蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白前期准备

（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。

（3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性

包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤

破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。

超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。

包涵体的溶解

1、对于尿素和盐酸胍的选择：

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

2、去垢剂：

温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以 增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

包涵体的复性

1复性：

通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

2复性的效率：

复性是一个非常复杂的过程，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

4、复性中常采用的方法有：

稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺

点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！

包涵体的复性还要注意以下几点：

1.首先要获得较高纯度的包涵体。

2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。

3.复性前后均要离心

4.复性不能太快.

5.纯化的最佳条件要摸索和结合相关文献。

6.变性蛋白的浓度

浓度不要太高，一般0.4-0.5mg/ml 左右较适宜，若浓度高了，可稀释至适宜浓度。有些蛋白可能更低，此时需要结合文献和实践，确定最佳浓度。要结合透析前后的浓度，如果透析液加入甘油，这需要结合浓缩比（10%甘油可浓缩20%左右）。

复性Buffer的选择

包涵体复性液配方

对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。Tris

系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；复性过程主要是注意以下几个问题：

（1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；(有时需要过酸或过碱性)

（2）温度适宜选择4℃；

（3）复性过程蛋白浓度不宜过大；（小于0.5 mg/ml为宜）

（4）复性时间一般为24-36小时；

（5）低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用。

（6）氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG等。常用的氧化方法有：空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。

氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH（1:5-1:10），通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如DTT，如：5 mM GSSG/2 mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

（7）复性过程的添加剂：

1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。

2、0.4-0.6 M L-Arg：促进蛋白溶解，（成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，也可以抑制二聚体的形成。）

3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。

4、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。

5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等（如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。

6、特殊离子：如CaCl2，MgCl2等特殊的金属离子，可参与蛋白质的正确折叠，促进活性的作用。（此时勿加入EDTA。）

例如复性Buffer：

50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，0.4 M L-Arg, 2mM GSH/0.4mM GSSG,10%甘油。

透析buffer：

50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，2mM DTT, 10%甘油。

复性中蛋白析出！

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈。复性应该采取复性液浓度和pH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个pH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。

（1） 蛋白析出最大的可能性：蛋白浓度太高，建议稀释以后再复性；

（2）透析的盐浓度（比如urea）要平缓降低：8M-6M-2M-PBS；

(3）若加变性剂（尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M）；

（4）另外可将甘油浓度增加（范围可在≤30%），且在复性样品中也可加适量甘油；

（5）如果还不行，可以换新的复性缓冲液 ；

（6）纯度不够！出现纯化的目标蛋白纯度不够时，可以先过分子筛再复性；

带有二硫键蛋白的复性！

如果蛋白中存在两个以上的半胱氨酸，立即形成正确的二硫键是不可能的。随着二硫键的数目增加（分子间与分子内的），可能的组合数目也在剧烈上升（3个二硫键就是15种可能组合，4个对应105，5个对应945等等）。

如果二硫键是正确折叠所必须的话，应该在溶解时加入一种还原性试剂（如1－10mM DTT）。这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。加入二硫化物置换试剂（如氧化型＋还

原型谷胱甘肽）是为了提供氧化还原作用力。这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。这些二硫键的形成或断裂反应是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这种平衡才会被破坏。这个过程被称作氧化型折叠。

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白前期准备

（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。

（3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性

包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤

破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。

超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。

包涵体的溶解

1、对于尿素和盐酸胍的选择：

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。

2、去垢剂：

温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以 增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

包涵体的复性

1复性：

通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

2复性的效率：

复性是一个非常复杂的过程，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

4、复性中常采用的方法有：

稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺

点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！

包涵体的复性还要注意以下几点：

1.首先要获得较高纯度的包涵体。

2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。

3.复性前后均要离心

4.复性不能太快.

5.纯化的最佳条件要摸索和结合相关文献。

6.变性蛋白的浓度

浓度不要太高，一般0.4-0.5mg/ml 左右较适宜，若浓度高了，可稀释至适宜浓度。有些蛋白可能更低，此时需要结合文献和实践，确定最佳浓度。要结合透析前后的浓度，如果透析液加入甘油，这需要结合浓缩比（10%甘油可浓缩20%左右）。

复性Buffer的选择

包涵体复性液配方

对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。Tris

系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；复性过程主要是注意以下几个问题：

（1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；(有时需要过酸或过碱性)

（2）温度适宜选择4℃；

（3）复性过程蛋白浓度不宜过大；（小于0.5 mg/ml为宜）

（4）复性时间一般为24-36小时；

（5）低分子化合物 如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用。

（6）氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG等。常用的氧化方法有：空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。

氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH（1:5-1:10），通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如DTT，如：5 mM GSSG/2 mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

（7）复性过程的添加剂：

1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。

2、0.4-0.6 M L-Arg：促进蛋白溶解，（成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，也可以抑制二聚体的形成。）

3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。

4、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。

5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等（如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。

6、特殊离子：如CaCl2，MgCl2等特殊的金属离子，可参与蛋白质的正确折叠，促进活性的作用。（此时勿加入EDTA。）

例如复性Buffer：

50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，0.4 M L-Arg, 2mM GSH/0.4mM GSSG,10%甘油。

透析buffer：

50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM CaCl2，2mM DTT, 10%甘油。

复性中蛋白析出！

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈。复性应该采取复性液浓度和pH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个pH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。

（1） 蛋白析出最大的可能性：蛋白浓度太高，建议稀释以后再复性；

（2）透析的盐浓度（比如urea）要平缓降低：8M-6M-2M-PBS；

(3）若加变性剂（尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M）；

（4）另外可将甘油浓度增加（范围可在≤30%），且在复性样品中也可加适量甘油；

（5）如果还不行，可以换新的复性缓冲液 ；

（6）纯度不够！出现纯化的目标蛋白纯度不够时，可以先过分子筛再复性；

带有二硫键蛋白的复性！

如果蛋白中存在两个以上的半胱氨酸，立即形成正确的二硫键是不可能的。随着二硫键的数目增加（分子间与分子内的），可能的组合数目也在剧烈上升（3个二硫键就是15种可能组合，4个对应105，5个对应945等等）。

如果二硫键是正确折叠所必须的话，应该在溶解时加入一种还原性试剂（如1－10mM DTT）。这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。加入二硫化物置换试剂（如氧化型＋还

原型谷胱甘肽）是为了提供氧化还原作用力。这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。这些二硫键的形成或断裂反应是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这种平衡才会被破坏。这个过程被称作氧化型折叠。