现代食品科技
Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.7
滑子菇多糖的结构分析
陈健，向莹
（华南理工大学, 轻工与食品学院，广东广州 510640）
摘要：本文以滑子菇中分离纯化得到一种多糖PNP 为研究对象，通过高效凝胶渗透色谱法测定分子量及其分布，红外光谱、气相色谱法、部分酸水解、高碘酸氧化法、Smith 降解法、甲基化分析、1HNMR 、氨基酸和β-消除反应分析多糖的结构，刚果红实验、碘-碘化钾实验对该多糖溶液行为进行研究。分析表明，PNP 的重均分子量为20199 Da单糖，且摩尔比为1.5:3.36:14.2:1；经高碘酸氧化和Smith 降解后表明，PNP 中没有1→4糖苷键，而且:1→6键为1.42:5.06:1；PNP 具有典型的多糖红外吸收，糖链以β旋结构，含有较长的侧链和分枝。
关键词：滑子菇；多糖；单糖组成；结构 文章篇号：1673-9078(2013)7-1544-1550
CHEN Jian, XIANGAbstract:and GC-MS, 1HNMR, amino acids and β-elimination reaction, and solution action was studied by Congo red and composed of (1→2)-linked, (1→3)-linked and (1→6)of 1.42: 5.06:1, and had no (1→4)-linked; PNP possessed typical infrared absorption of polysaccharides β-configuration pyranoside and a kind of contained protein Key words:
滑子菇（三宗食用菌品种，是食用、药用兼备的食用菌新秀[1]，随着当今社会栽培技术的普及与提高，滑子菇已成为人们“菜篮子”中的常见蔬菜。
多糖是由10个以上单糖基通过苷键连接而成的。通常多糖由几百个至几千个单聚糖聚合而成其性质已
收稿日期：2013-03-31
作者简介：陈健（1967-），男，博士，副教授，天然产物与分离技术
完全不同于单糖，无甜味，且强还原性消失。多糖的
一级结构与生物活性具有密切的关系，多数具有突出生物活性的多糖都以(1→3)糖苷键连接，同时带有一些侧链，糖基上还连接有一些特殊的功能团。对于多糖的结构测定，测定多糖糖链的一级结构，主要解决的问题有相对分子质量，糖链的单糖组成以及摩尔比，糖醛酸检测，各单糖残基的D-或L-构型及吡喃环或呋喃环形式，每个单糖残基上羟基取代情况，各个糖苷键的α-或β-异头异构形式，糖链和非糖部分连接情况，糖残基可能链接硫酸酯基、乙酰基、甲基的类型，主链和支链的连接位点等。明确多糖中糖链的结构信息对于了解多糖的性质，进一步了解糖类物质在生物体内的活动的微观行为和本质具有重要意义。 目前，对滑子菇多糖的研究较少，特别是滑子菇多糖结构的研究鲜见报道。本文对滑子菇多糖的分子量、单糖组成、多糖的主干结构以及糖溶液行为进行
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研究。 取2 mg PNP，与KBr 混合研细后，在4000~400 cm -1范围内进行红外扫描。
1 材料与方法 1.1 主要材料与仪器
主要实验材料如下：滑子菇，购于广州一德路干货市场；D354FD 树脂，广州市广联津化工有限公司生产；732强酸性阳离子树脂，上海凯金树脂华工责任公司；Whatman DEAE-52，广州展晨生物科技有限公司进口分装；葡聚糖标准品（5200、16800、27300、4100000、6700000和1400000 Da），美国Sigma 公司生产；单糖标准品葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和赤藓醇，美国Sigma 公司生产；其它试剂为国产分析纯。
主要实验仪器如下：DZTW 型调温电热套，北京市永光明医疗仪器厂生产；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器生产；UV -5200型紫外/可见分光光度计，上海元析仪器有限公司生产；UV -2102 PC型紫外可见分光光度计，苏州江东精密仪器有限公司；BT-200型恒流泵DBS-100型自动部分收集器，上海沪西仪器厂生产；冷冻干燥系统，美国Thermo 公司生产；V ector 33型傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruck 公司生产；液相色谱系统，美国Waters 公司生产；气相色谱系统，美国Aglient 公司生产。
1.2.4 单糖组成分析
多糖的水解：称取20 mg PNP于安培瓶中，加4mL 2 mol/L的三氟乙酸，酒精灯封口，于110 ℃水解6 h。将水解液减压蒸干，加适量的甲醇溶解，再减压蒸干，重复多次以除尽残余的三氟乙酸。
乙酰化：往PNP 的水解物、单糖标准品中加入10 mg盐酸羟胺和1 mL吡啶，30 min并振荡，冷却至室温，加入乙酸酐90 ℃水浴中保持30 min物。
色谱条件：柱柱m×0.25 m×0.25 m) 。程序升温：2 ℃220 ℃，保持2 min℃，保持2 min；进250 ℃，检测器温300
于0.1 mol/L三氟乙酸，85 ℃水解8 GC 分析，取上清液减压蒸干。将透析3 d。将透析袋内、外溶液浓GC 测其单糖组成。
1.2 试验方法
1.2.1 滑子菇多糖的分离纯化工艺
滑子菇打粉过40目筛，称取100 g30:1加蒸馏水于5000 mL时3 h。静置沉淀1 h后，并浓缩。浓缩后按照阴离子树脂，50 ℃水浴3 h 1:4加95%4 12 h，4000 r/min离心15 minSevag [2]试剂脱蛋白，离心，100 mg，过、0.2、0.3 mol/L NaCl和蒽酮-硫酸[3]法追踪测吸多糖PNP 。
高碘酸氧化
1.2.6.1 高碘酸氧化
高碘酸钠标准曲线：取6支干燥试管，编号分别为0，1……5，依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0和4.0 mL 的高碘酸钠（30 mmol/L）溶液，再依次补水到总体积为4 mL，混匀后各取0.1 mL，定容至25 mL，于223 nm处测定光密度值。横坐标为高碘酸的钠毫摩尔数，纵坐标为光密度值。
取多糖样品25 mg，用少量水溶解于50 mL容量瓶中，然后加入50 mmol/L NaIO 4 15 mL ，定容，使NaIO 4终浓度为15 mmol/L。放置在暗处反应(室温) ，间隔时间(0、6、12、24、36、48、60……h) 取样0.1 mL，用蒸馏水稀释250倍，以蒸馏水作空白对照，在223 nm波长处测光密度值，直到光密度值恒定为止。加乙二醇终止反应，高碘酸氧化完成。而后通过查标准曲线，就可计算出高碘酸的消耗量。
1.2.6.2 甲酸生成量测定
取2 mL 上述氧化液，加1滴酚酞作指示剂，用0.01 mol/L NaOH(用邻苯二氢钾标定) 滴定，计算得甲酸生成量。
1.2.2 PNP
PNP 的相对分子质量用高效凝胶渗透色谱（GPC ）测定。将样品配成2 mg/mL的水溶液，过膜后进样。色谱条件为：TSK-GEL G-5000PWXL柱(7.8 mm×300 mm) 与TSK-GEL G-2500PWXL 柱(7.8 mm×300 mm) 串联，流动相为0.01 mol/L的KH 2PO 4溶液，流速为0.6 mL/min，柱温为30 ℃。
1.2.7 Smith 降解
经高碘酸氧化后的多糖溶液，加入1.0 mL 乙二
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1.2.3 红外光谱分析
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醇，混匀后室温放置2 h 以还原剩余的高碘酸。对自来水透析48 h，再用蒸馏水透析24 h。减压蒸干。加入4o mg NaBH4，搅拌均匀后室温暗处放置24 h以还原多糖醛。0.l mol/L醋酸调pH 至5.0，对自来水(流水) 透析48 h，再用蒸馏水透析24 h，减压蒸干。将样品水解、乙酰化后用气相测定单糖。
横坐标，最大吸收波长为纵坐标作图。
1.2.13 碘-碘化钾反应
取滑子菇多糖PNP 样品2 mg，加2 mL的蒸馏水溶解，再加1.2 mL碘试剂（含0.02% I2的0.2% KI溶液），混匀之后用紫外光谱在300~700 nm进行扫描。
1.2.8 甲基化分析
称取滑子菇多糖PNP 样品20 mg，用五氧化二磷干燥后，加6 mL 的DMSO 溶解并用N 2封口，加热
搅拌混匀，加NaOH 悬浊液（6 mL的DMSO 含有240 mg 的NaOH ），过夜。加3.6 mL的CH 3I ，搅拌8 min，用N 2吹走CH 3I ，再次甲基化，如此重复3次后，加6 mL 的蒸馏水中止反应。流水和蒸馏水各透析24 h 后，用CHCl 3萃取3次，用无水Na 2SO 4干燥24 h ，然后蒸干约1 mL，采用1.5中水解的方法进行水解，之后加70 mg NaBH4搅拌24 h，再加732强酸性阳离子交换树脂搅拌混匀10 min，抽滤，收集滤液加甲醇，蒸干，按照4.4.1中乙酰化方式进行衍生化，再进行GC-MS 分析。
2 结果与讨论
2.1 滑子菇多糖的柱层析分离纯化
滑子菇多糖的柱层析图
Pholiota
with column chromatography
1.2.9 核磁共振分析
50 mg 的滑子菇纯多糖PNP 溶于1.0 mL 的D 2O 中，静置过夜，冷冻干燥后继续加1.0 mL 的D 2O 溶解，如此重复三次，最后用0.8 mL 的D 2O 1DEAE-52柱层析，、0.2 mol/L NaCl、0.3 mol/L 溶液洗脱，只有用0.1 mol/L 收集40到54管，透析后，冻干。
1.2.10 氨基酸种类测定
称取滑子菇20 mg于18 mm×管中，加HCl （6 mol/L）L 真空下封管，于110 的容量瓶中定容。经μ条件：PICO.TAG 测器，波长为，乙腈-水（体积比1:1）溶液，，pH 6.5，含为1:2。
PNP 的相对分子质量
β-
PNP ，加2.5 mL的蒸馏的NaOH 溶液（0.4 mol/L），置于45 3 h后用紫外光谱进行扫描。另取5 mgPNP 样品，加5.0 mL的蒸馏水溶解，水浴45 ℃下保温3 h，用紫外光谱仪扫描。
图2 PNP的GPC 图 Fig. 2 GPC of PNP
图2是滑子菇多糖PNP 的GPC 图。PNP 的峰位相对分子量Mp 为20537 Da，重均相对分子量Mw 是20199 Da，数均相对分子量Mn 为19437 Da，Z 均相
对分子量Mz 为20921 Da。多糖相对分子量多分散性指数为α，即Mw/Mn。α可以作为高分子分子量分布的表征，离1越近，分子量的分布就越窄，离1越远，分子量的分布就越宽，也就是分散程度越大[4]。PNP 的α为1.039，接近于1，表示滑子菇多糖的相对分子
1.2.12 刚果红实验
称取5 mg PNP ，加入2 mL 蒸馏水和2 mL 80
μmol/L的刚果红试剂，逐渐加入1 mol/L的NaOH ，使溶液中NaOH 终浓度由0 mol/L逐渐升高到0.5 mol/L，并用紫外可见记录光谱仪进行扫描，测得各Na0H 浓度条件下的最大吸收波长。以NaOH 浓度为
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质量分布较集中。此外，由GPC 图可看出，PNP 是单一多糖。活性多糖具有一定的分子质量范围，多糖分子质量太大，不利于其跨越细胞膜进入生物体内发挥生物学活性，而分子质量过低，也没有活性[5~6]。
是由这3种组成；PNP b 检测到木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，构成主链的核心区域；PNP c 检测到甘露糖和葡萄糖，说明它们存在于支链货主链的末端。
2.3 PNP 的红外光谱分析
乳糖，摩尔比为1.5:3.36:14.2:1。
2 mol 高碘酸，生成1 mol甲酸；1→2、1→4键只消耗
高碘酸；1→3键则不消耗高碘酸。因此，通过测定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目等。 根据图5可算出，PNP 经高碘酸氧化反应72 h 期间每摩尔糖残基消耗的高碘酸的量为0.457 mmol 高碘酸，每摩尔的PNP 同时也产生0.134 mmol 的甲
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2.5 部分酸水解
用较低浓度的三氟乙酸对样品进行水解，通过水解产物的单糖组成及含量变化，判断多糖中主链和支 链的单糖组成，PNP 的部分酸水解产物的单糖组成见表1。
PNP a 中检测到木糖、甘露糖和葡萄糖，说明主链
酸，由此说明存在1→2、1→4和1→6连接键型，并且1→3键与消耗高碘酸的1→2(1→4、1→6) 键之比约为2.1:1。
表2 PNP甲基化产物分析结果 Table 2 Methylation analysis of PNP
峰号
甲基化 单糖键型
2,5-Di-O-acetyl-3,4,6-tri -O-methyl-D-Man 5-O-acetyl-3,4-di-O- methyl-D-Xyl 3,5-Di-O-acetyl-2,4,6-tri -O-methyl-D-Glu 3,5-Di-O-acetyl-2,4-di 保留时
糖苷
摩尔百分
间/min 键类型 比/(mol%) 6.130 1→ 11.44 5.41 61.34
1 2 3
图5 高碘酸钠标准曲线
Fig.5 Standard curve of NaIO4 concentration
4 5 6 1→3 1→6 1→3,
1→6
5.28 2.73 3.21 8.32
10.569
分析
图6 Smith降解后PNP
Smith 降解可以将被氧化1→2若为1→41→不被氧化降解；而1→6从图6可以看出，经糖中不含有14键，1→2、1→4和1→6可推断出PNP 中1，因此1→2键:1→3→6(1→并带有β-1,6侧链，分支度为33%[9]。
图7 滑子菇多糖PNP 的核磁共振氢谱 Fig.7 1H-NMR Spectroscopy of PNP
1
图7是滑子菇多糖PNP 的1H-NMR 谱。H-NMR 主要是用来确定多糖中糖苷键的构型。多糖的1H 信号比较集中，大多数在δ3.2~5.5 ppm这个狭小的范围内，而δ3.5~4.5 ppm 一般是糖环质子的信号[10]，在
δ1.12~3.66 ppm 范围的信号为蛋白质中氨基酸残基的β-H 和γ-CH 3、-CH 2、-CH 上的1H 化学位移信号，甲基五(六) 碳糖的甲基信号在δ1.0 ppm左右。因此可以从端基质子信号的个数和化学位移推测糖的个数、种类及糖与糖、糖与普元的连接位置等等。根据甲基质子信号的个数和化学位移值可推测含甲基五(六) 碳糖的个数、种类及糖与糖、糖与昔元的连接位置等。一般α型糖苷的异头碳上氢质子的共振信号的化学位移大于δ5.0 ppm，而β型糖苷的化学位移低于δ5.0 ppm。因此，从谱图中可以看到，异头碳上氢的化学
2.7 PNP
甲基化的分析结果表明，甘露糖同时含有1→和1→3糖苷键，其中1→糖苷键为主，占11.44%；木糖
只含有1→2糖苷键；葡萄糖的含量最多，以1→3糖苷键为主，同时也有1→6糖苷键，并且葡萄糖的1→3糖苷键摩尔百分比为69.66%；半乳糖的含量最低，糖苷键类型有1→3和1→6两种，仍然以1→3糖苷键为主。
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位移大于δ5.0 ppm 只有一个，其化学位移为δ5.06 ppm ，其余的都小于δ5.0 ppm，这表示滑子菇多糖PNP 存在α和β糖苷键构型，并以β型为主。PNP 在异头碳区(δ5.3~4.4)有6个不同强度的信号，除了δ4.70处有一个宽而高的峰，是溶剂D 2O 中的残余氢峰，另外5个峰表示的是PNP 糖链中有5个糖残基组成的重复单位。PNP 的氢质子在δ0.99~δ3.66也有共振信号，
于经碱处理后的O-糖苷键的会产生α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸导致240 nm处的光吸收增加，因此可以说明在PNP 中含有O-糖苷键。
2.11 刚果红实验分析
刚果红(Cnogoerd)是一种酸性染料，可与具有三股螺旋链构象的多糖形成络合物，刚果红的最大吸收波长发生红移，在一定的NaOH 浓度范围内，表现为最大吸收波长的特征变化(变成紫红色) ，当NaOH 浓
或
图8 经0.2mol/L的NaOH 处理前后滑子菇多糖紫外光谱 Fig.8 UV spectra change of PNP treated by 0.2 mol/L NaOH
加入0.2 mol/L的NaOH 溶液于滑子菇多糖PNP 的水溶液中，在45 ℃水浴下反应1.5 h 后，在定190 nm~400 nm 下进行扫描，与不加NaOH 的PNP 溶液的扫描结果进行比较。从图8中可知，经过稀碱处理后的PNP 的紫外扫描在
240 nm 处吸收增加，这是由
图10 PNP与I2-KI 的反应物紫外可见光谱图 Fig.10 UV-Vis spectrum after PNP reacted with I2-KI
滑子菇多糖溶液与碘试剂混匀后紫外可见扫描光
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谱图如10所示，由于滑子菇多糖与I 2-KI 的反应物最大吸收峰在367 nm处，而在565 nm处无最大吸收[12]，说明该多糖可能存在较长的侧链和较多的分枝。
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3 结论
本文对滑子菇进行水提醇沉、脱蛋白、脱色和DEAE52纤维素柱层析得到一种相对分子质量分布较集中的多糖PNP 。PNP 相对分子质量为20199 Da，红外光谱分析表明PNP 是典型的多糖结构，其单糖组成含有木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，并且主链是由木糖、甘露糖和葡萄糖组成的，通过高碘酸氧化、Smith 降解和甲基化分析含有的C-C 单键有1→2键、1→3键和1→6（1→）键；采用1HNMR 、氨基酸和β-消除反应分析得出PNP 是一种粘多糖，通过溶液的行为研究表明PNP 具有三股螺旋结构并且含有较长的侧链和较多的分枝。这对滑子菇多糖产品的开发和利用提供一定的理论依据。对于单糖的位置、排序、糖环的大小、连接的方式等还有待进一步研究。
参考文献
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关键词：滑子菇；多糖；单糖组成；结构 文章篇号：1673-9078(2013)7-1544-1550
CHEN Jian, XIANGAbstract:and GC-MS, 1HNMR, amino acids and β-elimination reaction, and solution action was studied by Congo red and composed of (1→2)-linked, (1→3)-linked and (1→6)of 1.42: 5.06:1, and had no (1→4)-linked; PNP possessed typical infrared absorption of polysaccharides β-configuration pyranoside and a kind of contained protein Key words:
滑子菇（三宗食用菌品种，是食用、药用兼备的食用菌新秀[1]，随着当今社会栽培技术的普及与提高，滑子菇已成为人们“菜篮子”中的常见蔬菜。
多糖是由10个以上单糖基通过苷键连接而成的。通常多糖由几百个至几千个单聚糖聚合而成其性质已
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作者简介：陈健（1967-），男，博士，副教授，天然产物与分离技术
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现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.7
研究。 取2 mg PNP，与KBr 混合研细后，在4000~400 cm -1范围内进行红外扫描。
1 材料与方法 1.1 主要材料与仪器
主要实验材料如下：滑子菇，购于广州一德路干货市场；D354FD 树脂，广州市广联津化工有限公司生产；732强酸性阳离子树脂，上海凯金树脂华工责任公司；Whatman DEAE-52，广州展晨生物科技有限公司进口分装；葡聚糖标准品（5200、16800、27300、4100000、6700000和1400000 Da），美国Sigma 公司生产；单糖标准品葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和赤藓醇，美国Sigma 公司生产；其它试剂为国产分析纯。
主要实验仪器如下：DZTW 型调温电热套，北京市永光明医疗仪器厂生产；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器生产；UV -5200型紫外/可见分光光度计，上海元析仪器有限公司生产；UV -2102 PC型紫外可见分光光度计，苏州江东精密仪器有限公司；BT-200型恒流泵DBS-100型自动部分收集器，上海沪西仪器厂生产；冷冻干燥系统，美国Thermo 公司生产；V ector 33型傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruck 公司生产；液相色谱系统，美国Waters 公司生产；气相色谱系统，美国Aglient 公司生产。
1.2.4 单糖组成分析
多糖的水解：称取20 mg PNP于安培瓶中，加4mL 2 mol/L的三氟乙酸，酒精灯封口，于110 ℃水解6 h。将水解液减压蒸干，加适量的甲醇溶解，再减压蒸干，重复多次以除尽残余的三氟乙酸。
乙酰化：往PNP 的水解物、单糖标准品中加入10 mg盐酸羟胺和1 mL吡啶，30 min并振荡，冷却至室温，加入乙酸酐90 ℃水浴中保持30 min物。
色谱条件：柱柱m×0.25 m×0.25 m) 。程序升温：2 ℃220 ℃，保持2 min℃，保持2 min；进250 ℃，检测器温300
于0.1 mol/L三氟乙酸，85 ℃水解8 GC 分析，取上清液减压蒸干。将透析3 d。将透析袋内、外溶液浓GC 测其单糖组成。
1.2 试验方法
1.2.1 滑子菇多糖的分离纯化工艺
滑子菇打粉过40目筛，称取100 g30:1加蒸馏水于5000 mL时3 h。静置沉淀1 h后，并浓缩。浓缩后按照阴离子树脂，50 ℃水浴3 h 1:4加95%4 12 h，4000 r/min离心15 minSevag [2]试剂脱蛋白，离心，100 mg，过、0.2、0.3 mol/L NaCl和蒽酮-硫酸[3]法追踪测吸多糖PNP 。
高碘酸氧化
1.2.6.1 高碘酸氧化
高碘酸钠标准曲线：取6支干燥试管，编号分别为0，1……5，依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0和4.0 mL 的高碘酸钠（30 mmol/L）溶液，再依次补水到总体积为4 mL，混匀后各取0.1 mL，定容至25 mL，于223 nm处测定光密度值。横坐标为高碘酸的钠毫摩尔数，纵坐标为光密度值。
取多糖样品25 mg，用少量水溶解于50 mL容量瓶中，然后加入50 mmol/L NaIO 4 15 mL ，定容，使NaIO 4终浓度为15 mmol/L。放置在暗处反应(室温) ，间隔时间(0、6、12、24、36、48、60……h) 取样0.1 mL，用蒸馏水稀释250倍，以蒸馏水作空白对照，在223 nm波长处测光密度值，直到光密度值恒定为止。加乙二醇终止反应，高碘酸氧化完成。而后通过查标准曲线，就可计算出高碘酸的消耗量。
1.2.6.2 甲酸生成量测定
取2 mL 上述氧化液，加1滴酚酞作指示剂，用0.01 mol/L NaOH(用邻苯二氢钾标定) 滴定，计算得甲酸生成量。
1.2.2 PNP
PNP 的相对分子质量用高效凝胶渗透色谱（GPC ）测定。将样品配成2 mg/mL的水溶液，过膜后进样。色谱条件为：TSK-GEL G-5000PWXL柱(7.8 mm×300 mm) 与TSK-GEL G-2500PWXL 柱(7.8 mm×300 mm) 串联，流动相为0.01 mol/L的KH 2PO 4溶液，流速为0.6 mL/min，柱温为30 ℃。
1.2.7 Smith 降解
经高碘酸氧化后的多糖溶液，加入1.0 mL 乙二
1545
1.2.3 红外光谱分析
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.7
醇，混匀后室温放置2 h 以还原剩余的高碘酸。对自来水透析48 h，再用蒸馏水透析24 h。减压蒸干。加入4o mg NaBH4，搅拌均匀后室温暗处放置24 h以还原多糖醛。0.l mol/L醋酸调pH 至5.0，对自来水(流水) 透析48 h，再用蒸馏水透析24 h，减压蒸干。将样品水解、乙酰化后用气相测定单糖。
横坐标，最大吸收波长为纵坐标作图。
1.2.13 碘-碘化钾反应
取滑子菇多糖PNP 样品2 mg，加2 mL的蒸馏水溶解，再加1.2 mL碘试剂（含0.02% I2的0.2% KI溶液），混匀之后用紫外光谱在300~700 nm进行扫描。
1.2.8 甲基化分析
称取滑子菇多糖PNP 样品20 mg，用五氧化二磷干燥后，加6 mL 的DMSO 溶解并用N 2封口，加热
搅拌混匀，加NaOH 悬浊液（6 mL的DMSO 含有240 mg 的NaOH ），过夜。加3.6 mL的CH 3I ，搅拌8 min，用N 2吹走CH 3I ，再次甲基化，如此重复3次后，加6 mL 的蒸馏水中止反应。流水和蒸馏水各透析24 h 后，用CHCl 3萃取3次，用无水Na 2SO 4干燥24 h ，然后蒸干约1 mL，采用1.5中水解的方法进行水解，之后加70 mg NaBH4搅拌24 h，再加732强酸性阳离子交换树脂搅拌混匀10 min，抽滤，收集滤液加甲醇，蒸干，按照4.4.1中乙酰化方式进行衍生化，再进行GC-MS 分析。
2 结果与讨论
2.1 滑子菇多糖的柱层析分离纯化
滑子菇多糖的柱层析图
Pholiota
with column chromatography
1.2.9 核磁共振分析
50 mg 的滑子菇纯多糖PNP 溶于1.0 mL 的D 2O 中，静置过夜，冷冻干燥后继续加1.0 mL 的D 2O 溶解，如此重复三次，最后用0.8 mL 的D 2O 1DEAE-52柱层析，、0.2 mol/L NaCl、0.3 mol/L 溶液洗脱，只有用0.1 mol/L 收集40到54管，透析后，冻干。
1.2.10 氨基酸种类测定
称取滑子菇20 mg于18 mm×管中，加HCl （6 mol/L）L 真空下封管，于110 的容量瓶中定容。经μ条件：PICO.TAG 测器，波长为，乙腈-水（体积比1:1）溶液，，pH 6.5，含为1:2。
PNP 的相对分子质量
β-
PNP ，加2.5 mL的蒸馏的NaOH 溶液（0.4 mol/L），置于45 3 h后用紫外光谱进行扫描。另取5 mgPNP 样品，加5.0 mL的蒸馏水溶解，水浴45 ℃下保温3 h，用紫外光谱仪扫描。
图2 PNP的GPC 图 Fig. 2 GPC of PNP
图2是滑子菇多糖PNP 的GPC 图。PNP 的峰位相对分子量Mp 为20537 Da，重均相对分子量Mw 是20199 Da，数均相对分子量Mn 为19437 Da，Z 均相
对分子量Mz 为20921 Da。多糖相对分子量多分散性指数为α，即Mw/Mn。α可以作为高分子分子量分布的表征，离1越近，分子量的分布就越窄，离1越远，分子量的分布就越宽，也就是分散程度越大[4]。PNP 的α为1.039，接近于1，表示滑子菇多糖的相对分子
1.2.12 刚果红实验
称取5 mg PNP ，加入2 mL 蒸馏水和2 mL 80
μmol/L的刚果红试剂，逐渐加入1 mol/L的NaOH ，使溶液中NaOH 终浓度由0 mol/L逐渐升高到0.5 mol/L，并用紫外可见记录光谱仪进行扫描，测得各Na0H 浓度条件下的最大吸收波长。以NaOH 浓度为
1546
质量分布较集中。此外，由GPC 图可看出，PNP 是单一多糖。活性多糖具有一定的分子质量范围，多糖分子质量太大，不利于其跨越细胞膜进入生物体内发挥生物学活性，而分子质量过低，也没有活性[5~6]。
是由这3种组成；PNP b 检测到木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，构成主链的核心区域；PNP c 检测到甘露糖和葡萄糖，说明它们存在于支链货主链的末端。
2.3 PNP 的红外光谱分析
乳糖，摩尔比为1.5:3.36:14.2:1。
2 mol 高碘酸，生成1 mol甲酸；1→2、1→4键只消耗
高碘酸；1→3键则不消耗高碘酸。因此，通过测定高碘酸消耗量及甲酸生成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目等。 根据图5可算出，PNP 经高碘酸氧化反应72 h 期间每摩尔糖残基消耗的高碘酸的量为0.457 mmol 高碘酸，每摩尔的PNP 同时也产生0.134 mmol 的甲
1547
2.5 部分酸水解
用较低浓度的三氟乙酸对样品进行水解，通过水解产物的单糖组成及含量变化，判断多糖中主链和支 链的单糖组成，PNP 的部分酸水解产物的单糖组成见表1。
PNP a 中检测到木糖、甘露糖和葡萄糖，说明主链
酸，由此说明存在1→2、1→4和1→6连接键型，并且1→3键与消耗高碘酸的1→2(1→4、1→6) 键之比约为2.1:1。
表2 PNP甲基化产物分析结果 Table 2 Methylation analysis of PNP
峰号
甲基化 单糖键型
2,5-Di-O-acetyl-3,4,6-tri -O-methyl-D-Man 5-O-acetyl-3,4-di-O- methyl-D-Xyl 3,5-Di-O-acetyl-2,4,6-tri -O-methyl-D-Glu 3,5-Di-O-acetyl-2,4-di 保留时
糖苷
摩尔百分
间/min 键类型 比/(mol%) 6.130 1→ 11.44 5.41 61.34
1 2 3
图5 高碘酸钠标准曲线
Fig.5 Standard curve of NaIO4 concentration
4 5 6 1→3 1→6 1→3,
1→6
5.28 2.73 3.21 8.32
10.569
分析
图6 Smith降解后PNP
Smith 降解可以将被氧化1→2若为1→41→不被氧化降解；而1→6从图6可以看出，经糖中不含有14键，1→2、1→4和1→6可推断出PNP 中1，因此1→2键:1→3→6(1→并带有β-1,6侧链，分支度为33%[9]。
图7 滑子菇多糖PNP 的核磁共振氢谱 Fig.7 1H-NMR Spectroscopy of PNP
1
图7是滑子菇多糖PNP 的1H-NMR 谱。H-NMR 主要是用来确定多糖中糖苷键的构型。多糖的1H 信号比较集中，大多数在δ3.2~5.5 ppm这个狭小的范围内，而δ3.5~4.5 ppm 一般是糖环质子的信号[10]，在
δ1.12~3.66 ppm 范围的信号为蛋白质中氨基酸残基的β-H 和γ-CH 3、-CH 2、-CH 上的1H 化学位移信号，甲基五(六) 碳糖的甲基信号在δ1.0 ppm左右。因此可以从端基质子信号的个数和化学位移推测糖的个数、种类及糖与糖、糖与普元的连接位置等等。根据甲基质子信号的个数和化学位移值可推测含甲基五(六) 碳糖的个数、种类及糖与糖、糖与昔元的连接位置等。一般α型糖苷的异头碳上氢质子的共振信号的化学位移大于δ5.0 ppm，而β型糖苷的化学位移低于δ5.0 ppm。因此，从谱图中可以看到，异头碳上氢的化学
2.7 PNP
甲基化的分析结果表明，甘露糖同时含有1→和1→3糖苷键，其中1→糖苷键为主，占11.44%；木糖
只含有1→2糖苷键；葡萄糖的含量最多，以1→3糖苷键为主，同时也有1→6糖苷键，并且葡萄糖的1→3糖苷键摩尔百分比为69.66%；半乳糖的含量最低，糖苷键类型有1→3和1→6两种，仍然以1→3糖苷键为主。
1548
位移大于δ5.0 ppm 只有一个，其化学位移为δ5.06 ppm ，其余的都小于δ5.0 ppm，这表示滑子菇多糖PNP 存在α和β糖苷键构型，并以β型为主。PNP 在异头碳区(δ5.3~4.4)有6个不同强度的信号，除了δ4.70处有一个宽而高的峰，是溶剂D 2O 中的残余氢峰，另外5个峰表示的是PNP 糖链中有5个糖残基组成的重复单位。PNP 的氢质子在δ0.99~δ3.66也有共振信号，
于经碱处理后的O-糖苷键的会产生α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸导致240 nm处的光吸收增加，因此可以说明在PNP 中含有O-糖苷键。
2.11 刚果红实验分析
刚果红(Cnogoerd)是一种酸性染料，可与具有三股螺旋链构象的多糖形成络合物，刚果红的最大吸收波长发生红移，在一定的NaOH 浓度范围内，表现为最大吸收波长的特征变化(变成紫红色) ，当NaOH 浓
或
图8 经0.2mol/L的NaOH 处理前后滑子菇多糖紫外光谱 Fig.8 UV spectra change of PNP treated by 0.2 mol/L NaOH
加入0.2 mol/L的NaOH 溶液于滑子菇多糖PNP 的水溶液中，在45 ℃水浴下反应1.5 h 后，在定190 nm~400 nm 下进行扫描，与不加NaOH 的PNP 溶液的扫描结果进行比较。从图8中可知，经过稀碱处理后的PNP 的紫外扫描在
240 nm 处吸收增加，这是由
图10 PNP与I2-KI 的反应物紫外可见光谱图 Fig.10 UV-Vis spectrum after PNP reacted with I2-KI
滑子菇多糖溶液与碘试剂混匀后紫外可见扫描光
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谱图如10所示，由于滑子菇多糖与I 2-KI 的反应物最大吸收峰在367 nm处，而在565 nm处无最大吸收[12]，说明该多糖可能存在较长的侧链和较多的分枝。
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3 结论
本文对滑子菇进行水提醇沉、脱蛋白、脱色和DEAE52纤维素柱层析得到一种相对分子质量分布较集中的多糖PNP 。PNP 相对分子质量为20199 Da，红外光谱分析表明PNP 是典型的多糖结构，其单糖组成含有木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，并且主链是由木糖、甘露糖和葡萄糖组成的，通过高碘酸氧化、Smith 降解和甲基化分析含有的C-C 单键有1→2键、1→3键和1→6（1→）键；采用1HNMR 、氨基酸和β-消除反应分析得出PNP 是一种粘多糖，通过溶液的行为研究表明PNP 具有三股螺旋结构并且含有较长的侧链和较多的分枝。这对滑子菇多糖产品的开发和利用提供一定的理论依据。对于单糖的位置、排序、糖环的大小、连接的方式等还有待进一步研究。
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