双向电泳实验教程
一、实验过程
1、蛋白质干粉的制备
可溶性蛋白提取法
1.于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g
2.放到研钵中,液氮研磨充分,移入50ml 离心管中
3.加入15ml 提取缓冲液,震荡摇匀15-30 min,于冰山超声1h 4.11000rpm ,4℃,15min ,取上清
5.再加入15ml 提取缓冲液,震荡摇匀15-30 min,11000rpm ,4℃,15min ,取上清 6.合并上清,加入4倍体积TCA/丙酮溶液,11000rpm ,4℃,20min ,弃上清 7.丙酮清洗3次然后真空抽干
8.按适当比例加入裂解缓冲液,室温超声溶解1~2h 9. 11000rpm,15min ,取上清即为蛋白样品 10.样品放置于-20℃冰箱
TCA 丙酮法
1.于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g
2.放到研钵中,液氮研磨充分,移入50ml 离心管中 3.加入TCA 抽取液20ml, 震荡,-20℃沉淀过夜 4.11000rpm ,4℃,15min ,去上清
5.加入20ml-20℃预冷的冷丙酮(内含0.07%β-巯基乙醇)震荡,静置2h ,然后11000rpm , 15min ,去上清(一般重复3次,洗至沉淀白色或者不能变色为止) 6.沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干 7.按适当比例加入裂解缓冲液,室温超声溶解1~2h
8. 11000rpm,15min ,取上清即为蛋白样品(此步剩下的残渣可以先留着) 9.样品放置于-20℃冰箱 药品配方:
TCA/丙酮抽取液:25gTCA (10%),0.07%β-巯基乙醇定容于250ml 丙酮中
苯酚提取法
1.于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g
2.放到研钵中,液氮研磨充分,移入50ml 离心管中
3.加入蛋白提取液15ml, 震荡使其混合均匀即可,于冰上放置30min 4.加入等体积的Tris 平衡酚,震荡使其混合均匀,于冰上放置30min 5.11000rpm ,4℃,,20min ,收集上层酚层。 6. 用抽提液洗酚层2次
7. 加入5倍体积的甲醇醋酸铵,沉淀静止过夜 8.11000rpm ,4℃,,30min ,去上清
9. 用洗液1洗涤沉淀,11000rpm ,4℃,,30min ,去上清 10.用洗液2洗涤沉淀,11000rpm ,4℃,,30min ,去上清 11.沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干
12.按适当比例加入裂解缓冲液,室温超声溶解1~2h,溶解的样品即为蛋白样品 13, 。将样品放置于-20℃冰箱中保存。
药品配方: 蛋白提取液
1%PVP,0.7M 蔗糖,0.1M Kcl,0.5M Tris-Hcl,500Mm EDTA.2Na,1mM PMSF,2%β-Me 洗液1
80%丙酮(0.07%β-Me ) 3.洗液2
100%丙酮(0.07%β-Me )
2、样品的溶解
取蛋白干粉10mg 于1.5ml 的离心管中,加入200-250ul 裂解液(先加100-200ul 左右,用小棒研磨后,再逐次加入余量裂解液,冲洗小棒),振荡1min 左右,于35℃水浴2.5小时,15000rpm 离心15min ,取上清液作为实验备用。 3、Bradford 法测蛋白含量
1)、将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的溶液贮存于4℃冰箱
2)、设7个浓度梯度制作标准曲线,每个梯度设3个重复,依下表加入1mg/ml BSA 、0.1M Hcl 、ddH 2O 。(均使用10ml 离心管) 管号 ddH 2O(ul) 1mg/ml BSA(ul) 0.1M Hcl
0 90 0 10
1 80 10 10
2 70 20 10
3 60 30 10
4 50 40 10
5 40 50 10
6 30 60 10
7 20 70 10
8 10 80 10
9 0 90 10
3)、每管加入5ml Bradford工作液,摇匀,5min 后测波长595nm 下的吸光值。测定过程中,每测完1管,比色皿用95%乙醇冲洗后再用蒸馏水冲洗3次,然后取少量下1管的溶液润洗比色皿2次。
4)、制作BSA 含量与OD 595关系的标准曲线方程式:
Y= aX+b.其中Y 为 OD值,X 为蛋白含量。 a、b 及相关系数通过输入数据,作图,软件分析可得。其中R 最好大于0.95。
5)、样品液蛋白质的定量
取10ul 样品液, 加入10ul 0.1M Hcl,80ul ddH 2O, 加入5ml Bradford工作液,操作方法与制作标准曲线相同。根据定量结果计算样品液的取量及加入水化液的量。
2
4、第一向电泳IEF
1) 、依据定量结果取适量上清液,加泡胀液至终体积为0.45ml ,振荡片刻,15000r 离心5min 除杂质,取上清用于上样。
2) 、选用24cm 长IPG 胶条,将IPG 胶条从-20℃取出后置室温下放置5min 。向IPG 胶条槽(strip holder) 中加入0.45ml 溶有样品的泡胀液后,再将IPG 胶条去掉保护膜,胶面向下放入胶条槽中,酸性端对应正极,碱性端对应负极;慢慢的抬高或放低胶条,除去胶面与泡胀液间的气泡,然后滴加0.7-0.8ml 覆盖油,盖上胶条槽的盖子,放于Ettan-IPG 等电聚焦仪(IPGphor)上,泡胀和等电聚焦的参数见表1。再水化及等电聚焦条件均设置为20℃,
50uA/strip。 IEF 参数设置 steps Voltage(v) Time(h)
1 500 1
2 1000 6
3
8000(gradient)
3
4 8000 4
5 1000 30
S1、S2用于去小离子,并有利于高分子量蛋白进入胶条,S3和S4用于聚焦,为防聚焦完毕后无人值守或其它操作尚未完成而设置了S5。(进行等电聚焦之前,先让泡胀液与胶条充分接触,一般过夜或者12h)
*在进行IEF 时,室温易保持在20-23℃之间为宜,以免IPGphor 的电板出现冷凝水而可能导致的仪器短路事故。
5、胶条平衡
等电聚焦后,用镊子迅速取出IPG 胶条(夹住负极端) ,用滤纸上放置片刻(胶面,即接触样品那一面不能接触滤纸) ,以正极端(即酸性端)向下,负极端(即碱性端)向上放入平衡管中,平衡Ⅰ(15ml)和平衡Ⅱ(15ml)分别平衡15min 。取出胶条后用滤纸小心吸去残余平衡液,用电极缓冲液润洗1秒钟,准备转移至第二向SDS-PAGE 胶上。 * 平衡时要注意保持胶面始终向上, 不能接触平衡管壁。
6、第二向电泳SDS-PAGE
将平衡好的IPG 胶条贴于凝胶玻璃板上,移至分离胶上端,避免IPG 胶条与SDS-PAGE 胶上沿间产生气泡。将10ul 低分子量标准蛋白于沸水中煮5min ,剪一张0.3cm ×0.5cm 的滤纸片,置于胶条的酸性端,吸取标准蛋白液至滤纸片上,用封胶液(不能太热,50℃左右为宜) 封住胶条及滤纸片,待封胶液凝固后,在电泳槽中放上上槽,将凝胶板插入Ettan DALTII 的缓冲液柜中,用代用板插满空位置。在18℃水循环条件下进行电泳,起初恒流10mA/胶 30min后,换用50mA/胶,待示踪溴酚蓝至凝胶底部边缘时停止电泳。
TM
7、蛋白质检测
电泳结束后,剥下胶板,放入染色液中于室温摇床摇动染色8h, 随后经脱色液脱色处理至背景变浅、蛋白点清晰可见,其间更换脱色液数次。脱色后的凝胶用蒸馏水冲洗3次,用Image Scanner电泳扫描仪进行扫描,分辩率设置为300dpi(或600 dpi)、24位全彩。
二、相关溶液配置
1、提取液:
mM PMSF,10 mM DTT)
100mmol/LTris 、50mmol/L抗坏血酸、100mmol/L氯化钾、50mmol/L硼砂、1%Triton X -100、2%β-巯基乙醇。
1.5mmol/LTris-Hcl 13.3ml 抗坏血酸 1.76g Kcl 1.49g 硼砂 3.81g PMSF 0.035g
可溶性提取缓冲液(20 mM Tris-Hcl ,pH8.0,20 mM Nacl ,20
β-巯基乙醇 4ml dd H2O to 200ml
TCA/丙酮抽取液:25gTCA (10%),0.07%β-巯基乙醇定容于250ml 丙酮中
可溶性蛋白提取液:
1%PVP,0.7M 蔗糖,0.1M Kcl,0.5M Tris-Hcl,500Mm EDTA.2Na,1mM PMSF,2%β-Me 洗液1
80%丙酮(0.07%β-Me ) 3.洗液2
100%丙酮(0.07%β-Me )
2、裂解液:
7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(W/V) CHAPS 、2%(V/V) 两性电解质载体,–20℃保存。 Urea 4.2 g Thiourea 1.5224 g CHAPS 0.4 g Pharmelyte 3~10 50 ul dd H2O to 10 ml
注:1) 使用前加入20mMDTT(根据不同样品,加入DTT 的量可作适当调整,如20、30、
40、50mMDTT 等) 。
2) Pharmelyte 的PH 值最好与胶条的范围一致。
3、 水化液:
7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%(W/V)CHAPS 、0.5%(V/V) IPG buffer,–20℃保存。 Urea 2.1 g Thiourea 0.75 g CHAPS 0.1 g Bromophenol blue(1%) 10 ul dd H2O to 5 ml
注:使用前每1 mL 水化液加5ul IPG IPG buffe,加入的DTT 量与裂解液中的用量相同,然后加入痕量溴酚蓝,用前加入少量DTT 和10ulPH3-10的电解质。
4、1%溴酚蓝贮液
Bromophenol blue 100 mg dd H2O to 10 ml
5、 平衡液:
50 mmol/L Tris-HCl pH8.8、尿素6 mol/L、30%(V/V) 甘油、2%(W/V) SDS 、少量溴酚蓝,–20℃保存。
Tris-HCl, pH 8.8 10 ml
Glycero(87%) 69 ml SDS 4 g dd H2O to 200 ml 使用前,2次平衡分别加入:
平衡液Ⅰ:每10ml 平衡液加DTT100mg ; 平衡液Ⅱ:每10ml 平衡液加碘乙酰胺250mg 。
6、 SDS-PAGE 凝胶储液:
30%(W/V) 丙烯酰胺,0.8%(W/V) 甲叉双丙烯酰胺,保存于棕色瓶,4℃ Acrylamide (FW 71.08): 60.0 g N,N’-Methylene bisacrylamide (FW 154.17) 1.6 g ddH 2O To 200 ml
7、 SDS-PAGE 凝胶缓冲液:
1.5 mol/L Tris-HCl,pH 8.8,4 ℃保存。 Tris base (FW 121.1) 36.34 g ddH 2O about 100~150 ml 浓HCl adjust to pH 8.8 ddH 2O to 200 ml 8、 SDS-PAGE 电极缓冲液:
Tris 0.025 mol/L,甘氨酸0.192 mol/L,0.1%(W/V) SDS,pH 8.3。 可先配成10X SDS electrophoresis buffer,使用前再稀释。 10倍电极缓冲液: Tris base 12.1 g; glycine 57.6 g; SDS 4.0 g ddH 2O to 400 ml
9、封胶液:
SDS elctrophoresis buffer 100 ml
Agarose 0.5 g
10、染色液(200ml):
磷酸 100ml 硫酸铵 100g G250 1.2g 甲醇 200ml
11、脱色液:
甲醇 50ml 乙酸 70ml + 蒸馏水 to 1 L
12、Bradford 贮存液(350ml 的量)
95%乙醇 100ml 88%磷酸 200ml G-250 350mg
保存于棕色瓶中,室温下长期保持稳定。
13、Bradford 工作液(500ml配方)
双蒸水 425ml
95%乙醇 15ml 88%磷酸 30ml Bradford 贮存液 30ml
保存于室温棕色瓶中,一般使用期不超过5-6个星期为宜。使用前需过滤。 14、10%SDS(十二烷基硫酸钠):1gSDS 定容到10ml 15、10%AP(过硫酸铵):1gAP定容至10ml
双向电泳实验教程
一、实验过程
1、蛋白质干粉的制备
可溶性蛋白提取法
1.于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g
2.放到研钵中,液氮研磨充分,移入50ml 离心管中
3.加入15ml 提取缓冲液,震荡摇匀15-30 min,于冰山超声1h 4.11000rpm ,4℃,15min ,取上清
5.再加入15ml 提取缓冲液,震荡摇匀15-30 min,11000rpm ,4℃,15min ,取上清 6.合并上清,加入4倍体积TCA/丙酮溶液,11000rpm ,4℃,20min ,弃上清 7.丙酮清洗3次然后真空抽干
8.按适当比例加入裂解缓冲液,室温超声溶解1~2h 9. 11000rpm,15min ,取上清即为蛋白样品 10.样品放置于-20℃冰箱
TCA 丙酮法
1.于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g
2.放到研钵中,液氮研磨充分,移入50ml 离心管中 3.加入TCA 抽取液20ml, 震荡,-20℃沉淀过夜 4.11000rpm ,4℃,15min ,去上清
5.加入20ml-20℃预冷的冷丙酮(内含0.07%β-巯基乙醇)震荡,静置2h ,然后11000rpm , 15min ,去上清(一般重复3次,洗至沉淀白色或者不能变色为止) 6.沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干 7.按适当比例加入裂解缓冲液,室温超声溶解1~2h
8. 11000rpm,15min ,取上清即为蛋白样品(此步剩下的残渣可以先留着) 9.样品放置于-20℃冰箱 药品配方:
TCA/丙酮抽取液:25gTCA (10%),0.07%β-巯基乙醇定容于250ml 丙酮中
苯酚提取法
1.于超低温冰箱中取样品取出水稻材料样品3g
2.放到研钵中,液氮研磨充分,移入50ml 离心管中
3.加入蛋白提取液15ml, 震荡使其混合均匀即可,于冰上放置30min 4.加入等体积的Tris 平衡酚,震荡使其混合均匀,于冰上放置30min 5.11000rpm ,4℃,,20min ,收集上层酚层。 6. 用抽提液洗酚层2次
7. 加入5倍体积的甲醇醋酸铵,沉淀静止过夜 8.11000rpm ,4℃,,30min ,去上清
9. 用洗液1洗涤沉淀,11000rpm ,4℃,,30min ,去上清 10.用洗液2洗涤沉淀,11000rpm ,4℃,,30min ,去上清 11.沉淀放于冰盒中然后放到真空干燥箱中真空抽干
12.按适当比例加入裂解缓冲液,室温超声溶解1~2h,溶解的样品即为蛋白样品 13, 。将样品放置于-20℃冰箱中保存。
药品配方: 蛋白提取液
1%PVP,0.7M 蔗糖,0.1M Kcl,0.5M Tris-Hcl,500Mm EDTA.2Na,1mM PMSF,2%β-Me 洗液1
80%丙酮(0.07%β-Me ) 3.洗液2
100%丙酮(0.07%β-Me )
2、样品的溶解
取蛋白干粉10mg 于1.5ml 的离心管中,加入200-250ul 裂解液(先加100-200ul 左右,用小棒研磨后,再逐次加入余量裂解液,冲洗小棒),振荡1min 左右,于35℃水浴2.5小时,15000rpm 离心15min ,取上清液作为实验备用。 3、Bradford 法测蛋白含量
1)、将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的溶液贮存于4℃冰箱
2)、设7个浓度梯度制作标准曲线,每个梯度设3个重复,依下表加入1mg/ml BSA 、0.1M Hcl 、ddH 2O 。(均使用10ml 离心管) 管号 ddH 2O(ul) 1mg/ml BSA(ul) 0.1M Hcl
0 90 0 10
1 80 10 10
2 70 20 10
3 60 30 10
4 50 40 10
5 40 50 10
6 30 60 10
7 20 70 10
8 10 80 10
9 0 90 10
3)、每管加入5ml Bradford工作液,摇匀,5min 后测波长595nm 下的吸光值。测定过程中,每测完1管,比色皿用95%乙醇冲洗后再用蒸馏水冲洗3次,然后取少量下1管的溶液润洗比色皿2次。
4)、制作BSA 含量与OD 595关系的标准曲线方程式:
Y= aX+b.其中Y 为 OD值,X 为蛋白含量。 a、b 及相关系数通过输入数据,作图,软件分析可得。其中R 最好大于0.95。
5)、样品液蛋白质的定量
取10ul 样品液, 加入10ul 0.1M Hcl,80ul ddH 2O, 加入5ml Bradford工作液,操作方法与制作标准曲线相同。根据定量结果计算样品液的取量及加入水化液的量。
2
4、第一向电泳IEF
1) 、依据定量结果取适量上清液,加泡胀液至终体积为0.45ml ,振荡片刻,15000r 离心5min 除杂质,取上清用于上样。
2) 、选用24cm 长IPG 胶条,将IPG 胶条从-20℃取出后置室温下放置5min 。向IPG 胶条槽(strip holder) 中加入0.45ml 溶有样品的泡胀液后,再将IPG 胶条去掉保护膜,胶面向下放入胶条槽中,酸性端对应正极,碱性端对应负极;慢慢的抬高或放低胶条,除去胶面与泡胀液间的气泡,然后滴加0.7-0.8ml 覆盖油,盖上胶条槽的盖子,放于Ettan-IPG 等电聚焦仪(IPGphor)上,泡胀和等电聚焦的参数见表1。再水化及等电聚焦条件均设置为20℃,
50uA/strip。 IEF 参数设置 steps Voltage(v) Time(h)
1 500 1
2 1000 6
3
8000(gradient)
3
4 8000 4
5 1000 30
S1、S2用于去小离子,并有利于高分子量蛋白进入胶条,S3和S4用于聚焦,为防聚焦完毕后无人值守或其它操作尚未完成而设置了S5。(进行等电聚焦之前,先让泡胀液与胶条充分接触,一般过夜或者12h)
*在进行IEF 时,室温易保持在20-23℃之间为宜,以免IPGphor 的电板出现冷凝水而可能导致的仪器短路事故。
5、胶条平衡
等电聚焦后,用镊子迅速取出IPG 胶条(夹住负极端) ,用滤纸上放置片刻(胶面,即接触样品那一面不能接触滤纸) ,以正极端(即酸性端)向下,负极端(即碱性端)向上放入平衡管中,平衡Ⅰ(15ml)和平衡Ⅱ(15ml)分别平衡15min 。取出胶条后用滤纸小心吸去残余平衡液,用电极缓冲液润洗1秒钟,准备转移至第二向SDS-PAGE 胶上。 * 平衡时要注意保持胶面始终向上, 不能接触平衡管壁。
6、第二向电泳SDS-PAGE
将平衡好的IPG 胶条贴于凝胶玻璃板上,移至分离胶上端,避免IPG 胶条与SDS-PAGE 胶上沿间产生气泡。将10ul 低分子量标准蛋白于沸水中煮5min ,剪一张0.3cm ×0.5cm 的滤纸片,置于胶条的酸性端,吸取标准蛋白液至滤纸片上,用封胶液(不能太热,50℃左右为宜) 封住胶条及滤纸片,待封胶液凝固后,在电泳槽中放上上槽,将凝胶板插入Ettan DALTII 的缓冲液柜中,用代用板插满空位置。在18℃水循环条件下进行电泳,起初恒流10mA/胶 30min后,换用50mA/胶,待示踪溴酚蓝至凝胶底部边缘时停止电泳。
TM
7、蛋白质检测
电泳结束后,剥下胶板,放入染色液中于室温摇床摇动染色8h, 随后经脱色液脱色处理至背景变浅、蛋白点清晰可见,其间更换脱色液数次。脱色后的凝胶用蒸馏水冲洗3次,用Image Scanner电泳扫描仪进行扫描,分辩率设置为300dpi(或600 dpi)、24位全彩。
二、相关溶液配置
1、提取液:
mM PMSF,10 mM DTT)
100mmol/LTris 、50mmol/L抗坏血酸、100mmol/L氯化钾、50mmol/L硼砂、1%Triton X -100、2%β-巯基乙醇。
1.5mmol/LTris-Hcl 13.3ml 抗坏血酸 1.76g Kcl 1.49g 硼砂 3.81g PMSF 0.035g
可溶性提取缓冲液(20 mM Tris-Hcl ,pH8.0,20 mM Nacl ,20
β-巯基乙醇 4ml dd H2O to 200ml
TCA/丙酮抽取液:25gTCA (10%),0.07%β-巯基乙醇定容于250ml 丙酮中
可溶性蛋白提取液:
1%PVP,0.7M 蔗糖,0.1M Kcl,0.5M Tris-Hcl,500Mm EDTA.2Na,1mM PMSF,2%β-Me 洗液1
80%丙酮(0.07%β-Me ) 3.洗液2
100%丙酮(0.07%β-Me )
2、裂解液:
7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(W/V) CHAPS 、2%(V/V) 两性电解质载体,–20℃保存。 Urea 4.2 g Thiourea 1.5224 g CHAPS 0.4 g Pharmelyte 3~10 50 ul dd H2O to 10 ml
注:1) 使用前加入20mMDTT(根据不同样品,加入DTT 的量可作适当调整,如20、30、
40、50mMDTT 等) 。
2) Pharmelyte 的PH 值最好与胶条的范围一致。
3、 水化液:
7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%(W/V)CHAPS 、0.5%(V/V) IPG buffer,–20℃保存。 Urea 2.1 g Thiourea 0.75 g CHAPS 0.1 g Bromophenol blue(1%) 10 ul dd H2O to 5 ml
注:使用前每1 mL 水化液加5ul IPG IPG buffe,加入的DTT 量与裂解液中的用量相同,然后加入痕量溴酚蓝,用前加入少量DTT 和10ulPH3-10的电解质。
4、1%溴酚蓝贮液
Bromophenol blue 100 mg dd H2O to 10 ml
5、 平衡液:
50 mmol/L Tris-HCl pH8.8、尿素6 mol/L、30%(V/V) 甘油、2%(W/V) SDS 、少量溴酚蓝,–20℃保存。
Tris-HCl, pH 8.8 10 ml
Glycero(87%) 69 ml SDS 4 g dd H2O to 200 ml 使用前,2次平衡分别加入:
平衡液Ⅰ:每10ml 平衡液加DTT100mg ; 平衡液Ⅱ:每10ml 平衡液加碘乙酰胺250mg 。
6、 SDS-PAGE 凝胶储液:
30%(W/V) 丙烯酰胺,0.8%(W/V) 甲叉双丙烯酰胺,保存于棕色瓶,4℃ Acrylamide (FW 71.08): 60.0 g N,N’-Methylene bisacrylamide (FW 154.17) 1.6 g ddH 2O To 200 ml
7、 SDS-PAGE 凝胶缓冲液:
1.5 mol/L Tris-HCl,pH 8.8,4 ℃保存。 Tris base (FW 121.1) 36.34 g ddH 2O about 100~150 ml 浓HCl adjust to pH 8.8 ddH 2O to 200 ml 8、 SDS-PAGE 电极缓冲液:
Tris 0.025 mol/L,甘氨酸0.192 mol/L,0.1%(W/V) SDS,pH 8.3。 可先配成10X SDS electrophoresis buffer,使用前再稀释。 10倍电极缓冲液: Tris base 12.1 g; glycine 57.6 g; SDS 4.0 g ddH 2O to 400 ml
9、封胶液:
SDS elctrophoresis buffer 100 ml
Agarose 0.5 g
10、染色液(200ml):
磷酸 100ml 硫酸铵 100g G250 1.2g 甲醇 200ml
11、脱色液:
甲醇 50ml 乙酸 70ml + 蒸馏水 to 1 L
12、Bradford 贮存液(350ml 的量)
95%乙醇 100ml 88%磷酸 200ml G-250 350mg
保存于棕色瓶中,室温下长期保持稳定。
13、Bradford 工作液(500ml配方)
双蒸水 425ml
95%乙醇 15ml 88%磷酸 30ml Bradford 贮存液 30ml
保存于室温棕色瓶中,一般使用期不超过5-6个星期为宜。使用前需过滤。 14、10%SDS(十二烷基硫酸钠):1gSDS 定容到10ml 15、10%AP(过硫酸铵):1gAP定容至10ml