荷变化效应 浓集定向效应
催化反应式 酶 底物 复合物 产物
钥匙一锁模型
六. 分类.
按催化反应类型
1. 氧化还原酶（Oxidoreductases ） H.O.电子转移
2. 转移酶（Transferases ）官能团转移
3. 水解酶（Hydrolases ）AB+H2O=AOH+BH
4. 裂合酶（Lyase ）[Laieis]专基因或双健
5. 异构酶（lsomerases ）同分异构互变
6. 连接酶（Ligases ）
七. 命名
1. 习惯命名 葡萄糖氧化酶, 乳酸脱氢酶, 胃蛋白酶（水解酶）
2. 国际命名. 不会有重名
1961,国际酶学会议
如:L-氨基酸氧化酶----EC1.4.3.2
八. 有关酶活性的基础知识
（一） 酶活性的概念
1. 定义
酶活性 = 酶的催化活性
= 催化能力
=（催化）酶促反应速度
= 单位时间底物减少或产物增加
即:酶活性高---催化能力强 定性表达
酶活性低---催化能力弱
2. 酶活性单位 人为规定的量化单位
① 惯用单位
方法作者, 自己规定或应用传统
——特定条件下, 单位时间生成一定量产物
——特点:不归一, 不同酶之间难以比较
② 国际单位（International Unit,IU）
1961年，国际生化学会酶学委员会建议:在规定的实验条
件下, 每分钟催化1µmol 底物的酶量为1IU 。
25℃，最适pH ，底物浓度[S]
1965年，规定25---30℃ 1972年取消温度要求
1976年，在特定条件下（specified condition），每分
钟转化1µmol 底物的酶量为1IU 。 （较普遍的定义）
③1972年， 国际酶学委员会; 新单位 Katal（催量） 在最适条件下每秒钟催化1 mol 底物发生反应酶量。 单位太大, 常用 µkatal
1 katal=60×10IU
1 IU=1/60 µkatal
逐步过渡
3. 酶的比活性（specific activity）
—对酶试剂而言, 单位质量蛋白质（mg ）所具有的酶活性 —(IU/mg)
—衡量酶试剂纯度的指标
—比活性下降, 纯度下降
4. 周转数（turnover number）
——单位时间内每分子酶转换底物的分子数
—一一般酶周转数50-105 min 1-2个/s
——最高碳酸酶 每秒10个
——理想的酶活性指标
5．酶含量
——实际浓度 摩尔mol/L 质量g/L
——活性浓度 IU/L特点:不管实际浓度含量, 只看最后催化效果
——示例: 1g/L酶1min 催化1µmol 底物
5-1 6
100g/L酶1min 催化100µmol 底物
——同一种酶 同样mol/L应有同样IU/L, mol/L增一倍,IU/L增一倍
——反过来不一定, IU/L相同, 不一定mol/L相同，可能相差很远 .由IU/L反推浓度不可
——理想情况:知摩尔, 质量浓度,
又知单分子酶的催化活性（周转数）
比较不同酶的活性单位
① 酶活性单位目的:
A:反应速度的度量
纯粹的反应速度度量---周转数
单位量酶, 在单位时间内. 催化的底物量 B:酶量的度量
② 酶的含量
A（理论） mol/l ,g/l
B（实际）IU/L U/L 含量以每g/ml酶制剂含多少个活性单位表示
C（酶制剂）IU/g U/g
酶量----通过酶活性间接表示出来，
酶的作用效果
③ 原因:目前活性浓度占主导, 摩尔质量浓度不常见,
——理由：酶蛋白难分离, 难定量, 难纯化制备
④ 注意: 酶分析法中，酶的含量测定=酶的活性测定, ——至少目前是如此
⑤由此, 引伸——生化分析与传统分析化学不同点
分析化学---标准溶液, 分析纯试剂
生物化学---生化试剂制剂 混合物 因分离困难
（要求）需要起作用的起作用, 不需要的不干扰
（二）影响酶活性（反应速度）的因素
1. 温度, 影响较大 两个因素起作用
① 升温——加速反应（增加分子运动）
② 升温——酶热变性失活
规律:10----30---40----50-----60----80----100 最适范围 开始变性 不可逆变性 （但不绝对）
100
80
R e l a t i v e A c t i v i t y (%) 6040
20
O Temperature C
2. 酸度pH
① pH 过高过低，蛋白质变性失活
② pH 中间部分，改变酶或底物解离状态
一般最适pH 在4.5---8
例外：胃蛋白酶pH 1.5 盐酸环境，仍具酶活性
3. 底物浓度----米氏方程
三阶段 近一级动力学——近似正比—[s]不足
混合动力学——正变—[s]稍过
近零级动力学——近不变—[s]过量
搬运工原理
一级动力学 正比 有多少[s]反应多少
混合动力学 正变 有多少[s]反应多少 s有点多 零级动力学 不变 有多少[s]反应多少 s足够. 过多
① 米氏方程 酶促反应速度----底物浓度关系曲线 V m —最大反应速度
Km —米氏常数，1/2Vm 对应的
[s]
产物 1913 Michaelis and Menten
V=Vm [s]/Km +[s] 米氏方程 米曼方程
反应速度----底物浓度 定量关系 ② 米氏常数 k m
—酶的特征常数 不同酶, k m 不同 —表示酶与底物的亲和力----物理意义
km 下降, 两者亲和力上升，反应速度上升 —实用意义:
A确定底物浓度
B不同酶鉴别依据
③ K m Vm 测定
求得一系列[s]---v数据
多种方法求得K m Vm
4. 激活剂activator
①定义:能提高酶活性的物质, 为激活剂
②种类:（1）无机离子:K Na Ca Mg Zn Fe H
（2）有机物:半胱氨酸 （看具体情况）
5.抑制剂inhibitor
①定义:能降低酶活性, 但并不引起酶蛋白变性的物质, 为抑制剂
②分类:可逆抑制剂—结合可逆, 可通过渗析可恢复
不可逆抑制剂—与酶蛋白共价结合, 不能通过渗析 恢复
③机理:
（1）竞争性抑制作用 competitive inhibition
抑制剂与底物结构相似, 不破坏酶，与底物竞争酶的活性点位
V m 不变, Km 增加
例:
二氢叶酸合成酶——底物：对氨基苯甲酸
＋＋2＋2＋2＋2＋＋
二氢叶酸——细菌生长所需 ——人体亦需要，但不能自身合成，只能由外 界获得
磺胺（药物）——结构与对氨基苯甲酸相似，竞争抑制 剂，阻断细菌生长；人体不需要此酶， 因而药物无害
（2）非竞争抑制作用 non-competitive inhibition
抑制剂与底物结构不同, 结合点位不同, 但S-E-I 结合后不能分解，（ V m 变, K m 不变）
（3）反竞争抑制作用 uncompetitive inhibition （V m 和 K m 齐下降）
④常见抑制剂
（1）有机汞, 有机砷, 抑制合巯基酶
（2）有机磷, （农药）抑制乙酰胆碱酯酶 催化乙酸胆碱（神经递质）水解
害虫体内乙酰胆碱如不能去除持续兴奋
（3）重金属 Ag Cu Hg Pb＋2＋2＋2＋
（4）氰化物 CO 生成络合物抑制
（5）药物 磺胺，青霉素
青霉素的作用：竞争抑制制造细菌细胞壁成份的酶 细菌不能合成完整细胞壁
人体没有合成细胞壁问题, 因而无害