翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略

ISS N 　100727626C

N 　1123870ΠQ

中国生物化学与分子生物学报

2007年2月23(2) :93～100

・综述・

翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略

刘金凤, 　王京兰, 　钱小红, 　蔡　耘

(北京蛋白质组研究中心, 军事医学科学院放射医学研究所, 北京　100850)

摘要　蛋白质组学早期研究的绝大部分工作是在关注细胞不同生长时期或是疾病、分裂素刺激下

的蛋白质表达水平变化. 然而, 许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相对丰度控制, 更重要的是被那些时空特异分布的可逆翻译后修饰控制的, 揭示翻译后修饰发生规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提. 由于翻译后修饰蛋白质在样本中含量低且动态范围广, 其相关研究极具挑战性, 亲和富集、契机, 目前, , . , 饰, 泛素化修饰, 、甲基化、脂基化修饰等进行了综述关键词; ; ; Strategies of Modification 2specific Proteomics Study

LI U Jin 2Feng , W ANGJing 2Lan , QI AN X iao 2H ong , C AI Y un

(Beijing Proteomics o f Research Center , Beijing Institute o f Radiation Medicine , Beijing 　100850, China )

Abstract 　M ost w ork of early proteomics was focused on the protein expression profile of cells on the different growth period or cells perturbed by mitogens or diseases. H owever , many vital processes are controlled not only by the relative abundance of proteins but als o by reversible post 2translational m odifications with specific spatial and tem poral distributions. C onsequently ,it is im portant for com prehending com plex biological functions of proteins to reveal the post 2translational m odification occurrence. Because of the low stoichiometry and broad dynamic range , research on the post 2translationally m odified proteins is still a big technical challenge. Nevertheless ,development and integration of different methods , such as affinity 2based enrichment methods , multi 2dimensional separation technologies and mass spectrometry give the promise to probe the post 2translational proteomics in a large scale. Currently , there are several major kinds of large 2scale post 2translational m odification study , of which phosphorylation and glycosylation are researched m ore frequently. This article reviews the strategies and techniques used in high 2throughput investigation of post 2translationally m odified proteins in recent years. K ey w ords 　post 2translational m odification ;proteomics ;enrichment ;separation ; mass spectrometry

　　蛋白质的翻译后修饰是指对基因的功能执行者———蛋白质进行共价加工的过程, 它通过在一个或几个氨基酸残基加上修饰基团或通过蛋白质水解剪切改变蛋白质的性质. 蛋白质的翻译后修饰不仅仅是一个“装饰”, 它调节着蛋白质的活性状态、定位、

[1]

折叠以及蛋白质2蛋白质之间的交互作用等.

尽管蛋白质的翻译后修饰对生物功能的发挥有着至关重要的作用, 但对它的规模化研究受到分析方法的限制, 这很大程度上是由于翻译后修饰蛋白

质的化学计量值低、复杂性大造成的. 基因转录产物mRNA 的可变剪接以及翻译中和翻译后修饰导致了

基因产物的多样性, 据预测, 人类基因组包含大约

收稿日期:2006208216, 接受日期:2006210219

联系人　T el :(010) [1**********]29;Fax :(010) 80705155;

E 2mail :caiyun @nic.bmi. ac. cn

Received :August 16,2006;Accepted :October 19,2006

C orresponding author T el :(010) [1**********]29;Fax :(010) 80705155;

E 2mail :caiyun@nic.bmi. ac. cn

94中国生物化学与分子生物学报23卷

30000个开放阅读框, 平均每1个可阅读框可产生5

～6个不同的mRNA , 每1个mRNA 翻译生成的蛋白质以不同的方式进行加工, 每个多肽链大约可产生

[2]

8～10种不同的修饰. 目前, 记录在册的翻译后修

[3]

饰超过400种(http :ΠΠabrf. org Πindex. cfm Πdm. home ) , 仍有新的翻译后修饰被发现. 同时, 翻译后修饰还存在时空特异性, 蛋白质的修饰类型及修饰程度随生物生存环境及内在状态的变化会表现出极大的差别, 有的修饰甚至是转瞬即逝的, 所以, 蛋白质翻译后修饰的程度以及其生物学功能的挖掘还存在着极大的空间.

面对纷繁复杂的翻译后修饰, 应运产生了m odification 2specific proteomics :详细、系统地研究蛋白

[4]

质翻译后修饰的蛋白质组策略. 基于翻译后修饰蛋白质的不均一性及相对丰度低的特性, 翻译后修体系包括电泳、色谱、具, , 量有一个差异, 从而鉴定蛋白质, 并通过串联质谱鉴定修饰位点. 其中存在的问题主要有两个:即翻译后修饰蛋白的富集分离问题和二级质谱的裂解效率问题. 目前广泛使用的肽段裂解技术包括碰撞诱导解离(CI D ) 和源后衰变(PS D ) 两种, 某些翻译后修饰(如糖基化、磷酸化) 在此条件下会优先断裂而使主链的裂解受到抑制, 降低修饰位点的鉴定成功率.

虽然翻译后修饰蛋白质组学技术条件还不完备, 但是, 随着蛋白质组表达谱研究技术的日益成熟和规模化, 翻译后修饰蛋白质组学研究技术已经取得了可喜的进展.

优化并应用于不同生物样本的磷酸化蛋白质组分析中. 1. 1　丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化整体研究策略11111　以色谱分离为基础的研究策略测定了HeLa 细胞的细胞核磷酸化蛋白质组. 细胞核蛋白质经制备型S DS 2PAGE 预分离后, 胰酶酶切, 在pH 217下进行SCX 分离, 再经反相色谱、LC Q 离子阱三级质谱鉴定, 得到了2000多个磷酸化位点. 用同样的技术路线研究胚胎鼠脑

Beaus oleil 等

[6]

的磷酸化蛋白质组, 鉴定了近500多个磷酸化肽段. 虽然没有采用任何富集方法, 此路线鉴定磷酸化肽段的能力却是惊人的; :含有超过2, 所; , [8]

. 和I M AC 结合的方法对酵, 同时采用细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记对磷酸化蛋白质进行定量,LT Q 2FTICR 三级质谱鉴定得到了大约700个磷酸化肽. C ollins 等采用4条技术路线对小鼠的突触体磷酸化蛋白质组进行研究, 其中一种路线采用两次固相金属亲和的方法. 作者认为, 双金属亲和的方法鉴定的磷酸肽具有互补性, 可以检测到不同丰度范围和不同磷酸化状态的磷酸化蛋白质. 文献[10]、[11]采用了I M AC 2LC 2MS ΠMS 的技术路线进行磷酸化位点的鉴定, 两者都对甲酯化反应进行优化, 肽段经甲酯化反应处理后再进行I M AC 亲和, 并且均增大了亲和柱的柱床体积. 在进行重复性实验时, 两者均发现不同批次之间的覆盖

率大约为60%.作者认为, 未重复鉴定的肽段是由于质谱的扫描模式(in formation 2dependent acquisition m ode ) 所限. 在磷酸化蛋白质Π肽段的富集方法中, I M AC 是最频繁应用的方法, 也是最行之有效的方法之一. 但是, 该方法仍有一定的缺陷:通过I M AC 亲和, 主要富集得到多电荷的磷酸化肽段, 而且酸性较强的非磷酸化肽段会共洗脱. 目前, 酯化法以及二氧化钛亲和法已被发展用于降低亲和富集方法对酸性肽段的非特异性吸附. 11112　以二维电泳分离为基础的研究策略

基于非液相色谱的磷酸化蛋白质组研究相对较少. Y amagata 等结合二维电泳和磷酸酶对小鼠表皮纤维原细胞的磷酸化蛋白质进行观测. 作者对电泳结果进行分析发现,1315个凝胶点中有63个点的位置向碱性端发生偏移. 选择20个丰度较高的点

[12]

[9]

[7]

1　磷酸化修饰

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内最重要的共价修饰方式之一. 在人类蛋白质组研究中, 据估计, 超过50%的蛋白质发生过磷酸化修饰, 估计有100000

[5]

个潜在的磷酸化位点. 目前, 磷酸化蛋白质组的研究主要集中在真核生物体内普遍存在的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化. 由于在生物体内磷酸化修饰蛋白质的含量非常低, 因此在分析前必须要采取一定的分离富集手段. 目前, 磷酸化蛋白质的常用分离富集技术包括:金属亲和磷酸化蛋白质Π磷酸化肽段(I M AC ) 、免疫沉淀、强阳离子交换色谱(SCX ) 、强阴离子交换色谱(S AX ) 、反相色谱等, 这些技术被整合

第2期刘金凤等:翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略95　

进行Q 2T OF 鉴定, 结果17个已有文献报道为磷酸化

[13]

蛋白质. Hayduk 等采用一种可专门针对磷酸化蛋白质进行染色的荧光染料Pro 2Q Diam ond 并结合双向电泳对中国仓鼠卵细胞的磷酸化蛋白质进行了观测, 在1877个总蛋白点中“看”到了672个磷酸化蛋白质点, 约占总蛋白质的36%.1. 2　基于免疫亲和的酪氨酸磷酸化蛋白质研究

在真核生物常见的三种磷酸化形式中, 丝氨酸磷酸化最多, 苏氨酸磷酸化其次, 酪氨酸磷酸化最少, 三者的比例约是1800∶200∶1. 由于酪氨酸磷酸化抗体的选择性、特异性最好, 因此, 酪氨酸磷酸化蛋白质组的研究主要是基于抗体的高度灵敏性及特

[14]

异性进行的. Salom on 等采用酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀, 结合甲酯化固相金属亲和色谱富集磷酸肽策略, 研究了T 细胞受体信号通路中的酪氨酸磷酸化蛋白质. 同时, STI571(G leevec ) 处理后Blag , 作者采用精氨酸的3种稳定同位素形式对HeLa 细胞进行代谢标记, 对不同标记的细胞分别刺激不同的时间, 再将细胞混合, 用免疫沉淀的方法提取酪氨酸磷酸化蛋白质, 酶解后的肽段进行LC ΠMS ΠMS 分析. 结果发现, 共有81个蛋白质的酪氨酸磷酸化出现表达差异. Rush 等通过酪氨酸磷酸化抗体免疫沉淀磷酸肽, 与传统认为的磷酸化蛋白质抗体不适合富集磷酸化肽相悖, 作者鉴定了多种瘤细胞中的总计688个酪氨酸磷酸化肽段, 其中628个肽段有位点信息, 这也是迄今鉴定细胞酪氨酸磷酸化最多的研究. 由于丝氨酸、苏氨酸磷酸化抗体的特异性受空间位阻影响, 其特异性远远不如酪氨酸磷酸化抗体, 基于免疫亲和的丝氨酸、苏氨酸磷酸化研究较少. 1. 3　磷酸化蛋白质分析中的质谱技术在规模化的磷酸化蛋白质鉴定中, ESI 2QT OF 2

[17]

MS 、线性离子阱质谱仪使用较多. DeG iorgis 等采用LC Q 质谱仪, 对磷酸化蛋白质肽段的二级质谱图进行了分析, 并对出现的问题加以解析:1) 大多数谱图包含强的中性丢失离子峰, 但也有未出现中性丢失离子峰的谱图. 这些谱图可能是非磷酸肽或酪氨酸磷酸肽对应的谱图. 2) 单电荷肽段离子未被鉴定到, 仅有2个四电荷肽段离子被鉴定到, 可能是由于单电荷肽段的二级谱图过于简单、四电荷肽段的二级谱图太复杂, 以至于SE QUEST 软件难以识别. 3)

[16]

在线性离子阱质谱中, 由于气相β2消除反应的竞争, 肽键不易断裂, 导致一些谱图中虽有强的中性丢失离子峰, 但没有足够的碎片离子峰进行磷酸化位点的指认. 为了进一步对这些位点加以确认, 作者又做了三级质谱, 可能由于样品中多磷酸化肽段的丰度

[11]

较高, 三级谱图也出现同样的问题. M oser 等比较了QST AR (ESI 2QT OF 2MS ) 和LT Q (线性离子阱) 两种质谱仪, 认为QST AR 比LT Q 更适合磷酸肽的序列分析. 一方面由于QST AR 的高压、高碰撞效率的内腔, 肽段裂解效率更高, 更易发生中性丢失峰, 另一方面由于飞行时间质量分析器的高分辨、高质量精确度, 利于电荷状态的确认, 减少假阳性. 然而, 由于LT Q , , 在一定程度, 磷酸化位.

　糖基化修饰

根据氨基酸和糖链的连接方式不同, 蛋白质糖基化可分为4类:N 2糖基化、O 2糖基化、C 2甘露糖化和聚糖磷脂酰肌醇锚(G PI 2anchor ) 糖基化. 蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性, 即不同的糖链可连于同一位点以及在同一蛋白质上也可有不同的位点连接不同的糖链. 糖基化的不均一性给糖蛋白质的分离分析带来了很大的困难:不同糖型的同一蛋白质会在电泳上呈现弥散的条带, 导致信号分散, 较

[18]

低丰度的蛋白质得不到鉴定; 造成糖蛋白质在色谱中不能良好的分离; 在质谱上表现为一簇分辨率很差的峰

, 得不到准确的分子量. 鉴于此, 当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系, 分离富集糖蛋白质Π糖肽, 消除糖基化的不均一性及其对质谱的影响, 质量标记糖基化位点, 从而扬长避短, 实现大规模高通量糖蛋白质及糖基化位点的鉴定. 目前, 常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、

β消除麦克尔肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、加成反应. 基于质谱的糖蛋白质鉴定及糖基化位点

β确定方法有:PNGase F 酶法、Endo H 酶法、2消除麦

克尔加成反应、三氟甲基磺酸法. 后两种方法未见用于规模化糖蛋白质分析的相关报道. 2. 1　N 2糖基化修饰类型的分析

基于糖蛋白质本身的复杂性, 在糖蛋白质组的研究中必须运用多元化的技术和策略. Hagglund [19]

等在对人血浆糖蛋白质进行研究时采用凝集素亲和与亲水相互作用色谱相结合的方法, Endo H 酶

96中国生物化学与分子生物学报23卷

法切糖, 从而在N 2糖基化位点处留下G lcNAc 起到质量标记的作用, 用ESI Q 2T OF 质谱鉴定得到37个

[20]

蛋白质的67个糖肽. Bunkenborg 等采用两步凝集素亲和的方法分别富集糖蛋白质和糖肽, 采用PNG ase F 酶法使天冬酰胺转变为天冬氨酸, 造成质

析, 共鉴定了12个O 2G lcNAc 化位点. EC D 是存在于傅立叶转换离子回旋共振质谱仪中的新型蛋白Π肽段裂解方式, 在EC D 条件下, 翻译后修饰甚至非公价键维系的二级结构都可保持稳定, 使得EC D 成为非常有前途的翻译后修饰研究工具. 2. 3　聚糖磷脂酰肌醇锚糖基化

聚糖磷脂酰肌醇锚定蛋白质(G lycosylphosphatidylinositol 2anchored proteins , G PI 2APs ) 是由聚糖磷脂酰肌醇基团共价连接于蛋白质的C 末端形成, 由于锚定于脂双层而具有固有膜蛋白

量数增加0198Da , 用LC Q 离子阱质谱鉴定出人血清中77个糖蛋白质中86个糖基化位点. K ristiansen [21]

等把凝集素亲和法与一维凝胶电泳相结合对人胆汁进行研究, 在使用PNG ase F 进行切糖时, 采用

O 的水进行标记, 造成质量数增加3Da , 这种方法

[22]

减少了由于自发脱氨基带来的假阳性. Liu 等在对人血浆N 2糖蛋白质进行研究时, 先采用免疫亲和的方法去除血浆中的高丰度蛋白质, 再用肼化学法富集糖基化蛋白质, 柱内酶解蛋白后, 使用PNG ase F 释放N 2糖肽, 经SCX 分离, 通过反相毛细管色谱2LT Q 离子阱串联质谱对糖肽进行分析. , 用FTICR , 总共鉴定了N 2, 有639个N . , 凝集素亲和, 肼化学法由于其高特异性也受到越来越多的关注, 上述报道也是目前肼化学法应用最成功的例子. 2. 2　O 2糖基化修饰类型的分析

对于O 2糖蛋白质来说, 现在还没有一种能与

N 2糖蛋白质研究中应用的PNG ase F 相比的一种酶

质的一些物理化学特性. 对G PI 2APs 的主要研究方

[25]

法是采用“shave 2and 2conquer ”的策略, 该方法采用两相分离法, 肌磷PI APs 被释放而、免疫印迹2串联质谱对蛋白质进行鉴定. Borner [26]

等同时采用差减蛋白质组学的策略, 对经PI 2P LC 处理和未经PI 2P LC 处理的样品的水相蛋白质进行二维荧光差示凝胶电泳分离, 由于污染蛋白质在2个组分中共同存在, 将相同的蛋白质剔除后便得到纯的G PI 2APs.

3　泛素化修饰

泛素是由76个氨基酸组成的多肽, 高度保守, 可通过异肽键与靶蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基共价连接. 从酵母到哺乳动物, 泛素化都是细胞蛋白质降解和功能调控中非常重要的调控机制, 重要性甚至可以与磷酸化相当. 对泛素化修饰的研究应包括

[27,28]

以下几个方面:1) 哪些蛋白质被泛素化修饰? 2) 泛素结合在蛋白质的什么位点? 3) 自然发生的多聚泛素化链中泛素2泛素结合位点在哪里? 4) 泛素2蛋白酶系统:鉴定调节泛素和类泛素系统的酶体系构成. 对泛素化蛋白质富集主要是基于标记法进行的, 即对泛素进行亲和标签标记(常用6xHis ) , 再采用镍螯合色谱亲和提取泛素化蛋白质. 由于泛素的C 末端是Arg 2G ly 2G ly 结构, 经胰蛋白酶水解后, G ly 2G ly 留在被修饰蛋白质的肽链上, 使肽段质量增加114, 起到质量标记泛素化位点的作用, 进而通过串

[29]

联质谱鉴定泛素化位点. Peng 等运用此方法, 再结合SCX 、RP 2LC 分离泛素化肽段, 通过LC Q 串联质谱鉴定酵母中的1075个泛素化蛋白质,110个泛素化位点. 这种方法已经被延伸运用到了哺乳动物体

[30]

系的泛素化研究中

. 近来, 基于双亲和策略的富

用以实现去糖基化及质量标记糖基化位点, 因而O 2

[23]

糖蛋白质组学的研究鲜有报道. K hidekel 等采用体外标记方法将一个带有酮基的UDP 2半乳糖特异地连接到O 2G lcNAc 上, 然后利用酮基的反应性与生物素连接, 进而通过抗生物素蛋白富集糖基化蛋白质. 这种标记方法不依赖于生物体自身代谢途径, 大大扩展了方法的适用范围, 用这种方法K hidekel 等从鼠脑中鉴定了25个O 2G lcNAc 化蛋白质. Vosseller [24]

等采用凝集素弱亲和色谱的方法对鼠脑突触后密集区的O 2G lcNAc 蛋白质进行研究, 通过凝集素对O 2G lcNAc 肽段的弱亲和作用, 延长了对含O 2G lcNAc 肽段的保留时间, 其实质相当于离子交换色谱的作用, 与高效液相色谱连用, ESI 2QqT OF 2MS 鉴定了63个O 2G lcNAc 肽段. 该方法的优点是可直接富集体内的O 2G lcNAc 化蛋白质, 无需对糖基化位点进行化学或酶解标记的改造, 方法简单. 同时, 作者还采用了电子捕获裂解(electron capture diss ociation , EC D ) 对O 2G lcNAc 化位点进行分析. 这也是目前EC D 首次运用于复杂样品的修饰位点分

第2期

[31]

刘金凤等:翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略97　

集方法频繁出现,May or 等采用多聚泛素结合柱与镍螯合色谱相结合, 对酵母中Rpn10依赖的泛素

[32]

化蛋白质进行鉴定; T ag werker 等则采用基于双标记的双亲和富集策略, 对泛素基团进行六组氨酸标签标记和生物素标签标记, 然后依次采用镍螯合色谱、链霉抗生物素蛋白亲和提取泛素化蛋白质, 同时针对富集方法中链霉抗生物素蛋白的紧密折叠特性采用两步酶解的方法(Lys 2C 、trypsin ) 从柱上洗脱、酶解泛素化蛋白质, 结合SCX 、RP 2LC 色谱分离, QST AR 质谱鉴定到258个泛素化蛋白质. 目前, 对泛

4. 1　酪氨酸硝化　一般说来, 硝化是在酪氨酸残基

的酚环的3位上加上1个硝基(—NO 2) , 是细胞内过

氧化亚硝酸根离子(—ONOO ) 形成的结果. 目前, 大部分的酪氨酸硝化的蛋白质组研究是在某种刺激条件下, 以酪氨酸硝化抗体为基础进行的. Aulak [36]

等研究与炎症相关的硝化蛋白质, 采用二维电泳与免疫印迹相结合的方法,M A LDI 2T OF 2MS 鉴定了40多个酪氨酸硝化免疫阳性的蛋白质, 其中10多

[37]

个已被鉴定过. K anski 等采用连续的溶液等电聚焦进行样品体系的简化, 再对粗分离的组分进行S DS 2PAGE 分离、免疫印迹检测, 目标蛋白质经LC 2LC Q 串联质谱分析鉴定出11. 4. 2　S 2　S 2, S 2亚硝化, (—NO ) .

素蛋白的研究已从真核细胞体系延伸到哺乳动物体

系中, 对泛素的标记方法也有所发展, 像璜酸化, 现在该方法还停留在标准蛋白的试验阶段, 在规模化的泛素化蛋白鉴定中的应用还未见报道.

对泛素自身的修饰位点的研究. 目前, 在酵母体

]

系中, 已经表明, 泛素中的7泛素链, . 2蛋白质相互作用在泛素2蛋白酶体系中承担了重要的角色, 运用亲和纯化与质谱相结合的方法, 多种细胞和组织中的去泛素化蛋白酶已被鉴定, 并且鉴定出许多新的去泛素

[33]

化系统成员.

总之, 现有的泛素化蛋白规模化研究方法很少, 且种类单一, 鉴定细胞蛋白的泛素化底物, 泛素化位点及泛素自身的修饰位点, 还需要有重大的技术上的进步.

除了泛素化修饰之外, 还发现了一大家族———类泛素化修饰. 类泛素化与泛素化具有显著的序列同源性, 许多情况下通过相似的机制形成蛋白质的共价修饰. 目前, 许多与泛素化修饰相似的研究方[34]

法运用到了Sum oylation (类泛素化修饰的一种) 的研究中.

2“biotin 2, Jaffrey 等提, :(1) 封闭所有自由巯基; (2) 选择性还原S —NO 键; (3) 还原产生的新的自由

[38]

巯基通过形成杂和的二硫键引入生物素标签, 从而对蛋白质进行了质量标记以及亲和标记; (4) 通过固相的抗生物素蛋白富集目标蛋白质. 这种方法克服了直接对亚硝化蛋白质进行分析时产生的易变性, 避免了进行质谱鉴定时产生的S —NO 的断裂. 许多

[39]

研究运用这种方法与一维凝胶电泳或二维凝胶电泳相结合, 再通过质谱鉴定发生亚硝酰化的蛋白

[40]

质. Hao 等对该方法进行了发展, 先用胰酶把蛋白质酶解再进行抗生物素蛋白富集, 然后结合液相色谱2串联质谱进行蛋白质鉴定. 4. 3　谷胱甘肽化　谷胱甘肽化(glutathionylation ) 即谷胱甘肽(G SH ) 在谷氧还蛋白酶的催化下与蛋白质的半胱氨酸形成二硫键, 该过程是可逆的. Lind [41]

等采用与S 2亚硝酰化相似的分析方法, 在生物素标记蛋白富集前对蛋白进行酶解, 富集谷胱甘肽化肽段, 从而鉴定到发生修饰的位点. 人们发现, 日本裂体吸虫分泌的谷胱甘肽2S 2转移酶可以结合S 2谷胱甘肽化蛋白的谷胱甘肽簇. 基于此,Cheng 等将谷胱甘肽2S 2转移酶用生物素标记后, 采用一种类似免疫印迹的方法检测谷胱甘肽化蛋白, 这为谷胱甘肽化蛋白质的检测提供了一种简便易行的方法. 由于S 2亚硝化谷胱甘肽(G S NO ) 也是一种G S 2供体, 可

[43]

以与蛋白质形成杂和的二硫键, 因而

K latt 等把G S NO 与琼脂糖凝胶相结合, 通过G S NO 柱来结合目标蛋白质, 但这种方法不能反映体内实际发生谷胱甘肽化修饰的蛋白质情况, 只能检测那些易受谷胱

[42]

4　氧化还原修饰

活性氧和氮类可以对特定蛋白质进行各种各样的化学修饰, 如果这种修饰是不可逆的, 则经常与蛋白质功能的永久丧失相关, 可以导致损害蛋白质的消除或积累; 可逆修饰, 特别是发生在半胱氨酸残基上的, 可以起到保护半胱氨酸避免发生不可逆氧化

[35]

修饰和调节蛋白功能的双重作用. 在这里, 我们对已有的基于蛋白质氧化还原状态进行研究的蛋白质组学进行介绍.

98中国生物化学与分子生物学报23卷

甘肽化影响的蛋白质.

4. 4　半胱氨酸氧化2还原　半胱氨酸在氧化条件下

可形成二硫键、亚氧硫基(—S OH ) 、亚硫酸基(—S O 2H ) 、硫酸基(—S O 3H ) , 其中亚硫酸基和硫酸基是半胱氨酸的不可逆氧化形式, 可能与生物活性的丧失有关

[44][45]

的脂基化位点, 法呢基上的叠氮基团可与连有不同

标记物(如生物素) 的三芳基膦脂反应, 然后通过检测标志物确定修饰蛋白的存在. 运用这种方法, K ho 等鉴定了C OS 21细胞中的18个法呢基化蛋白. 该方法最早由Bertozzi

[51]

运用于O 2G lcNAc 化的研究中.

. 为了系统地研究细胞的氧化还原调节,

采用硫醇特异的荧光标记, 并结合两种类

型的双向电泳(non 2reducing Πreducing 22DE 和IEF ΠY ano 等

S DS 2PAGE ) , 成功鉴定到花生中受硫氧还蛋白调控

6　展望

虽然大规模翻译后修饰蛋白质的研究已经轰轰

烈烈的展开, 利用现有的技术也可以鉴定一定数量的翻译后修饰蛋白, 但对于整个翻译后修饰蛋白质组学来讲, 已作的研究很可能只是“冰山的一角”, 翻译后修饰蛋白质组学的研究需要更特异有效的富集分离方法、. , , 因而, 定量研究翻译后修饰尤为重要. 目前, 多种多样的稳定同位素标记方法已用于不同样品的蛋白质定量, 相似的方法也可用于翻译后修饰的定量研究. 定量技术的发展应用, 可以提高鉴定结果的可信度, 也必将促进新型生物质谱技术的研究. 同时, 高通量翻译后修饰蛋白质研究的发展, 导致海量的蛋白质鉴定结果的产出, 随之而来的问题就是, 如何确保产出数据的可靠性, 目前翻译后修饰蛋白的鉴定主要采用数据库检索和人工读图相结合的方法, 费时费力, 远远不能满足翻译后修饰蛋白质组学的发展要求. 尽管如此, 相信随着科学的发展, 这些问题都将迎刃而解, 人们对翻译后修饰蛋白质的认识将更为深刻, 这也必将加深人们对蛋白质生物功能多样性的认识以及体内信号网络通路的理解.

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的20多个蛋白. Lee 等

[44]

对一种植物中含有二硫键

的蛋白质进行了研究, 采用硫醇亲和色谱富集目的蛋白, 共鉴定到65个公认的含二硫键的蛋白. M oan 等

[46]

则采用双标记的方法对啤酒酵母中的硫醇氧

化蛋白分别进行富集和定量, 总共质谱鉴定了64个蛋白质.

总之, , A 定, 越多的关注, , 从而能更深刻地理解氧化还原修饰的功能.

5　其它修饰

其它修饰像乙酰化、甲基化、脂基化也有报道, 但并不多见. Ong 等

采用免疫沉淀方法, 同时结

合细胞培养过程中的稳定同位素标记氨基酸(stable is otope labeling by amino acid in cell culture , SI LAC ) 对

[47]

甲基化修饰进行定量, 鉴定得到了59个甲基化位点. I wabata 等

[48]

采用二维电泳与免疫印迹结合的方

法对鼠脑、骨骼肌的赖氨酸甲基化、赖氨酸乙酰化进行分析, 发现不同器官的赖氨酸甲基化、乙酰化的蛋白质类型有很大差别. MacC oss 等采用鸟枪法与多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology , MudPIT ) 相结合的策略, 对应

[49]

不同的修饰分别进行数据库检索, 在一次实验中共鉴定了4种修饰:磷酸化、甲基化、乙酰化、氧化. 目前已发现的蛋白质的脂基化类型有4种:十四酰化(myristoylation C 14H 26O ) 、十六酰化(palmitoylation , C 16H 30O ) 、异戊烯化Π法呢基化(S 2prenylation Πfarnesyl , C 15H 25) 、香叶基香叶基化(geranylgeranyl , C 20H 33) . 其中, 法呢基化的蛋白组学

研究已有报道. K ho 等

[50]

采用tagging 2via 2substrate 的

策略, 将叠氮法呢基类似物加入到细胞的培养基中, 利用细胞自身的代谢途径将叠氮法呢基连接到特定

第2期刘金凤等:翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略

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中国生物化学与分子生物学会2007年期刊活动计划表

活动名称

主要内容

联系人马康涛

电话[1**********]6

[1**********]7

《中国生物化学与分子生物学报》

1编辑部内部会议(北京地区, 北大编辑出版的学术研讨

医学部,7～8人, 每月1次)

《中国生物化学与分子生物学报》1. 审定发表稿件; 2. 汇报学报网2编委会(北京地区, 北大医学部, 刊及纸刊发行运营情况3. 征集

20～30人, 每季度1次) 商讨学报发展的有关事宜3

马康涛

[1**********]6

[***********]921088

《生命的化学》编委审稿会(上海, 每双月20日左右,20人) 审定稿件和对编辑部工作提出意见和建议

王同喜

(中国生物化学与分子生物学会秘书处　供稿)