中药益智仁盐炙前后总黄酮含量的对比研究1
黄勤挽，杨婧，刘苇，李兴迎，胡昌江，谢秀琼
成都中医药大学，成都（611137）
E-mail ：[email protected]
摘 要：目的：《中国药典》2005年版一部益智药材项下，含量测定部分仅仅收载了挥发油含量测定。本文考察不同来源益智药材的饮片——益智仁及盐益智仁中总黄酮的含量，为益智饮片的质量标准研究提供依据。方法：取不同来源的13批益智药材，制备成益智仁和盐益智仁饮片。以无水芦丁为对照，用AlCl 3-NaNO 2-NaOH 显色，利用紫外－可见分光光度法测定益智仁和盐益智仁中总黄酮的含量。结果：13批益智仁饮片中总黄酮含量在0.35%～1.92%之间，盐益智仁饮片中总黄酮含量在0.32%～1.68%之间。结论：建立的益智仁和盐益智仁总黄酮含量测定方法简便、可行，可为益智仁饮片和盐益智仁饮片的质量控制提供参考。中药益智仁盐炙后总黄酮含量有一定的降低。 关键词：益智仁，盐益智仁，总黄酮含量
1．引言
益智为姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实，药用部位通常为种仁。临床上益智仁常生用或盐炙用，益智仁盐炙应用的历史悠久，炮制方法始见于宋代《洪氏集验方》“取仁盐炒用”。生益智仁辛温而燥，主要归脾经，以温脾止泻、收摄涎唾力胜，多用于腹痛吐泻、口涎自流；盐炙可缓和辛燥之性，主要归肾经，专行下焦，长于固精、缩尿，用于肾气虚寒的遗精、早泄、尿频、遗尿、白浊，如《修事指南》指出：“益智仁盐炒，止小便频数”。
经过日本和我国学者的努力，近几十年来，中药益智仁的研究取得了较大的进展。化学成分研究方面，初步表明益智仁含有挥发油、萜类、黄酮类、庚烷类衍生物、多糖类、蛋白类、微量元素等化学成分。现代药理学研究表明，益智仁具有强心、抗癌、抗过敏、抗衰老、镇静、镇痛等多方面药理作用[1]。
《中国药典》2005年版一部益智药材项下，含量测定部分仅仅收载了挥发油含量测定。由于挥发油较不稳定，易氧化分解，随着贮存时间及方式的不同变化较大，难于单独使用挥发油控制药材质量。目前在益智药材中已分离和鉴定出杨芽黄酮、白杨素和良姜素等黄酮类化合物，应用总黄酮含量控制益智药材质量的文献亦见报道。刘红等[2]采用聚酰胺柱分离提取益智总黄酮并进行测定，吴德玲等考察不同产地益智仁中总黄酮的含量[3]，并对益智仁和 益智壳中总黄酮的含量进行了比较研究[4]。但关于益智仁盐炙前后的总黄酮含量的变化尚未见报道。因此，本文考察不同来源益智药材的饮片——益智仁及盐益智仁中总黄酮的含量，为益智饮片的质量标准研究提供依据，为进一步阐明益智仁盐炙前后化学成分变化提供科学依据。
1
本课题得到国家科技部十一五支撑计划（中药盐炙共性技术与相关设备研究，批准号：2006BAI09B06-09）
的资助。
2．实验材料
2.1 药材来源及鉴定依据
益智为姜科多年生草本植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实。本课题购买了13批不同来源的益智药材，分别购于海南寿南山参业有限公司、海南新兴购药商场、海南省医药公司新药特药经营部、海南博爱大药房、海口市药材公司中山药店、海口惠通药行、琼海、三亚、万宁、海南GAP 基地、广西（注：三批，购于五块石药材市场）等地。
经过成都中医药大学中药炮制教研室胡昌江教授鉴定，以上13批药材均符合《中国药典》2005年版一部204页益智药材项下规定。
2.2 仪器与试药
普析TU-1901紫外分光光度计；sartorius BP211D电子天平（感量0.1mg/0.01mg，载量210g/80g）；水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；autoscience AS5150A超声波清洗器。
芦丁对照品（100080-200306），购于中国药品生物制品检定所。其余试剂均为分析纯。
3．方法与结果
3.1 益智仁饮片及盐益智仁饮片的加工方法
3.1.1 益智仁饮片的加工方法
分别取上述13批益智药材适量，拣去杂质，筛净灰屑，用铁碾槽捣碎碾破皮壳取仁，再风选簸去壳衣灰屑。将所得益智仁粉碎成粗粉，过2号筛，备用。 3.1.2 盐益智仁饮片的加工方法
参考《中国药典》2005年版一部，经试验研究，确定盐益智仁炮制工艺参数：即按每100g 益智仁，用2g 食盐和40ml 水闷润1.5小时，置设定温度为200℃的电炒热锅内，炒炙8分钟至盐益智仁表面呈褐色或棕褐色，取出晾干收藏。将所得上述13批药材的盐益智仁粉碎成粗粉，过2号筛，备用。
3.2 总黄酮含量测定研究
3.2.1 对照品溶液的制备
精密称取在120℃ 减压干燥至恒重的芦丁对照品20.74mg ，置100ml 量瓶中，加75%乙醇稀释置刻度，摇匀，即得对照品液（每1ml 含芦丁0.2074mg ）。 3.2.2 测定波长的选择
将芦丁对照品、益智仁和盐益智仁样品配成75%的乙醇溶液，在400～600nm 间扫描，芦丁对照品、益智仁样品和盐益智仁样品均在510nm 处有最大吸收，故确定以510nm 为测定波长。紫外扫描图见图1、图2和图3。
图1 芦丁对照品紫外扫描图
图2 益智仁样品紫外扫描图
图3 盐益智仁样品紫外扫描图
3.2.3 线性关系的考察
精密量取芦丁对照品溶液（每1ml 含芦丁0.2074mg ）0ml 、1.0ml 、2.0ml 、3.0ml 、4.0ml 、5.0ml 与6.0ml ，分别置25ml 量瓶中，各加水至6ml ，加5％亚硝酸钠溶液1ml ，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml ，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml ，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照紫外－可见分光光度法（附录Ⅴ A），在510nm 的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1和图4。
表1 标准曲线测定数据
对照品浓度(mg/ml) 吸收度（A ）
0.008296 0.111
0.016592 0.208
0.024888 0.305
0.033184 0.406
0.04148 0.507
0.049776 0.610
计算得回归方程A=12.03 C＋0.0085；R=0.9999，浓度在0.2074～1.2444 mg/ml范围内，
与吸收度呈良好线性关系。
图5 芦丁标准曲线图
3.2.4 供试品溶液的制备 3.2.4.1 提取溶剂考察
黄酮类成分可溶于甲醇、乙醇，故采用甲醇、95%乙醇、50%乙醇、75%甲醇、50%甲醇作为提取溶剂进行考察。分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，置50ml 圆底烧瓶中，加25ml 石油醚（60～90℃），水浴回流1.5小时，弃去石油醚液，再精密量取各溶剂各25ml 加入圆底烧瓶中，称重，水浴回流1.5小时，用相应溶剂补足减失重量，滤过，取滤液1.5ml 置25ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法在510nm 处测定其吸收度。结果见表2。
表2 不同提取溶剂的提取结果
益智仁
提取溶剂
吸光度 （A ）
甲 醇 95%乙醇 50%乙醇 75%甲醇 50%甲醇
盐益智仁 吸光度 （A ）
总黄酮含量（%）
总黄酮含量（%）
0.222 0.74 0.186 0.55 0.523 1.80 0.405 1.37 0.489 1.62
0.156 0.51 0.158 0.46 0.407 1.39 0.375 1.27 0.403 1.33
由上可见，50%乙醇对益智仁和盐益智仁中总黄酮类成分提取更完全，故本实验选择50%乙醇作为样品提取溶剂。 3.2.4.2 提取方法和时间考察
分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，置50ml 圆底烧瓶中，加25ml 石油醚（60～90℃），水浴回流1.5h ，弃去石油醚液，再精密量取50%乙醇25ml 加入圆底烧瓶中，称重，采用不同提取方法和时间提取，用相应溶剂补足减失重量，滤过，取滤液1.5ml 置25ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法在510nm 处测定其吸收度。结果见表3。
表3 不同提取方法和时间考察结果
益智仁
提 取 方 法
吸光度 （A ）
超声0.5小时 超声0.75小时 超声1小时
超声两次，每次0.5小时 超声1.5小时 回流1小时 回流1.5小时
回流两次，第一次1小时，第二次0.5小时 回流2小时 回流2.5小时
总黄酮含量（%）
盐益智仁 吸光度 （A ）
总黄酮含量（%）
0.298 1.00 0.205 0.68 0.333 1.12 0.277 0.92 0.369 1.25 0.301 1.01 0.382 1.29 0.302 1.02 0.371 1.26 0.301 1.01 0.421 1.43 0.361 1.22 0.525 1.78 0.395 1.33 0.532 1.81 0.394 1.34 0.522 1.76 0.390 1.31 0.514 1.59 0.384 1.18
由上可见，超声与回流方法提取益智仁和盐益智仁中的总黄酮均有随着时间的增加而增高的趋势，但超声时间达到1小时后总黄酮含量增加不明显，而超声两次，每次0.5小时所得的含量又较一次提取的稍高，可能是因为增大了溶剂与药材之间的浓度差；回流时间超过1.5小时后，总黄酮含量反而有所下降，回流两次，第一次1小时，第二次0.5小时与回流1.5小时的样品相比，没有显著差异。总的来说，回流方法所得的总黄酮含量较超声提取的高，故本实验选择回流提取方法，提取时间的选择考虑到节约溶剂和时间，确定为1.5小时。
综上所述，供试品溶液的制备方法为：分别取益智仁和盐益智仁饮片各1g ，精密称定，置50ml 圆底烧瓶中，加25ml 石油醚（60～90℃），水浴回流1.5h ，弃去石油醚液，再精密量取50%乙醇25ml 加入圆底烧瓶中，称重，水浴回流1.5h ，用50%乙醇补足减失重量，滤过，即得。 3.2.5 精密度试验
分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备并进行测定，重复测量五次，吸收度（A ）的相对标准偏差为0.98%。结果见表4。
表4 精密度考察结果
测定次数
益智仁
吸光度（A ）
RSD （%）
盐益智仁
吸光度（A ）
RSD （%）
1 0.523 2 0.533 0.98 3 0.522 4 0.527 5 0.520
3.2.6 稳定性考察
3.2.6.1 对照品溶液的稳定性考察
0.399 0.393 1.54 0.401 0.407 0.392
取芦丁对照品溶液（每1ml 含芦丁0.2074mg ）4ml ，按标准曲线制备方法进行制备，于制样后15、20、25、30、40、60分钟测定，结果见表5。
表5 芦丁对照品溶液的稳定性考察
测定时间 （min ）吸收度（A ）
10 20 30 40 50 60 RSD （%）0.404 0.403 0.406 0.408 0.410 0.408 0.66
实验所得RSD 为0.66%，说明芦丁对照品溶液在制样后60分钟内测定稳定。 3.2.6.2 供试品溶液的稳定性考察
分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备，于制样后不同时间进样测定，结果见表6。
表6 益智仁和盐益智仁供试品溶液的稳定性考察
测定时间 （min ） 益智仁样品吸收度（A ） 盐益智仁样品吸收度（A ）
15 30 45 RSD （%） 0.527 0.524 0.507 2.08 0.404 0.400 0.391 1.67
在45分钟内，益智仁样品吸收度的RSD 为2.08%，盐益智仁样品吸收度的RSD 为1.67%，说明两供试品溶液在制样后45分钟内基本稳定。 3.2.7 重复性试验
按拟定的含量测定方法，分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定五份，进行含量测定，结果见表7。
表7 重复性试验
序 号
益智仁
吸光度（A ）
总黄酮含量
(%)
平均值(%)
RSD （%）
吸光度（A ）
盐益智仁 总黄酮含量
(%)
平均值(%)
RSD （%）
1 0.526 1.79 0.401 1.36 2 0.531 1.81 0.402 1.36 3 0.529 1.80 1.79 0.90 0.398 1.32 1.35 1.58 4 0.521 1.78 0.399 1.34 5 0.524 1.79 0.406 1.38
3.2.8 回收率试验
分别精密称取已知含量的益智仁广西产第三批饮片（含量1.79%）和盐益智仁广西产第三批饮片（含量1.35%）各0.5g ，共六份，分别精密加入芦丁对照品（每1ml 含芦丁2.074mg ）4ml ，按前文总黄酮含量测定方法进行含量测定，计算回收率，结果表明回收率的重现性好。结果见表8。
实测总黄酮含量－样品中总黄酮含量
回收率（％）= ×100％ 对照品加入量
表8 回收率测定结果
样品 N O
吸收度
样品中总黄酮含量(mg) 8.949 8.964 8.936 8.973 8.981 8.956 6.749 6.761 6.739 6.768 6.774 6.755
对照品加入量(mg) 8.296 8.296 8.296 8.296 8.296 8.296 6.222 6.222 6.222 6.222 6.222 6.222
实测总黄酮含
量(mg) 17.1966
回收率(%)
平均回收率(%) RSD (%)
1 0.505 益智仁
2 0.508 3 0.499 4 0.506 5 0.514 6 0.511 1 0.39 盐益智仁
2 0.388 3 0.385 4 0.386 5 0.383 6 0.391
3.2.9样品测定
99.42
17.3005 100.48 16.9888 97.07 17.2312
99.54
17.5083 102.78 17.4044 101.83 13.213 13.144 13.040 13.075 12.971 13.248
103.89 102.59 101.27 101.37 99.60 104.36
99.86 2.07
101.75 1.58
按前述方法测定不同来源的益智仁和盐益智仁各13批，结果见表9。
表9 不同来源的益智仁和盐益智仁含量测定结果
样品编号
海南寿南山参业有限公司 海南新兴购药商场
海南省医药公司新药特药经营部 海南博爱大药房 海口市药材公司中山药店 海口惠通药行
琼海（购于海南省药材公司） 三亚（购于海南省药材公司） 万宁（购于海南省药材公司） 海南GAP 基地
广西第一批（购于五块石药材市场） 广西第二批（购于五块石药材市场） 广西第三批（购于五块石药材市场）
益智仁 盐益智仁
总黄酮含量（％）总黄酮含量（％）
1.09 1.18 0.77 0.86 0.46 0.45 1.13 0.67 0.45 0.47 0.68 0.45 0.35 0.32 0.78 0.48 0.49 0.51 1.66 1.56 1.92 1.60 1.42 1.12 1.77 1.68
4．结论
建立的益智仁和盐益智仁总黄酮含量测定方法简便、可行，可为益智仁饮片和盐益智仁饮片的质量控制提供参考。13批益智仁饮片中总黄酮含量在0.35%～1.92%之间，盐益智仁饮片中总黄酮含量在0.32%～1.68%之间，中药益智仁盐炙后总黄酮含量普遍有一定的降低。不同来源的益智仁之间所含总黄酮含量差异较大，可能与药材的生长环境、采收季节和贮藏条件都有一定的关系。由于部分药材直接购买于药房，未能明确药材具体的产地和采收时间等信息，加之部分药材样品总量较小，故对益智仁饮片和盐益智仁饮片暂时未制定含量限度，有待进一步研究。
参考文献
[1]冯淑香，刘耀明，董俊兴. 中药益智仁化学成分与药理研究进展[J].现代中药研究与实践，2003，17（5）：58-61.
[2]刘红，郭祀远. 食品工业科技[J].2005，26（3）：122-123.
[3]吴德玲，金传山，刘金旗，等. 益智仁中总黄酮含量测定[J].安徽中医学院学报，2005，24（6）：38-40. [4]吴德玲，金传山，寇婉青，等. 益智不同药用部位成分的比较研究[J].中国实验方剂学杂志，2007，13（4）：1-3.
Study on the Difference between the Total Flavonoids Contents of Fructus Alpinia Oxyphylla before and after
Stir-fried with Salt
Huang Qinwan，Yang Jing，Liu Wei，Li Xingying，Hu Changjiang，Xie Xiuqiong
Chengdu University of TCM Sichuan，Chengdu （611137）
Abstract
Objects: Under the item of Fructus Alpiniae Oxyphylla in 2005 edition of pharmacopoeia of the People’s Republic of China, the assay item is only record the assay of volatile oil. The study investigates the assay of total flavonoids in Fructus Alpiniae Oxyphylla and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla from difference source and is aimed to provide some evidences for the research of quality standard of Fructus Alpiniae Oxyphylla and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla. Methods: 13 batch of Fructus Alpiniae Oxyphylla from difference source was taked to process them. Rutoside is taked to be the reference substance, and AlCl3-NaNO 2-NaOH colouration and UV-spectrophotometry was used to determin the content of total flavonoids. Results: The contents of total flavonoids of 13 batch Fructus Alpiniae Oxyphylla from difference source was ranged from 0.35%～1.92%，and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla was ranged from 0.32%～1.68%. Conclusion: This study establishs an assay method of total flavonoids in Fructus Alpiniae Oxyphylla and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla which is convenient and feasible, and the method can be used to control the quality of them. The content of total flavonoids in Fructus Alpinia Oxyphylla are degrade after stir-fried.
Keywords ：Fructus Alpinia Oxyphylla，stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla，the content of total flavonoids
作者简介：
黄勤挽，男，1979年10月生，四川成都人，现为成都中医药大学博士研究生，主要从事中药炮制与中药新制剂；
胡昌江，成都中医药大学教授，博士生导师，为国家十一五支撑计划——中药盐炙共性技术与相关设备研究（批准号：2006BAI09B06-09）的负责人；
谢秀琼，成都中医药大学教授，博士生导师，为国家十一五支撑计划——中药盐炙共性技术与相关设备研究（益智仁）的负责人。
中药益智仁盐炙前后总黄酮含量的对比研究1
黄勤挽，杨婧，刘苇，李兴迎，胡昌江，谢秀琼
成都中医药大学，成都（611137）
E-mail ：[email protected]
摘 要：目的：《中国药典》2005年版一部益智药材项下，含量测定部分仅仅收载了挥发油含量测定。本文考察不同来源益智药材的饮片——益智仁及盐益智仁中总黄酮的含量，为益智饮片的质量标准研究提供依据。方法：取不同来源的13批益智药材，制备成益智仁和盐益智仁饮片。以无水芦丁为对照，用AlCl 3-NaNO 2-NaOH 显色，利用紫外－可见分光光度法测定益智仁和盐益智仁中总黄酮的含量。结果：13批益智仁饮片中总黄酮含量在0.35%～1.92%之间，盐益智仁饮片中总黄酮含量在0.32%～1.68%之间。结论：建立的益智仁和盐益智仁总黄酮含量测定方法简便、可行，可为益智仁饮片和盐益智仁饮片的质量控制提供参考。中药益智仁盐炙后总黄酮含量有一定的降低。 关键词：益智仁，盐益智仁，总黄酮含量
1．引言
益智为姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实，药用部位通常为种仁。临床上益智仁常生用或盐炙用，益智仁盐炙应用的历史悠久，炮制方法始见于宋代《洪氏集验方》“取仁盐炒用”。生益智仁辛温而燥，主要归脾经，以温脾止泻、收摄涎唾力胜，多用于腹痛吐泻、口涎自流；盐炙可缓和辛燥之性，主要归肾经，专行下焦，长于固精、缩尿，用于肾气虚寒的遗精、早泄、尿频、遗尿、白浊，如《修事指南》指出：“益智仁盐炒，止小便频数”。
经过日本和我国学者的努力，近几十年来，中药益智仁的研究取得了较大的进展。化学成分研究方面，初步表明益智仁含有挥发油、萜类、黄酮类、庚烷类衍生物、多糖类、蛋白类、微量元素等化学成分。现代药理学研究表明，益智仁具有强心、抗癌、抗过敏、抗衰老、镇静、镇痛等多方面药理作用[1]。
《中国药典》2005年版一部益智药材项下，含量测定部分仅仅收载了挥发油含量测定。由于挥发油较不稳定，易氧化分解，随着贮存时间及方式的不同变化较大，难于单独使用挥发油控制药材质量。目前在益智药材中已分离和鉴定出杨芽黄酮、白杨素和良姜素等黄酮类化合物，应用总黄酮含量控制益智药材质量的文献亦见报道。刘红等[2]采用聚酰胺柱分离提取益智总黄酮并进行测定，吴德玲等考察不同产地益智仁中总黄酮的含量[3]，并对益智仁和 益智壳中总黄酮的含量进行了比较研究[4]。但关于益智仁盐炙前后的总黄酮含量的变化尚未见报道。因此，本文考察不同来源益智药材的饮片——益智仁及盐益智仁中总黄酮的含量，为益智饮片的质量标准研究提供依据，为进一步阐明益智仁盐炙前后化学成分变化提供科学依据。
1
本课题得到国家科技部十一五支撑计划（中药盐炙共性技术与相关设备研究，批准号：2006BAI09B06-09）
的资助。
2．实验材料
2.1 药材来源及鉴定依据
益智为姜科多年生草本植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实。本课题购买了13批不同来源的益智药材，分别购于海南寿南山参业有限公司、海南新兴购药商场、海南省医药公司新药特药经营部、海南博爱大药房、海口市药材公司中山药店、海口惠通药行、琼海、三亚、万宁、海南GAP 基地、广西（注：三批，购于五块石药材市场）等地。
经过成都中医药大学中药炮制教研室胡昌江教授鉴定，以上13批药材均符合《中国药典》2005年版一部204页益智药材项下规定。
2.2 仪器与试药
普析TU-1901紫外分光光度计；sartorius BP211D电子天平（感量0.1mg/0.01mg，载量210g/80g）；水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；autoscience AS5150A超声波清洗器。
芦丁对照品（100080-200306），购于中国药品生物制品检定所。其余试剂均为分析纯。
3．方法与结果
3.1 益智仁饮片及盐益智仁饮片的加工方法
3.1.1 益智仁饮片的加工方法
分别取上述13批益智药材适量，拣去杂质，筛净灰屑，用铁碾槽捣碎碾破皮壳取仁，再风选簸去壳衣灰屑。将所得益智仁粉碎成粗粉，过2号筛，备用。 3.1.2 盐益智仁饮片的加工方法
参考《中国药典》2005年版一部，经试验研究，确定盐益智仁炮制工艺参数：即按每100g 益智仁，用2g 食盐和40ml 水闷润1.5小时，置设定温度为200℃的电炒热锅内，炒炙8分钟至盐益智仁表面呈褐色或棕褐色，取出晾干收藏。将所得上述13批药材的盐益智仁粉碎成粗粉，过2号筛，备用。
3.2 总黄酮含量测定研究
3.2.1 对照品溶液的制备
精密称取在120℃ 减压干燥至恒重的芦丁对照品20.74mg ，置100ml 量瓶中，加75%乙醇稀释置刻度，摇匀，即得对照品液（每1ml 含芦丁0.2074mg ）。 3.2.2 测定波长的选择
将芦丁对照品、益智仁和盐益智仁样品配成75%的乙醇溶液，在400～600nm 间扫描，芦丁对照品、益智仁样品和盐益智仁样品均在510nm 处有最大吸收，故确定以510nm 为测定波长。紫外扫描图见图1、图2和图3。
图1 芦丁对照品紫外扫描图
图2 益智仁样品紫外扫描图
图3 盐益智仁样品紫外扫描图
3.2.3 线性关系的考察
精密量取芦丁对照品溶液（每1ml 含芦丁0.2074mg ）0ml 、1.0ml 、2.0ml 、3.0ml 、4.0ml 、5.0ml 与6.0ml ，分别置25ml 量瓶中，各加水至6ml ，加5％亚硝酸钠溶液1ml ，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml ，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml ，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照紫外－可见分光光度法（附录Ⅴ A），在510nm 的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1和图4。
表1 标准曲线测定数据
对照品浓度(mg/ml) 吸收度（A ）
0.008296 0.111
0.016592 0.208
0.024888 0.305
0.033184 0.406
0.04148 0.507
0.049776 0.610
计算得回归方程A=12.03 C＋0.0085；R=0.9999，浓度在0.2074～1.2444 mg/ml范围内，
与吸收度呈良好线性关系。
图5 芦丁标准曲线图
3.2.4 供试品溶液的制备 3.2.4.1 提取溶剂考察
黄酮类成分可溶于甲醇、乙醇，故采用甲醇、95%乙醇、50%乙醇、75%甲醇、50%甲醇作为提取溶剂进行考察。分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，置50ml 圆底烧瓶中，加25ml 石油醚（60～90℃），水浴回流1.5小时，弃去石油醚液，再精密量取各溶剂各25ml 加入圆底烧瓶中，称重，水浴回流1.5小时，用相应溶剂补足减失重量，滤过，取滤液1.5ml 置25ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法在510nm 处测定其吸收度。结果见表2。
表2 不同提取溶剂的提取结果
益智仁
提取溶剂
吸光度 （A ）
甲 醇 95%乙醇 50%乙醇 75%甲醇 50%甲醇
盐益智仁 吸光度 （A ）
总黄酮含量（%）
总黄酮含量（%）
0.222 0.74 0.186 0.55 0.523 1.80 0.405 1.37 0.489 1.62
0.156 0.51 0.158 0.46 0.407 1.39 0.375 1.27 0.403 1.33
由上可见，50%乙醇对益智仁和盐益智仁中总黄酮类成分提取更完全，故本实验选择50%乙醇作为样品提取溶剂。 3.2.4.2 提取方法和时间考察
分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，置50ml 圆底烧瓶中，加25ml 石油醚（60～90℃），水浴回流1.5h ，弃去石油醚液，再精密量取50%乙醇25ml 加入圆底烧瓶中，称重，采用不同提取方法和时间提取，用相应溶剂补足减失重量，滤过，取滤液1.5ml 置25ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法在510nm 处测定其吸收度。结果见表3。
表3 不同提取方法和时间考察结果
益智仁
提 取 方 法
吸光度 （A ）
超声0.5小时 超声0.75小时 超声1小时
超声两次，每次0.5小时 超声1.5小时 回流1小时 回流1.5小时
回流两次，第一次1小时，第二次0.5小时 回流2小时 回流2.5小时
总黄酮含量（%）
盐益智仁 吸光度 （A ）
总黄酮含量（%）
0.298 1.00 0.205 0.68 0.333 1.12 0.277 0.92 0.369 1.25 0.301 1.01 0.382 1.29 0.302 1.02 0.371 1.26 0.301 1.01 0.421 1.43 0.361 1.22 0.525 1.78 0.395 1.33 0.532 1.81 0.394 1.34 0.522 1.76 0.390 1.31 0.514 1.59 0.384 1.18
由上可见，超声与回流方法提取益智仁和盐益智仁中的总黄酮均有随着时间的增加而增高的趋势，但超声时间达到1小时后总黄酮含量增加不明显，而超声两次，每次0.5小时所得的含量又较一次提取的稍高，可能是因为增大了溶剂与药材之间的浓度差；回流时间超过1.5小时后，总黄酮含量反而有所下降，回流两次，第一次1小时，第二次0.5小时与回流1.5小时的样品相比，没有显著差异。总的来说，回流方法所得的总黄酮含量较超声提取的高，故本实验选择回流提取方法，提取时间的选择考虑到节约溶剂和时间，确定为1.5小时。
综上所述，供试品溶液的制备方法为：分别取益智仁和盐益智仁饮片各1g ，精密称定，置50ml 圆底烧瓶中，加25ml 石油醚（60～90℃），水浴回流1.5h ，弃去石油醚液，再精密量取50%乙醇25ml 加入圆底烧瓶中，称重，水浴回流1.5h ，用50%乙醇补足减失重量，滤过，即得。 3.2.5 精密度试验
分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备并进行测定，重复测量五次，吸收度（A ）的相对标准偏差为0.98%。结果见表4。
表4 精密度考察结果
测定次数
益智仁
吸光度（A ）
RSD （%）
盐益智仁
吸光度（A ）
RSD （%）
1 0.523 2 0.533 0.98 3 0.522 4 0.527 5 0.520
3.2.6 稳定性考察
3.2.6.1 对照品溶液的稳定性考察
0.399 0.393 1.54 0.401 0.407 0.392
取芦丁对照品溶液（每1ml 含芦丁0.2074mg ）4ml ，按标准曲线制备方法进行制备，于制样后15、20、25、30、40、60分钟测定，结果见表5。
表5 芦丁对照品溶液的稳定性考察
测定时间 （min ）吸收度（A ）
10 20 30 40 50 60 RSD （%）0.404 0.403 0.406 0.408 0.410 0.408 0.66
实验所得RSD 为0.66%，说明芦丁对照品溶液在制样后60分钟内测定稳定。 3.2.6.2 供试品溶液的稳定性考察
分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备，于制样后不同时间进样测定，结果见表6。
表6 益智仁和盐益智仁供试品溶液的稳定性考察
测定时间 （min ） 益智仁样品吸收度（A ） 盐益智仁样品吸收度（A ）
15 30 45 RSD （%） 0.527 0.524 0.507 2.08 0.404 0.400 0.391 1.67
在45分钟内，益智仁样品吸收度的RSD 为2.08%，盐益智仁样品吸收度的RSD 为1.67%，说明两供试品溶液在制样后45分钟内基本稳定。 3.2.7 重复性试验
按拟定的含量测定方法，分别取益智仁和盐益智仁饮片（均为广西产第三批）各1g ，精密称定五份，进行含量测定，结果见表7。
表7 重复性试验
序 号
益智仁
吸光度（A ）
总黄酮含量
(%)
平均值(%)
RSD （%）
吸光度（A ）
盐益智仁 总黄酮含量
(%)
平均值(%)
RSD （%）
1 0.526 1.79 0.401 1.36 2 0.531 1.81 0.402 1.36 3 0.529 1.80 1.79 0.90 0.398 1.32 1.35 1.58 4 0.521 1.78 0.399 1.34 5 0.524 1.79 0.406 1.38
3.2.8 回收率试验
分别精密称取已知含量的益智仁广西产第三批饮片（含量1.79%）和盐益智仁广西产第三批饮片（含量1.35%）各0.5g ，共六份，分别精密加入芦丁对照品（每1ml 含芦丁2.074mg ）4ml ，按前文总黄酮含量测定方法进行含量测定，计算回收率，结果表明回收率的重现性好。结果见表8。
实测总黄酮含量－样品中总黄酮含量
回收率（％）= ×100％ 对照品加入量
表8 回收率测定结果
样品 N O
吸收度
样品中总黄酮含量(mg) 8.949 8.964 8.936 8.973 8.981 8.956 6.749 6.761 6.739 6.768 6.774 6.755
对照品加入量(mg) 8.296 8.296 8.296 8.296 8.296 8.296 6.222 6.222 6.222 6.222 6.222 6.222
实测总黄酮含
量(mg) 17.1966
回收率(%)
平均回收率(%) RSD (%)
1 0.505 益智仁
2 0.508 3 0.499 4 0.506 5 0.514 6 0.511 1 0.39 盐益智仁
2 0.388 3 0.385 4 0.386 5 0.383 6 0.391
3.2.9样品测定
99.42
17.3005 100.48 16.9888 97.07 17.2312
99.54
17.5083 102.78 17.4044 101.83 13.213 13.144 13.040 13.075 12.971 13.248
103.89 102.59 101.27 101.37 99.60 104.36
99.86 2.07
101.75 1.58
按前述方法测定不同来源的益智仁和盐益智仁各13批，结果见表9。
表9 不同来源的益智仁和盐益智仁含量测定结果
样品编号
海南寿南山参业有限公司 海南新兴购药商场
海南省医药公司新药特药经营部 海南博爱大药房 海口市药材公司中山药店 海口惠通药行
琼海（购于海南省药材公司） 三亚（购于海南省药材公司） 万宁（购于海南省药材公司） 海南GAP 基地
广西第一批（购于五块石药材市场） 广西第二批（购于五块石药材市场） 广西第三批（购于五块石药材市场）
益智仁 盐益智仁
总黄酮含量（％）总黄酮含量（％）
1.09 1.18 0.77 0.86 0.46 0.45 1.13 0.67 0.45 0.47 0.68 0.45 0.35 0.32 0.78 0.48 0.49 0.51 1.66 1.56 1.92 1.60 1.42 1.12 1.77 1.68
4．结论
建立的益智仁和盐益智仁总黄酮含量测定方法简便、可行，可为益智仁饮片和盐益智仁饮片的质量控制提供参考。13批益智仁饮片中总黄酮含量在0.35%～1.92%之间，盐益智仁饮片中总黄酮含量在0.32%～1.68%之间，中药益智仁盐炙后总黄酮含量普遍有一定的降低。不同来源的益智仁之间所含总黄酮含量差异较大，可能与药材的生长环境、采收季节和贮藏条件都有一定的关系。由于部分药材直接购买于药房，未能明确药材具体的产地和采收时间等信息，加之部分药材样品总量较小，故对益智仁饮片和盐益智仁饮片暂时未制定含量限度，有待进一步研究。
参考文献
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[3]吴德玲，金传山，刘金旗，等. 益智仁中总黄酮含量测定[J].安徽中医学院学报，2005，24（6）：38-40. [4]吴德玲，金传山，寇婉青，等. 益智不同药用部位成分的比较研究[J].中国实验方剂学杂志，2007，13（4）：1-3.
Study on the Difference between the Total Flavonoids Contents of Fructus Alpinia Oxyphylla before and after
Stir-fried with Salt
Huang Qinwan，Yang Jing，Liu Wei，Li Xingying，Hu Changjiang，Xie Xiuqiong
Chengdu University of TCM Sichuan，Chengdu （611137）
Abstract
Objects: Under the item of Fructus Alpiniae Oxyphylla in 2005 edition of pharmacopoeia of the People’s Republic of China, the assay item is only record the assay of volatile oil. The study investigates the assay of total flavonoids in Fructus Alpiniae Oxyphylla and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla from difference source and is aimed to provide some evidences for the research of quality standard of Fructus Alpiniae Oxyphylla and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla. Methods: 13 batch of Fructus Alpiniae Oxyphylla from difference source was taked to process them. Rutoside is taked to be the reference substance, and AlCl3-NaNO 2-NaOH colouration and UV-spectrophotometry was used to determin the content of total flavonoids. Results: The contents of total flavonoids of 13 batch Fructus Alpiniae Oxyphylla from difference source was ranged from 0.35%～1.92%，and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla was ranged from 0.32%～1.68%. Conclusion: This study establishs an assay method of total flavonoids in Fructus Alpiniae Oxyphylla and stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla which is convenient and feasible, and the method can be used to control the quality of them. The content of total flavonoids in Fructus Alpinia Oxyphylla are degrade after stir-fried.
Keywords ：Fructus Alpinia Oxyphylla，stir-fried Fructus Alpinia Oxyphylla，the content of total flavonoids
作者简介：
黄勤挽，男，1979年10月生，四川成都人，现为成都中医药大学博士研究生，主要从事中药炮制与中药新制剂；
胡昌江，成都中医药大学教授，博士生导师，为国家十一五支撑计划——中药盐炙共性技术与相关设备研究（批准号：2006BAI09B06-09）的负责人；
谢秀琼，成都中医药大学教授，博士生导师，为国家十一五支撑计划——中药盐炙共性技术与相关设备研究（益智仁）的负责人。