综 述
葡萄浆果的生长发育及相关组学研究概况
王玉娟，王晨，房经贵*，宋长年，上官凌飞（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：分子生物学的快速发展与应用以及黑比诺葡萄基因组测序的完成，促进了葡萄浆果发育生物学、基因组学、蛋白组学以及代谢组学的发展，为最终更好地进行葡萄遗传改良以及生长发育的调控提供重要理论与工作基础。为更好地了解有关葡萄浆果的相关研究进展，本文针对葡萄浆果的构造和生长发育以及有关基因组学与蛋白组学研究的情况进行了简要介绍。
关键词：葡萄；浆果；生长发育；相关组学
葡萄属于葡萄科（Vitaceae Lindley 或Ampelideae Kunth）葡萄属（Vitis L.）多年生藤本植物。葡萄营养成分丰富，是世界性的重要水果[1-4]。多年来，葡萄生产效益与果实品质的提高都依赖于对不同品种生长条件的改良以及管理水平的改进。随着经济发展与技术投入的增加，如今这些技术措施已经很难达到明显提高葡萄生产效益的效果。有些技术措施的使用效果难以保持持续性，而且一些化学物质的使用对人们的身体以及环境有一定的负面影响。因此我们需要从新的方向寻找有效的技术措施以改善葡萄果实品质，达到提高葡萄生产效益的目的。分子生物学的发展无疑为解决该问题创造了新的途径，正如Boss 等[5]早在2000年的预测，在未来20年里对葡萄基因及其功能的认识，将促进通过基因工程手段对葡萄结果能力、果实
成熟期以及植株生长习性等进行更有效调控时期的到来。而所有这些必将对葡萄产量与品质以及田间管理的操作产生重要影响。
葡萄是继拟南芥、水稻和杨树之后完成全基因测序的第4种开花植物[6]。葡萄基因组测序的完成不仅为鉴定葡萄重要性状相关基因和研究其功能提供重要序列资料，而且为开展葡萄品种遗传改良提供重要的研究基础。随着葡萄基因组测序的完成，葡萄分子生物学技术得到了快速的发展，人们对葡萄发育有了更深入的了解。葡萄浆果生长发育是葡萄研究的重要内容，为此本文在前人研究的基础上，对葡萄浆果的生长发育以及葡萄浆果发育组学的研究进行简要介绍，以期为相关研究的开展提供一定的参考。
1 葡萄浆果的构造与生长发育1.1 葡萄浆果的构造
葡萄果实在植物学上属于真
果，因果实汁液丰富，而称为浆果，浆果由子房发育而成，包括果梗、果刷、果皮、果肉和种子等（图1）。当今发育生物学的发展要求我们对葡萄器官与组织的结构有更全面细致的认识，这不仅为葡萄果实发育的研究提供重要基础，而且为葡萄栽培管理提供更好的科学参考。1.2 葡萄浆果的生长发育
葡萄浆果生长发育受品种特性、气候条件、栽培方式及生长调节剂等多种因素的影响。浆果的体积不仅与构成浆果的细胞数和细胞体积有关，还与细胞间隙有关。所以，这三者是浆果生长的组成要素。而不同品种的葡萄，其浆果构造及其各组织细胞的增殖、分化速度、分化时期都是千差万别的。葡萄浆果的生长表现为双S 型曲线，分为3个生长阶段（图2）：第一生长周期、停滞期和第二生长周期。
收稿日期：2011-07-08
作者简介：王玉娟，女，硕士研究生。
*通讯作者：房经贵。E-mail: [email protected]
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1.2.1 第一生长周期的生长发育
葡萄浆果第一生长周期（即幼果膨大期）从开花期持续将近60 d。在第一生长周期结束时，浆果和种胚基本形成，浆果普遍呈椭圆形并生长到成熟果大小的70%。在这一段时间要加强田间管理，集中营养到果实，促进细胞分裂及细胞体积增大，进而促进果实膨大。
在第一生长周期，浆果中大多数的化合物（影响果实品质）随着浆果体积的增大而积累，并在转色期达到表观最大值，其中大部分是酸类物质。葡萄中的酸可分为无机酸和有机酸。无机酸含量很少，其总量一般少于1 g/L；有机酸是浆果中的主要酸，主要包括酒石酸、苹果酸和柠檬酸等[8]。葡萄中酚类物质也很多，而且易于变化，酚类物质按分子结构及聚合程度可划分为：单体酚、聚合多酚、丹宁和色素[9-10]。
在第一生长周期，浆果中还有其它化合物的积累，如矿物质、氨基酸、微量元素和芳香化合物等。由于浆果的形成和浆果中各成分变化的复杂性，人们在第一生长周期认识浆果生长发育及其成分的变化仍然是有限的，这有待我们进一步的了解认识浆果在第一生长周期的生长发育情况。1.2.2 停滞期
停滞期也叫硬核期，这一时期整个浆果的生长速度明显减缓。这一时期持续时间的长短与葡萄品种特性有关，无核葡萄这
图1 葡萄浆果解剖构造示意图[7]（引用得到Kennedy 教授的同意）
一时期相对短些；有核葡萄浆果纵横径基本不增大，主要进行种胚的发育和种皮的硬化，浆果酸度达最高水平，并开始了糖的积累。此期结束的标志是浆果开始退绿变软，因此这个转折点也叫转色期（veraison ），这是浆果发育进入第二生长周期、浆果成熟期的信号。在转色期中葡萄浆果的风味形成主要决定于糖酸比的平衡、风味物质和芳香族化合物的合成或一些前体的形成。葡萄浆果在停滞期发生的这一系列特征变化在很大程度上决定了浆果成熟时的品质[11]。
1.2.3 第二生长周期的生长发育
随着葡萄浆果颜色的变化和硬度的降低，浆果再次生长，进入第二生长周期。随着浆果的成熟，葡萄品种达到其特有的色香味品质。虽然葡萄浆果在收获期仍然保存着第一生长周期积累的许多化合物，但随着浆果体积的
图2 葡萄浆果生长发育动态曲线[7]（引用得到Kennedy 教授的同意）
综 述
增大，大多数的化合物浓度有了显著变化。浆果中的糖、酸含量同时发生着剧烈的变化，含糖量急剧上升，含酸量迅速下降，其中主要是苹果酸的减少。单宁的含量也有了显著的降低。单宁的多种特性，使其在葡萄酒的酿造过程中起着重要的作用。因此，合理地使用葡萄酒用单宁，可提高各类葡萄酒的质量和稳定性，并可保证葡萄酒良好的贮藏性。值得注意的是芳香类化合物在果实成熟期也有所下降。这其中包括几种甲氧基吡嗪类化合物的减少，这类化合物引起索维浓酒中的燥辣味等[12]，可以使葡萄酒拥有一些特征性味道。
尽管在浆果的第一生长周期化合物发生了重要变化，但最重要的是化合物含量在第二生长周期发生了重大的提高（主要是葡萄糖和果糖），使得果实从总生化反应转入果实成熟模式[7]。2 葡萄浆果发育组学研究概述
葡萄基因组测序的完成，进一步促进了葡萄分子生物学的快速发展。葡萄基因组学以及蛋白组学研究得到了更多的重视并有了快速发展。2.1 葡萄遗传图谱研究
遗传图谱是研究质量性状和数量性状遗传的基础，对标记辅助选择、图位克隆，以及将标记整合到基因组序列上具有重要意义。利用分子标记技术构建的葡萄高密度遗传图谱，不仅能明确染色体上基因间的距离及它们之间的相互关系，服务于葡萄全基因组的测序，而且可以对控制结
果期、风味、抗病性等性状基因或基因组区进行定位，达到标记辅助选择育种、筛选优势亲本材料等分子标记育种的目的[13-14]。
自葡萄第一张遗传图谱由Lodhi [14]等于1995年发表以来，葡萄遗传图谱研究迅猛发展。Lahogue 等[15]用140个随机引物对葡萄无核性状进行分析得到了RAPD 标记与主效的显性基因紧密连锁。王跃进等[16]利用细菌质粒M13克隆葡萄无核基因的RAPD 标记UBC269-480，用其作引物可进行无核筛选与鉴定，加速无核葡萄育种进程，提高育种效果。美国加利福尼亚州立大学从8个cDNA 文库中开发了1000个EST-SSR 标记，广泛应用在葡萄遗传图构建上。与其它生物一样，葡萄基因组中也存在着大量SNP ，Troggio 等[17]、Salmaso 等[18]和Vezzulli 等[19]分别将483、138、501个SNP 位点定位到遗传图上。这些SNP 位点大部分来自于EST 和BAC （bacteria artificial chromosome ）文库，所以很多功能基因位点也被定位到遗传图谱上。目前，这项技术已用在葡萄无核性状、抗病性和果皮颜色的早期鉴定与选择上[20-25]。定位的性状包括花型、果色等质量性状[26-27,
19]
进化过程的认识，而且为葡萄基因克隆与功能分析以及最终达到葡萄遗传改良的目的提供重要基因资源。拟南芥基因功能的信息为葡萄基因功能的研究提供了模式体系。所有这些为鉴定葡萄重要性状的调控基因和研究其功能勾划出了清晰的框架。
葡萄EST 在公共数据库中的大量释放丰富了葡萄的基因组序列信息，不仅方便了葡萄功能基因的发掘与克隆[32-36]以及SNP 、SSR 等标记的大量开发 [37-39]，而且为葡萄基因组序列的注释提供重要信息资源，截至2011年3月29日，GenBank 已公布的葡萄EST 序列已达到362,392条，其数量在所有登陆物种EST 数量中位列第25位。葡萄基因的克隆与功能分析也有了大量报道。尽管根据葡萄基因组的序列已经预测到了涉及葡萄花、果、叶等多种器官的生长发育的28305条葡萄基因，但是，随着对葡萄基因组全序列信息的挖掘以及对这些侯选基因的验证，有关葡萄功能基因的数量将随之改变。迄今，已经克隆并进行功能验证的葡萄基因的数量有限。应该说，随着对越来越多的葡萄基因的认识，将为葡萄基因工程提供重要的工作基础，对于葡萄生长发育的调控以及基因组序列的精确注释也具有重要帮助。
microRNAs （miRNAs ）作为一种新型的调控小RNA ，在植物生长发育的调控中发挥着极其重要的生物学作用[40-41]。miRNAs 通过介导其靶基因的裂解或抑制靶基因的翻译，调控其靶基因的
和抗病性、果实成熟期、无核
性状、叶形等数量性状[26，28-29]。2.2 葡萄浆果基因组学研究
基因组学技术的快速发展与应用以及黑比诺葡萄的基因组测序的完成[30-31]为葡萄基因组的认识提供了研究手段与重要信息。这不仅有助于科学家对开花植物
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表达而起作用。因此，有关葡萄miRNAs 及其功能分析是葡萄基因组学尤其是功能基因组学重要部分。近年来，关于葡萄miRNAs 及其靶基因的生物信息学法鉴定以及特征性分析的研究也逐渐受到了重视[42-44]，目前，miRBase 17.0序列数据库已收录163条葡萄miRNA 。Wang C等
[45]
Zhang 等[50]以赤霞珠葡萄为材料，对果实成熟过程中的质膜蛋白进行了研究。Sarry 等[51]、Negri 等[52]和Grmiplet 等[53]对果皮在浆果成熟过程中变化及影响进行研究，葡萄果皮颜色的变化有助于了解葡萄所处的不同成熟阶段，是了解葡萄成熟的标尺。
目前用于蛋白质组学研究的几乎都是酿酒品种。积极开展蛋白质组学在鲜食品种中的研究不仅可以提高鲜食品种果实的品质，还能更好地为实现其经济价值提供理论指导。葡萄的经济价值来源于果实，因此有关葡萄果实发育、品质形成的研究成为葡萄蛋白质组学研究的核心。葡萄浆果的成熟过程涉及了大量程序性蛋白质和代谢途径的变化，蛋白质组学将果实成熟过程中的蛋白质变化研究由单个或少数的蛋白质，提升到多代谢途径和蛋白质群体变化的水平，有助于更好的研究与认识葡萄果实生长发育机制。3 小结
葡萄基因组测序的完成，既是一项基础性的成就，同时又是在分子水平上研究葡萄浆果发育的好起点。这将促使人们通过基因工程手段改良葡萄浆果性状，使其更加有效地调控葡萄生产性能，从而对葡萄浆果品质、果色、丰产性、成熟期、无核性状和抗病性以及田间管理操作等产生重要影响。葡萄基因组学、蛋白质组学的发展不仅促进了这些目标的实现，而且对葡萄研究工作者提出了更富挑战性的新任务。
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成功地开展了葡萄花与果实
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人类基因组计划的完成标志着生命科学已进入后基因组时代，蛋白质组学的研究被提升到了前所未有的高度，蛋白质组学旨在阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。伴随葡萄基因组测序工作的完成，有关葡萄蛋白质组学的研究迅速发展。近年来蛋白质组学在葡萄浆果上的研究时有报道，Giribaldi 等研究了葡萄果实发育和品质形成过程中蛋白质组的变化。Waters 等
[47]
[46]
、
Deytieux 等[48]和Vincent 等[49]分别对细胞壁进行了深入的研究，细胞壁控制着细胞的大小，在一定程度上保护着细胞不受膨压变化的伤害，果实的膨大和成熟涉及复杂的细胞壁松弛和修饰过程。
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葡萄浆果生长发育受品种特性、气候条件、栽培方式及生长调节剂等多种因素的影响。浆果的体积不仅与构成浆果的细胞数和细胞体积有关，还与细胞间隙有关。所以，这三者是浆果生长的组成要素。而不同品种的葡萄，其浆果构造及其各组织细胞的增殖、分化速度、分化时期都是千差万别的。葡萄浆果的生长表现为双S 型曲线，分为3个生长阶段（图2）：第一生长周期、停滞期和第二生长周期。
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葡萄浆果第一生长周期（即幼果膨大期）从开花期持续将近60 d。在第一生长周期结束时，浆果和种胚基本形成，浆果普遍呈椭圆形并生长到成熟果大小的70%。在这一段时间要加强田间管理，集中营养到果实，促进细胞分裂及细胞体积增大，进而促进果实膨大。
在第一生长周期，浆果中大多数的化合物（影响果实品质）随着浆果体积的增大而积累，并在转色期达到表观最大值，其中大部分是酸类物质。葡萄中的酸可分为无机酸和有机酸。无机酸含量很少，其总量一般少于1 g/L；有机酸是浆果中的主要酸，主要包括酒石酸、苹果酸和柠檬酸等[8]。葡萄中酚类物质也很多，而且易于变化，酚类物质按分子结构及聚合程度可划分为：单体酚、聚合多酚、丹宁和色素[9-10]。
在第一生长周期，浆果中还有其它化合物的积累，如矿物质、氨基酸、微量元素和芳香化合物等。由于浆果的形成和浆果中各成分变化的复杂性，人们在第一生长周期认识浆果生长发育及其成分的变化仍然是有限的，这有待我们进一步的了解认识浆果在第一生长周期的生长发育情况。1.2.2 停滞期
停滞期也叫硬核期，这一时期整个浆果的生长速度明显减缓。这一时期持续时间的长短与葡萄品种特性有关，无核葡萄这
图1 葡萄浆果解剖构造示意图[7]（引用得到Kennedy 教授的同意）
一时期相对短些；有核葡萄浆果纵横径基本不增大，主要进行种胚的发育和种皮的硬化，浆果酸度达最高水平，并开始了糖的积累。此期结束的标志是浆果开始退绿变软，因此这个转折点也叫转色期（veraison ），这是浆果发育进入第二生长周期、浆果成熟期的信号。在转色期中葡萄浆果的风味形成主要决定于糖酸比的平衡、风味物质和芳香族化合物的合成或一些前体的形成。葡萄浆果在停滞期发生的这一系列特征变化在很大程度上决定了浆果成熟时的品质[11]。
1.2.3 第二生长周期的生长发育
随着葡萄浆果颜色的变化和硬度的降低，浆果再次生长，进入第二生长周期。随着浆果的成熟，葡萄品种达到其特有的色香味品质。虽然葡萄浆果在收获期仍然保存着第一生长周期积累的许多化合物，但随着浆果体积的
图2 葡萄浆果生长发育动态曲线[7]（引用得到Kennedy 教授的同意）
综 述
增大，大多数的化合物浓度有了显著变化。浆果中的糖、酸含量同时发生着剧烈的变化，含糖量急剧上升，含酸量迅速下降，其中主要是苹果酸的减少。单宁的含量也有了显著的降低。单宁的多种特性，使其在葡萄酒的酿造过程中起着重要的作用。因此，合理地使用葡萄酒用单宁，可提高各类葡萄酒的质量和稳定性，并可保证葡萄酒良好的贮藏性。值得注意的是芳香类化合物在果实成熟期也有所下降。这其中包括几种甲氧基吡嗪类化合物的减少，这类化合物引起索维浓酒中的燥辣味等[12]，可以使葡萄酒拥有一些特征性味道。
尽管在浆果的第一生长周期化合物发生了重要变化，但最重要的是化合物含量在第二生长周期发生了重大的提高（主要是葡萄糖和果糖），使得果实从总生化反应转入果实成熟模式[7]。2 葡萄浆果发育组学研究概述
葡萄基因组测序的完成，进一步促进了葡萄分子生物学的快速发展。葡萄基因组学以及蛋白组学研究得到了更多的重视并有了快速发展。2.1 葡萄遗传图谱研究
遗传图谱是研究质量性状和数量性状遗传的基础，对标记辅助选择、图位克隆，以及将标记整合到基因组序列上具有重要意义。利用分子标记技术构建的葡萄高密度遗传图谱，不仅能明确染色体上基因间的距离及它们之间的相互关系，服务于葡萄全基因组的测序，而且可以对控制结
果期、风味、抗病性等性状基因或基因组区进行定位，达到标记辅助选择育种、筛选优势亲本材料等分子标记育种的目的[13-14]。
自葡萄第一张遗传图谱由Lodhi [14]等于1995年发表以来，葡萄遗传图谱研究迅猛发展。Lahogue 等[15]用140个随机引物对葡萄无核性状进行分析得到了RAPD 标记与主效的显性基因紧密连锁。王跃进等[16]利用细菌质粒M13克隆葡萄无核基因的RAPD 标记UBC269-480，用其作引物可进行无核筛选与鉴定，加速无核葡萄育种进程，提高育种效果。美国加利福尼亚州立大学从8个cDNA 文库中开发了1000个EST-SSR 标记，广泛应用在葡萄遗传图构建上。与其它生物一样，葡萄基因组中也存在着大量SNP ，Troggio 等[17]、Salmaso 等[18]和Vezzulli 等[19]分别将483、138、501个SNP 位点定位到遗传图上。这些SNP 位点大部分来自于EST 和BAC （bacteria artificial chromosome ）文库，所以很多功能基因位点也被定位到遗传图谱上。目前，这项技术已用在葡萄无核性状、抗病性和果皮颜色的早期鉴定与选择上[20-25]。定位的性状包括花型、果色等质量性状[26-27,
19]
进化过程的认识，而且为葡萄基因克隆与功能分析以及最终达到葡萄遗传改良的目的提供重要基因资源。拟南芥基因功能的信息为葡萄基因功能的研究提供了模式体系。所有这些为鉴定葡萄重要性状的调控基因和研究其功能勾划出了清晰的框架。
葡萄EST 在公共数据库中的大量释放丰富了葡萄的基因组序列信息，不仅方便了葡萄功能基因的发掘与克隆[32-36]以及SNP 、SSR 等标记的大量开发 [37-39]，而且为葡萄基因组序列的注释提供重要信息资源，截至2011年3月29日，GenBank 已公布的葡萄EST 序列已达到362,392条，其数量在所有登陆物种EST 数量中位列第25位。葡萄基因的克隆与功能分析也有了大量报道。尽管根据葡萄基因组的序列已经预测到了涉及葡萄花、果、叶等多种器官的生长发育的28305条葡萄基因，但是，随着对葡萄基因组全序列信息的挖掘以及对这些侯选基因的验证，有关葡萄功能基因的数量将随之改变。迄今，已经克隆并进行功能验证的葡萄基因的数量有限。应该说，随着对越来越多的葡萄基因的认识，将为葡萄基因工程提供重要的工作基础，对于葡萄生长发育的调控以及基因组序列的精确注释也具有重要帮助。
microRNAs （miRNAs ）作为一种新型的调控小RNA ，在植物生长发育的调控中发挥着极其重要的生物学作用[40-41]。miRNAs 通过介导其靶基因的裂解或抑制靶基因的翻译，调控其靶基因的
和抗病性、果实成熟期、无核
性状、叶形等数量性状[26，28-29]。2.2 葡萄浆果基因组学研究
基因组学技术的快速发展与应用以及黑比诺葡萄的基因组测序的完成[30-31]为葡萄基因组的认识提供了研究手段与重要信息。这不仅有助于科学家对开花植物
2011.09
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综 述
表达而起作用。因此，有关葡萄miRNAs 及其功能分析是葡萄基因组学尤其是功能基因组学重要部分。近年来，关于葡萄miRNAs 及其靶基因的生物信息学法鉴定以及特征性分析的研究也逐渐受到了重视[42-44]，目前，miRBase 17.0序列数据库已收录163条葡萄miRNA 。Wang C等
[45]
Zhang 等[50]以赤霞珠葡萄为材料，对果实成熟过程中的质膜蛋白进行了研究。Sarry 等[51]、Negri 等[52]和Grmiplet 等[53]对果皮在浆果成熟过程中变化及影响进行研究，葡萄果皮颜色的变化有助于了解葡萄所处的不同成熟阶段，是了解葡萄成熟的标尺。
目前用于蛋白质组学研究的几乎都是酿酒品种。积极开展蛋白质组学在鲜食品种中的研究不仅可以提高鲜食品种果实的品质，还能更好地为实现其经济价值提供理论指导。葡萄的经济价值来源于果实，因此有关葡萄果实发育、品质形成的研究成为葡萄蛋白质组学研究的核心。葡萄浆果的成熟过程涉及了大量程序性蛋白质和代谢途径的变化，蛋白质组学将果实成熟过程中的蛋白质变化研究由单个或少数的蛋白质，提升到多代谢途径和蛋白质群体变化的水平，有助于更好的研究与认识葡萄果实生长发育机制。3 小结
葡萄基因组测序的完成，既是一项基础性的成就，同时又是在分子水平上研究葡萄浆果发育的好起点。这将促使人们通过基因工程手段改良葡萄浆果性状，使其更加有效地调控葡萄生产性能，从而对葡萄浆果品质、果色、丰产性、成熟期、无核性状和抗病性以及田间管理操作等产生重要影响。葡萄基因组学、蛋白质组学的发展不仅促进了这些目标的实现，而且对葡萄研究工作者提出了更富挑战性的新任务。
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成功地开展了葡萄花与果实
miRNAs 文库的高通量测序，利用测序得到的序列验证了葡萄中140条生物信息学预测的保守的miRNAs ，并发现80条葡萄中特有的miRNAs 。半定量RT-PCR 分析发现20条miRNAs 仅在果实中表达，而其它组织中无表达信号，表明这些miRNAs 可能与葡萄果实的发育有着密切的联系。2.3 葡萄蛋白质组学研究
人类基因组计划的完成标志着生命科学已进入后基因组时代，蛋白质组学的研究被提升到了前所未有的高度，蛋白质组学旨在阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。伴随葡萄基因组测序工作的完成，有关葡萄蛋白质组学的研究迅速发展。近年来蛋白质组学在葡萄浆果上的研究时有报道，Giribaldi 等研究了葡萄果实发育和品质形成过程中蛋白质组的变化。Waters 等
[47]
[46]
、
Deytieux 等[48]和Vincent 等[49]分别对细胞壁进行了深入的研究，细胞壁控制着细胞的大小，在一定程度上保护着细胞不受膨压变化的伤害，果实的膨大和成熟涉及复杂的细胞壁松弛和修饰过程。
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