实验十 血糖的测定
血液中的葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定,维持在3.9mmol /L ~6.1mmol /L 之间。血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一,有着双重实际意义:其一,维持稳定的能源供给,满足机体在各种生理状态下对能量的需求。其二,保证机体不因进食致血糖浓度过高,导致糖的丢失。
因此,血糖的测定是临床生化检验实验室的常规检测项目。血糖测定按其发展过程及反应原理的不同,大致分三类:氧化还原法 ,缩合法(主要有邻甲苯胺法),酶法(主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法)。下边介绍两种方法供选择。
一、葡萄糖氧化酶法
【目的】
1. 了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理,能进行血糖测定的操作。 2. 掌握血糖测定的临床意义。 【原理】
葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase,GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶 (peroxidase,POD) 作用下,分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物,即 Trinder 反应。其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比,在505nm 波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血糖的浓度。反应式如下:
葡萄糖+O 2+2H 2O
GOD
葡萄糖酸+
2H 2O 2
2H 2O 2+4-氨基安替比林+酚
【器材】
红色醌类化合物
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】
1. 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)
称取无水磷酸氢二钠8.67g 及无水磷酸二氢钾5.3g 溶于800ml 蒸馏水中,用1mol/L氢氧化钠(或1mol/L盐酸)调节pH 至7.0,然后用蒸馏水稀释至1L 。 2. 酶试剂
称取过氧化物酶1200U ,葡萄糖氧化酶1200U ,4-氨基安替比林10mg ,叠氮钠100mg ,溶于上述磷酸盐缓冲液80ml 中,用1mol/L NaOH调pH 至7.0,加磷酸缓冲液至100ml 。
置冰箱保存,4℃可稳定3个月。 3. 酚溶液
称取重蒸馏酚100mg 溶于100ml 蒸馏水中(酚在空气中易氧化成红色,可先配成500g/L的溶液,贮存于棕色瓶中,用时稀释),用棕色瓶贮存。 4. 酶酚混合试剂
取上述酶试剂与酚溶液等量混合,4℃可以存放一个月。 5. 12mmol/L苯甲酸溶液
溶解苯甲酸1.4g 于蒸馏水约800ml 中,加温助溶,冷却后加蒸馏水至1L 。 6.葡萄糖标准贮存液(100mmol/L)
称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g ,溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml 中,并移入100ml 容量瓶内,再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml 。
7. 葡萄糖标准应用液(5mmol/L)
吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml 于100ml 容量瓶中,加12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。 【操作】
取3 支试管, 编号,按下表操作。
表3-12 血糖测定操作步骤
加入物 (ml) 血清 葡萄糖标准液 蒸馏水 酶酚混合液
混匀,置 37 ℃水浴中保温 15分钟,在波长 505nm 处比色,以空白管调零,读取标准管及测定管吸光度。
【计算】
测定管吸光度
血糖(mmol/L)×5 标准管吸光度
空白管 - - 0.02 3.0
标准管 - 0.02 - 3.0
测定管 0.02 - - 3.0
血清葡萄糖(mmol/L)=
【注意事项】
标准管吸光度测定管吸光度
×5
1.测定结果如超过20mmol /L ,应将标本用生理盐水稀释后再测定,结果乘以稀释倍数。
2.若酶酚混合试剂呈红色,应弃之重配。因标本和标准用量少,其加量是否准确对测定结果影响较大,故其加量必须准确。
3.GOD-POD 法的第一步反应特异性高,而由POD 催化的第二步指示反应是非特异性的,易受标本中尿酸、维生素C 、谷胱甘肽、胆红素等还原物的干扰,这些物质与色素原竞争H 202,使测定结果偏低。
4.Trinder 反应由Trinder 于1969年提出。后经许多学者改进,采用2,4-二氯酚、2-羟-3,5-二氯苯磺酸等代替苯酚,由于这些化合物氧化生成的色素的摩尔吸光系数均高于苯酚,使反应灵敏度得以提高。
【正常参考范围】 3.9~6.1mmol/L 【临床意义】
1. 生理性高血糖 可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后,或精神紧张、交感神经兴奋,肾上腺分泌增加时。 2. 病理性高血糖
⑴糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。
⑵对抗胰岛素的激素分泌过多:如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α-细胞瘤等。
⑶颅内压增高:颅内压增高(如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等)刺激血糖中枢,出现高血糖。
⑷脱水引起的高血糖:如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。 3. 生理性低血糖 饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。 4. 病理性低血糖
⑴胰岛素分泌过多:由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。
⑵对抗胰岛素的激素分泌不足:如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退等。
⑶严重肝病患者:肝贮存糖原及糖异生功能低下,不能有效调节血糖。 【结果及分析】
【思考题】
1. 血糖有哪些来源和去路,机体是如何调节血糖浓度恒定的? 2. 酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制,用蒸馏水是否可以,为什么?
二、邻甲苯胺法
【目的】
了解测定血糖的原理和方法,要求在实验中培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力。
【原理】
葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺,后者脱水生成雪夫(Schiff )碱,再经结构重排,生成有色化合物。颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。其反应式如下:
葡萄糖 + 邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺
葡萄糖邻甲苯胺雪夫碱
【器材】
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】
1.邻甲苯胺试剂
于940ml 冰醋酸中加入硫脲1.5g, 邻甲苯胺60ml, 混合, 直至硫脲完全溶解, 置棕色试剂瓶中, 室温保存。新配试剂应放置24小时后(待老化)使用。此试剂腐蚀性强,避免接触皮肤,应用自动吸管加液。
2.12mmol/L苯甲酸溶液
于900ml 蒸馏水中加入苯甲酸1.4g, 加热助溶, 冷却后置于1L 容量瓶中, 加蒸馏水至刻度。
3.葡萄糖标准储存液(100mmol/L)
称取无水葡萄糖(预先置80℃烤箱干燥至恒重,移置干燥器内保存)1.802g, 溶解于80ml 苯甲酸溶液中, 移置100ml 容量瓶中, 再加苯甲酸溶液至刻度。
4.葡萄糖标准应用液(5mmol/L)
取葡萄糖标准储备液5ml ,置于100ml 容量瓶中,加苯甲酸溶液至刻度。 【操作】
1.取16×150mm 试管3支按下表进行操作:
表3-13 血糖测定操作步骤
试剂(ml ) 血清或血浆 葡萄糖标准应用液
蒸馏水 邻甲苯胺试剂
2.将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟,取出用自来水冷却5分钟。注意在煮沸时水浴中的水面必须高于试管内的液面。否则则温度不均而影响比色。
3.用波长630nm 分光光度计进行比色,空白管调零点,读取测定管与标准管吸光度。 4.计算
测定管吸光度
血糖(mmol/L)×5 标准管吸光度
5.本测定法空腹血糖正常值为3.89~6.11 mmol/L(70~110mg/dl)。 【临床意义】 同上。 【结果及分析】
【思考题】
讨论血糖升高和降低的临床意义及其维持恒定的因素?
测定管 0.1 — — 3.0
标准管 — 0.1 — 3.0
空白管 — — 0.1 3.0
实验十 血糖的测定
血液中的葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定,维持在3.9mmol /L ~6.1mmol /L 之间。血糖浓度的相对恒定是机体进行正常生理活动的前提条件之一,有着双重实际意义:其一,维持稳定的能源供给,满足机体在各种生理状态下对能量的需求。其二,保证机体不因进食致血糖浓度过高,导致糖的丢失。
因此,血糖的测定是临床生化检验实验室的常规检测项目。血糖测定按其发展过程及反应原理的不同,大致分三类:氧化还原法 ,缩合法(主要有邻甲苯胺法),酶法(主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法)。下边介绍两种方法供选择。
一、葡萄糖氧化酶法
【目的】
1. 了解葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理,能进行血糖测定的操作。 2. 掌握血糖测定的临床意义。 【原理】
葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase,GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶 (peroxidase,POD) 作用下,分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物,即 Trinder 反应。其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比,在505nm 波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血糖的浓度。反应式如下:
葡萄糖+O 2+2H 2O
GOD
葡萄糖酸+
2H 2O 2
2H 2O 2+4-氨基安替比林+酚
【器材】
红色醌类化合物
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】
1. 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)
称取无水磷酸氢二钠8.67g 及无水磷酸二氢钾5.3g 溶于800ml 蒸馏水中,用1mol/L氢氧化钠(或1mol/L盐酸)调节pH 至7.0,然后用蒸馏水稀释至1L 。 2. 酶试剂
称取过氧化物酶1200U ,葡萄糖氧化酶1200U ,4-氨基安替比林10mg ,叠氮钠100mg ,溶于上述磷酸盐缓冲液80ml 中,用1mol/L NaOH调pH 至7.0,加磷酸缓冲液至100ml 。
置冰箱保存,4℃可稳定3个月。 3. 酚溶液
称取重蒸馏酚100mg 溶于100ml 蒸馏水中(酚在空气中易氧化成红色,可先配成500g/L的溶液,贮存于棕色瓶中,用时稀释),用棕色瓶贮存。 4. 酶酚混合试剂
取上述酶试剂与酚溶液等量混合,4℃可以存放一个月。 5. 12mmol/L苯甲酸溶液
溶解苯甲酸1.4g 于蒸馏水约800ml 中,加温助溶,冷却后加蒸馏水至1L 。 6.葡萄糖标准贮存液(100mmol/L)
称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g ,溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml 中,并移入100ml 容量瓶内,再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml 。
7. 葡萄糖标准应用液(5mmol/L)
吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml 于100ml 容量瓶中,加12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。 【操作】
取3 支试管, 编号,按下表操作。
表3-12 血糖测定操作步骤
加入物 (ml) 血清 葡萄糖标准液 蒸馏水 酶酚混合液
混匀,置 37 ℃水浴中保温 15分钟,在波长 505nm 处比色,以空白管调零,读取标准管及测定管吸光度。
【计算】
测定管吸光度
血糖(mmol/L)×5 标准管吸光度
空白管 - - 0.02 3.0
标准管 - 0.02 - 3.0
测定管 0.02 - - 3.0
血清葡萄糖(mmol/L)=
【注意事项】
标准管吸光度测定管吸光度
×5
1.测定结果如超过20mmol /L ,应将标本用生理盐水稀释后再测定,结果乘以稀释倍数。
2.若酶酚混合试剂呈红色,应弃之重配。因标本和标准用量少,其加量是否准确对测定结果影响较大,故其加量必须准确。
3.GOD-POD 法的第一步反应特异性高,而由POD 催化的第二步指示反应是非特异性的,易受标本中尿酸、维生素C 、谷胱甘肽、胆红素等还原物的干扰,这些物质与色素原竞争H 202,使测定结果偏低。
4.Trinder 反应由Trinder 于1969年提出。后经许多学者改进,采用2,4-二氯酚、2-羟-3,5-二氯苯磺酸等代替苯酚,由于这些化合物氧化生成的色素的摩尔吸光系数均高于苯酚,使反应灵敏度得以提高。
【正常参考范围】 3.9~6.1mmol/L 【临床意义】
1. 生理性高血糖 可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后,或精神紧张、交感神经兴奋,肾上腺分泌增加时。 2. 病理性高血糖
⑴糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。
⑵对抗胰岛素的激素分泌过多:如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α-细胞瘤等。
⑶颅内压增高:颅内压增高(如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等)刺激血糖中枢,出现高血糖。
⑷脱水引起的高血糖:如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。 3. 生理性低血糖 饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。 4. 病理性低血糖
⑴胰岛素分泌过多:由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。
⑵对抗胰岛素的激素分泌不足:如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退等。
⑶严重肝病患者:肝贮存糖原及糖异生功能低下,不能有效调节血糖。 【结果及分析】
【思考题】
1. 血糖有哪些来源和去路,机体是如何调节血糖浓度恒定的? 2. 酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制,用蒸馏水是否可以,为什么?
二、邻甲苯胺法
【目的】
了解测定血糖的原理和方法,要求在实验中培养学生严谨的作风和准确地进行实际操作的能力。
【原理】
葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺,后者脱水生成雪夫(Schiff )碱,再经结构重排,生成有色化合物。颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。其反应式如下:
葡萄糖 + 邻甲苯胺葡萄糖邻甲苯胺
葡萄糖邻甲苯胺雪夫碱
【器材】
试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计 【试剂】
1.邻甲苯胺试剂
于940ml 冰醋酸中加入硫脲1.5g, 邻甲苯胺60ml, 混合, 直至硫脲完全溶解, 置棕色试剂瓶中, 室温保存。新配试剂应放置24小时后(待老化)使用。此试剂腐蚀性强,避免接触皮肤,应用自动吸管加液。
2.12mmol/L苯甲酸溶液
于900ml 蒸馏水中加入苯甲酸1.4g, 加热助溶, 冷却后置于1L 容量瓶中, 加蒸馏水至刻度。
3.葡萄糖标准储存液(100mmol/L)
称取无水葡萄糖(预先置80℃烤箱干燥至恒重,移置干燥器内保存)1.802g, 溶解于80ml 苯甲酸溶液中, 移置100ml 容量瓶中, 再加苯甲酸溶液至刻度。
4.葡萄糖标准应用液(5mmol/L)
取葡萄糖标准储备液5ml ,置于100ml 容量瓶中,加苯甲酸溶液至刻度。 【操作】
1.取16×150mm 试管3支按下表进行操作:
表3-13 血糖测定操作步骤
试剂(ml ) 血清或血浆 葡萄糖标准应用液
蒸馏水 邻甲苯胺试剂
2.将上述各管混匀放入沸水浴中加热12分钟,取出用自来水冷却5分钟。注意在煮沸时水浴中的水面必须高于试管内的液面。否则则温度不均而影响比色。
3.用波长630nm 分光光度计进行比色,空白管调零点,读取测定管与标准管吸光度。 4.计算
测定管吸光度
血糖(mmol/L)×5 标准管吸光度
5.本测定法空腹血糖正常值为3.89~6.11 mmol/L(70~110mg/dl)。 【临床意义】 同上。 【结果及分析】
【思考题】
讨论血糖升高和降低的临床意义及其维持恒定的因素?
测定管 0.1 — — 3.0
标准管 — 0.1 — 3.0
空白管 — — 0.1 3.0