primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得
一、引物设计stepbystep
1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用PrimerPremier5搜索引物
①打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCRprimers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在SearchParameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.
③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物
和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面
列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Currentpair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Currentoligolength来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
②Analyze中，第一项为Keyinfo，点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbor
method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的DeltaG和3’端的DeltaG.3’端的DeltaG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
③Analyze中第二项为DuplexFormation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其DeltaG值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和DeltaG值。
④Analyze中第三项为HairpinFormation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，DeltaG值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。Analyze中第四项为CompositionandTm，会给出上游引物、下游引物和产物的
各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearestneighbormethod、％GCmethod和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之间。
第五项为FalsePrimingSites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有Falsepriming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且DeltaG值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
二、引物设计过程中的心得
1、Primer5.0搜索引物
①PrimerLength我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。
②PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。
③Searchparameters还是选Manual吧，Searchstringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。
④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。
2、Oligo6.0评估引物
①在analyze里，DuplexFormation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，Themoststable3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol,ThemoststableDimeroverall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，ThemoststableDimeroverall
6.7kcal/mol没有问题。
②HairpinFormation根据黄金法则
③Falseprimingsites:Primer的primingefficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。
④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimalannealingtemperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。⑤Internalstability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图引物3端过于稳定，很容易导致
不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。
3、其他
①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。
②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。
③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。
④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。
⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样
的情况出现。
RealtimePCR经验谈：从RNA的提取到PCR一引物的设计
引物的设计对于这个实验至关重要，因为realtimepcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：
1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。
2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。realtimePCR只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。
4，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。
5，注意引物设计好后的产物长度。REALTIMEPCR的最佳产物长度在150-250kb左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大，SYBR嵌入的越多，这样才能够保证最后的荧光值比较可信）。
6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法来比较基因表达量的高低。
二模板的要求
归根到底，REALTIMEpcr想要检测的是目的基因表达量的高低，所以对整个实验过程中模板的质量要求必然很高，我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点：
1，用TRIZOL提取RNA有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的RNA，所以我们在提取前必须知道细胞数（一般6孔板中两个孔就可以提取出RNA）。
2，加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层（中间层为基因组DNA，对上机做REALTIMEPCR很不利，会导致起始荧光值很高，无法跑出完整的扩增曲线）。3，提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉，但是不要过分挥发。（乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有影响。在乙醇存在的情况下，DNA更加难溶，这就是醇沉的道理。但是过分挥发，RNA又不溶于水，会造成后续反转录量不高）。4，反转录过程的操作尽可能在冰上。我们用的是OLIGODT18，为了尽可能的消除RNA之间的二聚体，我们将RNA和OLIGODT18在一起70度变性10分钟后，马上冰浴2分钟，再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASEINHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一个小时完成延伸过程（也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟，再加入OLIGODT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASEINHIBITOR,MLV。但是在变性完再加OLIGODT18时，加的比较晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义）。
5，反转录完后将cDNA-20度保存，尽可能不要反复冻融（可以以10UL为一个单位来分装cDNA）。
6，在加样的过程中需要特别注意：（1）最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上，这样可以消除不同管之间引物浓度的差异。（2）最后加模板的时候需要一把很准确的移液器，以便确保每次加进去的样一致，注意不要沾管壁（大部分人说需要混匀，但是我认为只要确保加入到体系中就可以，不用刻意混匀。因为我们在反应前有个95度变性，大家可以想象一下，在95度时候体系内的分子运动是很剧烈的，完全可以混匀），有条件的话可以加ROX,来消除不同的加样体系来造成的误差。（3）加样完毕后最好离心一下，防止沾壁。
实时定量PCR完全手册
方法简介
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.
RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Keyporint):
1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计
2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性
3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：
1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品
2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞
3.总RNA或者mRNA
4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略
5.不同的酶以及酶的不同组合
6.变异系数、灵敏度
7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA质量评价
现在RNA定量的程序很多。最近EMBOqPCRcourse
(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)比较了用Ribogreen,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA质量
RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。AgilentBioanalyser/BioRadExperion微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28SrRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligodT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分
别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA.而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR优化
PCR优化主要有：
1.引物的浓度
2.建议使用SYBRGreenI和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试
笔者建议的操作流程:
I．靶的选择和试验设计
1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.
RTPrimerDB(http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),
PrimerBank(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)
RealTimePCRPrimerSets(http://www.realtimeprimers.org)
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:
A.最广泛使用的商业化的软件Beacon
Designer(http://www.premierbiosoft.com)
B.DIY的软件PrimerExpress
C.如果BeaconDesigner无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosyshttp://www.designmyprobe.com)的服务方案,详细周到
D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序:
http://www.biosearchtech.com/products/probe_design.asp
您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR
引物设计简介
DNA引物长度:15-25个碱基
GC含量:50%左右
如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:
引物探针的保存一般遵循以下原则:
正向和反向引物保存在-20度,浓度为10mM或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast进行比对
3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计
4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。
6.在RT步骤时，用
(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低
7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域
primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得
一、引物设计stepbystep
1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用PrimerPremier5搜索引物
①打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCRprimers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在SearchParameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp.
③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物
和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面
列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Currentpair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Currentoligolength来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
②Analyze中，第一项为Keyinfo，点击Selectedprimers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbor
method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的DeltaG和3’端的DeltaG.3’端的DeltaG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
③Analyze中第二项为DuplexFormation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其DeltaG值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和DeltaG值。
④Analyze中第三项为HairpinFormation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，DeltaG值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。Analyze中第四项为CompositionandTm，会给出上游引物、下游引物和产物的
各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearestneighbormethod、％GCmethod和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm值可以控制在50～70度之间。
第五项为FalsePrimingSites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有Falsepriming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且DeltaG值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
二、引物设计过程中的心得
1、Primer5.0搜索引物
①PrimerLength我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。
②PCRProductsize最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。
③Searchparameters还是选Manual吧，Searchstringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。
④搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。
2、Oligo6.0评估引物
①在analyze里，DuplexFormation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，Themoststable3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol,ThemoststableDimeroverall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，ThemoststableDimeroverall
6.7kcal/mol没有问题。
②HairpinFormation根据黄金法则
③Falseprimingsites:Primer的primingefficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。
④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimalannealingtemperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。⑤Internalstability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图引物3端过于稳定，很容易导致
不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。
3、其他
①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。
②3端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。
③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大，3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。
④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度”谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。
⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样
的情况出现。
RealtimePCR经验谈：从RNA的提取到PCR一引物的设计
引物的设计对于这个实验至关重要，因为realtimepcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意：
1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。
2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能够区分开就可以。realtimePCR只有在熔解曲线的时候能分开，所以这就造成整个实验结果误差很大，不可信）。3，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。
4，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。
5，注意引物设计好后的产物长度。REALTIMEPCR的最佳产物长度在150-250kb左右（书上说这样可以增加荧光的敏感度，减少实验误差，但是我对这个说法持怀疑态度。产物长度越大，SYBR嵌入的越多，这样才能够保证最后的荧光值比较可信）。
6，不同的管家基因扩增效率不同。所以在做整个实验之前应该做一次检测扩增效率的实验。如果扩增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法来比较基因表达量的高低。
二模板的要求
归根到底，REALTIMEpcr想要检测的是目的基因表达量的高低，所以对整个实验过程中模板的质量要求必然很高，我以自己的一些经验说一下操作过程中的一些关键点：
1，用TRIZOL提取RNA有范围要求。细胞数必须在一个范围之内才能提取出高质量的RNA，所以我们在提取前必须知道细胞数（一般6孔板中两个孔就可以提取出RNA）。
2，加入氯仿抽提过程中尽可能不要吸到中间层（中间层为基因组DNA，对上机做REALTIMEPCR很不利，会导致起始荧光值很高，无法跑出完整的扩增曲线）。3，提取完后用乙醇溶解要尽可能使得乙醇挥发掉，但是不要过分挥发。（乙醇没有挥发干净会对后续的扩增效率有影响。在乙醇存在的情况下，DNA更加难溶，这就是醇沉的道理。但是过分挥发，RNA又不溶于水，会造成后续反转录量不高）。4，反转录过程的操作尽可能在冰上。我们用的是OLIGODT18，为了尽可能的消除RNA之间的二聚体，我们将RNA和OLIGODT18在一起70度变性10分钟后，马上冰浴2分钟，再加入后续的MLV-BUFFER,DNTP,RNASEINHIBITOR,MLV。然后在37-40度下一个小时完成延伸过程（也有的步骤上将RNA先70度变性10分钟，再加入OLIGODT18和MLV-BUFFER,DNTP,RNASEINHIBITOR,MLV。但是在变性完再加OLIGODT18时，加的比较晚的管子有很大的可能RNA又重新形成二聚体，导致前面的变性没有意义）。
5，反转录完后将cDNA-20度保存，尽可能不要反复冻融（可以以10UL为一个单位来分装cDNA）。
6，在加样的过程中需要特别注意：（1）最好引物和水做MIX,且配置完后需要放置在冰上，这样可以消除不同管之间引物浓度的差异。（2）最后加模板的时候需要一把很准确的移液器，以便确保每次加进去的样一致，注意不要沾管壁（大部分人说需要混匀，但是我认为只要确保加入到体系中就可以，不用刻意混匀。因为我们在反应前有个95度变性，大家可以想象一下，在95度时候体系内的分子运动是很剧烈的，完全可以混匀），有条件的话可以加ROX,来消除不同的加样体系来造成的误差。（3）加样完毕后最好离心一下，防止沾壁。
实时定量PCR完全手册
方法简介
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.
RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Keyporint):
1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计
2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性
3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：
1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品
2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞
3.总RNA或者mRNA
4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略
5.不同的酶以及酶的不同组合
6.变异系数、灵敏度
7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA质量评价
现在RNA定量的程序很多。最近EMBOqPCRcourse
(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)比较了用Ribogreen,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA质量
RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。AgilentBioanalyser/BioRadExperion微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28SrRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligodT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分
别位于3’;5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA.而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。PCR优化
PCR优化主要有：
1.引物的浓度
2.建议使用SYBRGreenI和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试
笔者建议的操作流程:
I．靶的选择和试验设计
1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.
RTPrimerDB(http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),
PrimerBank(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)
RealTimePCRPrimerSets(http://www.realtimeprimers.org)
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:
A.最广泛使用的商业化的软件Beacon
Designer(http://www.premierbiosoft.com)
B.DIY的软件PrimerExpress
C.如果BeaconDesigner无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosyshttp://www.designmyprobe.com)的服务方案,详细周到
D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序:
http://www.biosearchtech.com/products/probe_design.asp
您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR
引物设计简介
DNA引物长度:15-25个碱基
GC含量:50%左右
如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:
引物探针的保存一般遵循以下原则:
正向和反向引物保存在-20度,浓度为10mM或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast进行比对
3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计
4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。
6.在RT步骤时，用
(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低
7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域