第４２卷第２０期２０１４年１０月
广 州 化 工
Ｖｏｌ畅４２Ｎｏ畅２０
土壤微生物多样性研究的新进展倡
李旭东，徐莉娜，薛林贵
（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 ７３００７０）
摘 要：土壤微生物是土壤生态系统的一个重要组成部分，在维持整个土壤生态系统能量流动和物质循环中发挥着关键作
用，同时，土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构、功能和过程。因此，对土壤微生物多样性的研究有着重大意义。本文从
土壤微生物多样性的影响因素以及目前该领域研究所采用的研究方法等方面阐述了国内外土壤微生物多样性的研究现状，同时对各种研究方法的适用范围、优缺点等作了较为详细的分析、比较，并对该领域未来研究工作的重点方面作了展望。
关键词：微生物多样性；土壤；影响因素；研究方法
１＋３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－９６７７（２０１４）０２０－０００６－０５中图分类号：Ｑ９３８畅
New Research Progress on Soil Microbial Community Diversity
倡
LI Xu －dong ，XU Li －na ，XUE Lin －gui
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬａｎｚｈｏｕＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧａｎｓｕＬａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）Abstract ：Ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｗａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐａｒｔｏｆｓｏｉｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈｐｌａｙｅｄａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｅｎｅｒｇｙｆｌｏｗｉｎｇａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｃｙｃｌｉｎｇｏｆｔｈｅｅｎｔｉｒｅｓｏｉｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍ畅Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｓｏｉｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍ畅Ｓｏｉｔｗａｓｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ畅Ｔｈｅａｄｖａｎｃｅｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙ畅Ｔｈｅｄｅｔａｉｌｅｄａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｅｖｅｒｙｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅａｌｓｏｍａｄｅ畅Ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔａｓｐｅｃｔｓｏｆｆｕｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ畅
Key words ：ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｓｏｉｌ；ｅｆｆｅｃｔｆａｃｔｏｒｓ；ｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄ
土壤中存在着种类丰富和数量及其庞大的微生物，到目前
［１］
为止，已经被描述出来的微生物大约有５０００种。但是由于培养技术和仪器设备的局限，可培养微生物只占土壤中全部微
［２］
生物的１％左右。作为土壤生态系统的一个重要组成部分，土壤微生物在维持整个土壤生态系统能量流动和物质循环中发
［３］
挥着关键作用。土壤微生物在种类和数量上都是最多的，而且它影响土壤生态系统的结构、功能和过程，是维持土壤生产
［４］
力的重要指标。土壤微生物扮演着主要分解者的角色。从植
［５］［６］［７］
物的凋落物、纤维素的分解，到动物尸体的分解，土壤
［８］
微生物都发挥着主要的作用。在污染土壤，原油泄漏等环境［９］
中，起到恢复生态环境的作用。其次，土壤微生物是物质和能量循环的重要成员，能够推动Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｓ等的循环。
近年来由于人口的增加、工农业生产的大力发展、自然资源的过度开发、环境污染的日益加剧以及外来物种的入侵，土壤微生物多样性受到了强烈的干扰和严重的破坏，许多土壤环境中微生物的多样性降低。所以土壤微生物多样性研究就显得格外重要。此外，微生物多样性研究是微生物生态学的重要研究内容之一，是微生物学发展进入新阶段的标志，更是生物多
［１０］
样性科学的重要进展。微生物多样性研究在环境监测、遗传研究、物种多样性保护以及新资源开发等方面都发挥着至关重
倡
要的作用。本文综述了土壤微生物多样性的影响因素及目前在土壤微生物多样性研究方面所采用的研究方法并进行比较，以期为进一步开展同类研究工作提供科学依据和方法指导。
［１１］
1 土壤微生物多样性的影响因素
1畅1 土 壤
土壤是一个非常复杂的生态系统，是由无数个拥有不同物化性质和独特环境条件的微小生境组成的。近年来大量实验都证明了土壤类型是土壤微生物群落结构和种群密度的主要影响
［１２］
因素。Ｓｅｓｓｉｔｓｃｈ等通过Ｔ－ＲＦＬＰ技术对长期施肥土壤中微生物多样性研究表明，微生物的群落结构与土壤颗粒之间有显
［１３］
著的相关性。土壤颗粒越小，微生物多样性越高。Ｓｍｉｔｈ等通过对五大细菌分枝的１６ＳｒＲＮＡ序列的分布，寻找微生物类群丰度同土壤营养状况之间的关系，分析结果表明，在可利用营养基质较高的土壤中，α－和γ－Proteobacteria 丰度较高；在营养状况较差或者存在大量不可利用基质的土壤中，Acidobacterium 比例升高。
1畅2 植 被
地上植被是土壤中细菌多样性的重要影响因子之一
［１４］
。地
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ：３１２６０１３５）；教育部长江学者和创新团队发展计划项目（Ｎｏ：ＩＲＴ０９６６）。
作者简介：李旭东（１９８８－），男，硕士研究生，主要从事环境微生物学的研究工作。通讯作者：薛林贵（１９６２－），男，教授，博士，主要从事环境微生物学的研究工作。
上植被通过影响土壤中的有机氮和有机碳、土壤水分、温度、通气性和ｐＨ值等来影响土壤微生物多样性。植被的存在有利于增加土壤微生物多样性和微生物生物量；反之，植被的破坏
［１５］
可能改变微生物组成并降低微生物多样性。Ｈａｃｋｌ等采用Ｔ－ＲＦＬＰ和１６ＳｒＲＮＡ分析澳大利亚六个天然森林土壤中真细菌群落结构，发现不同森林土壤之间细菌群落结构存在变化，在松树林土壤中，依照相对丰度优势真细菌类群依次为α－Proteobacterial （２０％）和Holophage ／Acidobacteri （１２％），而橡胶树林中真细菌类群依次为Holophage ／Acidobacteri （３５％），Verrucomicrobia （２４％）和α－Proteobacterial （２７％）。
1畅3 季节变化（温度，水分）
磷脂脂肪酸是构成活体细胞膜的重要组成部分，其含量在正常生理条件下相对稳定且具有特异性，因此ＰＬＦＡ可作为微
［２７］
生物群落标记分析物。细胞死亡后细胞膜水解同时释放
［２８］
ＰＬＦＡ，ＰＬＦＡ的总量可以用来表征微生物的生物量。因此可以用ＰＬＦＡ的变化来了解自然环境中微生物的种类组成和数量的变化。该方法不需要对微生物进行培养，可直接鉴定群落动态。
但是ＰＬＦＡ图谱分析法并不能反映一个单独的微生物种的情况，仅是反映群落结构的特性。而且其分析结果的准确性与微生物体内的ＰＬＦＡ是否完全提取、操作过程是否稳定等有很
［２９］
大的关系。
随着季节变化，土壤中的微生物多样性会随周围气候环境（温度和水分）变化而变化。温度和水分对土壤微生物多样性
的影响存在交互性，具有协同效应［１６］
。夏季温度高，植物代谢旺盛，植物根际分泌物会刺激微生物繁殖；秋季植物生长减缓或者停止，能利用植物凋落物的微生物在土壤中表现活跃；冬
季后，嗜冷和耐冷微生物丰度增加［１７］。Ｌｉｐｓｏｎ等［１８］
对高山冻土土壤细菌群落的研究结果表明，细菌群落结构组成具有季节性变化规律。因此可以用季节的概念来说明不同温度和水分对
微生物多样性和活性的影响［１９］
。
1畅4 管理方式
不同的土壤管理方式会影响土壤中微生物多样性。人们通过施用农药、施肥、改变土壤的耕作方式等因素人为的改变土
壤的理化性质，从而对土壤中微生物的分布产生影响［２０］
。农药（除草剂，杀虫剂等）的使用会改变土壤微生物群落结构，影
响其多样性，也会使土壤中微生物功能发生改变［２１］
。
施肥对土壤微生物多样性及活性的影响非常复杂，可能与肥料的种类、施用方式（施用量、长期施用或短期施用）、土
壤类型和利用方式等因素有关。Ｋａｍｍａ等［２２］
对肯尼亚一处施肥３２年的试验样地分析结果显示，无机肥对细菌多样性产生消极影响Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ，等有机肥（农家肥）对细菌多样性产生积极影响。
［２３］的实验结果表明，长期施用有机肥使得Ｇ＋／Ｇ－
和细菌／真菌的比例提高，细菌和真核微生物多样性受土壤有机碳和Ｃ／Ｎ比的影响。不同的耕作方式也会对微生物多样性产
生影响。Ｌｕｐｗａｙｉ等［２４］和Ｆｅｎｇ等［２５］
通过实验表明，免耕土壤中微生物的多样性高于使用传统耕种方式的土壤中。原因是传统耕种致使土壤团聚体的破裂和有机质的消耗。
2 土壤微生物多样性研究方法
2畅1 基于生化技术的方法
２畅１畅１ 平板培养法
传统的平板培养方法就是根据目标微生物选择相应的专性培养基进行分离培养，然后通过各种微生物的生理生化特性、
外观形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型［２６］
。此方法廉价、易于操作，可以提供活的、异养类型的种群信息。
但是该方法也存在着许多不足之处。首先，土壤中的可培养微生物只占微生物总数的１％左右。其次，富集培养方法存在着高度的选择性。所以，实验室的培养条件不可能完全满足微生物生长所需的温度、ｐＨ、通气等条件，不适应实验室条件的微生物就无法培养。
因此，这种传统的平板培养方法只能作为一种辅助工具，需要结合现代生物技术方法才能更客观而全面地反应微生物群落结构的真实信息。２畅１畅２ 磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡ）图谱分析法
对多个环境微生物样品分析而言，先用全细胞脂肪酸甲酯谱图法（ＷＣＦＡ－ＦＡＭＥｓ）预先筛选再用ＰＬＦＡ法进行分析是提高效率的较佳选择ＧＣ。ＰＬＦＡ２畅１畅－３ ＭＳ的测定方法经过不断完善，采用
［２８］
ＢＩＯＬＯＧ法会更加准确、方便和快捷。会产生自由电子ＢＩＯＬＯＧ方法的测定原理微量分析法
，与四唑盐染料发生氧化还原反应：微生物在对碳源利用的过程中，呈现不同的颜色。颜色的变化可以反映微生物对碳源的利用情况。微生物群落结构差异，每个孔的颜色变化就会不同，这样就可以知道不同样点微生物多样性的差异。
然而，ＢＩＯＬＯＧ系统仅限于检测那些可培养、能迅速生长的微生物。检测结果并不能完全代表原位的代谢多样性。另外，样本处理、培养条件和微平板应用类型等都会给微生物多
样性评价带来误差［３０］
。
根据测试对象的特点（例如ｐＨ，碳源利用类型及利用能力）改进ＢＩＯＬＯＧ体系，并且研究更好的指示剂来代替红四氮唑（ＴＴＣ）。
2畅2 基于分子生物学技术的方法
２畅２畅１ 基于１６ＳｒＲＮＡ基因技术
Ａｐｐｒｏａｃｈ（１）基于ＰＣＲ的测序技术（ＴｈｅＰＣＲ－Ｃｌｏｎｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ将微生物土样制成悬液）
，用微孔过滤法或其他方法聚集微生物细胞后提取ＤＮＡ作为模板，设计引物扩增１６ＳｒＲＮＡ基因，将ＰＣＲ产物连接克隆载体建立克隆文库，进行基因测序。将测得序列与基因库内已知序列进行比对，分析。最后进行微生物多样性等的鉴定。该方法实验周期短，准确性高，在微生物多样性研究中有着广泛的应用。
但是实验的准确性与ＤＮＡ的提取程度有直接关系，也就是受提取工艺及方法的影响较大。
不过现在有多种试剂盒可以解决这个问题。（２）实时荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）
１９９６年美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出了成熟的实时荧光定量ｒｅａｃｔｉｏｎ测ＰＣＲ，ＰＣＲ产物中荧光讯号强度来达到定量的目的ＦＱ（－ｒｅａｌＰＣＲ－）ｔｉｍｅ技术ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，由此得以广泛应用ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ。ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ。该技术通过检采用实时荧光定量ＰＣＲ技术可以用于环境微生物群落结构与群落动态的研
究ＰＣＲ，可定量检测目标菌的含量和分布例，技术快速检测出目标细菌进而推算出目标细菌在环境样本中的丰度ＤＮＡ模板在总。ＳｋｏｖｈｕＤＮＡ等［３１］
运用ＦＱ－。杨秀丽等模板中的比
［３２］
通过ＦＱ－ＰＣＲ技术对疏勒河上游芨芨草根际微生物基因丰度的分析推算出了可培养细菌的多样性。
（３）变性凝胶电泳技术（ＤＧＧＥ）
变性凝胶电泳技术（ＤＧＧＥ）是一种能通过电泳方法将具
有同样长度但组成不同的ＤＮＡ片段分开的技术。段学军等
［３３］
通过ＤＧＧＥ技术研究了重金属镉对土壤微生物群落的影响。结果表明，不同浓度镉胁迫下土壤中的微生物群落有明显差异。ＤＧＧＥ可信度高，重复性好，快速，同时可以分析多个样品，相对较经济。不需要培养，直接从所研究的样品中抽提总ＤＮＡ，然后对１６ＳｒＲＮＡ基因的可变区进行ＰＣＲ扩增，扩增产物通过变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）进行分析，能检测到难以培养或不能培养的微生物，发现一些原来没有检测到的新的微生物种类。
但是ＤＧＧＥ受样品ＤＮＡ提取质量、ＰＣＲ结果的影响较大。另外，不同序列的ＤＮＡ片段在聚丙烯酰胺凝胶中也可以有相
［３４］
同的移动特性，因此，一个条带不一定就代表一个种。
便，已经被广泛地应用于土壤微生物群落分析。
然而，ＳＳＣＰ的重现性较差，易受电泳温度和凝胶浓度等条
［２８］
件的影响，对于３００ｂｐ以上的ＤＮＡ序列，分离效率低下。
为了使单链ＤＮＡ保持一定的稳定立体构象，ＳＳＣＰ应在较低温度下进行（一般１０～１５℃）。在没有冷却装置的电泳槽进行ＳＳＣＰ时，开始的５ｍｉｎ应用较高的电压（２５０Ｖ），以后用１００Ｖ左右电压进行电泳。胶的浓度一般为５％～６％，特殊情况再进行调整，胶的厚度小于１ｍｍ。解决了温度、电压、胶浓度等问题后ＳＳＣＰ图谱也会保持良好的重复性。为了提高单链ＤＮＡ的分离效率，可以在聚丙烯酰胺凝胶中加入化学交联剂如甘油或者聚乙二醇。为了提高ＤＮＡ的提取质量，可采用连续重复提取法［３５］
，在ＰＣＲ扩增土壤基因组时，ＰＣＲ引物的一端加上一个约３０～４０个碱基的ＧＣ夹子以保证扩增产物在被凝胶电泳分离时，不至于将双链ＤＮＡ完全熔解成单链。２畅２畅２ 基于ＰＣＲ的核酸技术
（１）限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）、末端限制性长度多态性（Ｔ－ＲＦＬＰ）和扩增核糖体ＤＮＡ限制性分析（ＡＲＤＡＲ）
限制性片段长度多态性是一种综合利用限制性内切酶和电泳技术对产物进行分析的方法。该方法的优点是所获得的谱带易于分析，不受菌株是否纯培养的干扰，不受宿主干扰，具有
特异性强［２８］
ＲＦＬＰＴ－ＲＦＬＰ，效率高等特点的原理。
能够更加准确的反的发展与完善，Ｔ和－ＲＦＬＰ的相同，只不过Ｔ－ＲＦＬＰ是ＲＦＬＰ多样性已被广泛的应用于研究各种土壤中的微生物群落结构和
映土壤中微生物的多ＲＦＬＰ克服了ＲＦＬＰ样性图谱复杂的缺点［３６］
。现在Ｔ－，
［３７－３８］
。
该方法也存在一些缺陷：在Ｔ－ＲＦＬＰ的峰值图上，一个峰代表的有可能不只是一个种；样品中的总ＤＮＡ的提取和限制性内切酶的选择是影响到分析结果的关键因素；随着ＤＮＡ片
段长度的增加，测序仪检测分辨率降低等［２９］
。
由于核糖体ＤＮＡ常常被用来作为基因标记，故ＲＦＬＰ也通
常被称作扩增核糖体ＤＮＡ限制性分析［２８］
。
ＱＣ），在操作过程中需要严格把握质量保证和质量控制（ＱＡ／（２）尽量做到排除各种可能发生的误差干扰随机扩增片段多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）。
技术
量少ＲＡＰＤ、灵敏度高技术继承了、容易检测等ＰＣＥ技术的众多优点。同时有其独特的优势：效率高、：样品用勿需知道模板ＤＮＡ任何序列信息，对其进行扩增，构建不同种、不同菌株的基因指纹图谱ＲＡＰＤ或其他技术技术无需，进而分析ＤＮＡ的多态性；鉴别力强；，实验周期短ＤＮＡ探针，，成本较低不涉及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，能在较短的时间内筛选
杂交，放射自显影大量样品［２７］
。
但是ＲＡＰＤ技术容易受到多种因素的影响。重复性不好也是该技术的主要问题。
要克服ＲＡＰＤ技术上存在的问题，取得较好的实验结果，在进行ＲＡＰＤ分析时，首先应建立一个稳定的反应体系，即对于同一个实验采用相同的条件。如Ｔａｑ酶等采用同一厂家生产的，最好是同一批次的。通用的反应体系适合于大多数研究材料，但对于某一材料并不一定是最适的。因此，应针对具体材料进行优化，以取得最佳实验结果。
（３）ＤＮＡ单链构象多态性（ＳＳＣＰ）图谱分析
单链构象多态性（ＳＳＣＰ）技术对３００ｂｐ的ＤＮＡ片断中的单碱基突变，可以达到９０％以上的检出率。该技术的优点是无需ＤＮＡ片断带ＧＣ夹和凝胶变性梯度的建设，故操作相对简２畅２畅３ 荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术
荧光原位杂交技术是结合了分子生物学和显微技术发展起来用于环境监测和鉴定不同的微生物个体，对环境微生物进行
分析的技术。Ｌｉｅｂｎｅｒ等［３９］
通过ＦＩＳＨ法发现永久冻土中存在极其多样的细菌群落，并且观察到拟杆菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）和放线菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）是优势菌群。ＦＩＳＨ技术使用快速、安全、特异性好，先后被广泛应用。
但是同时还有一些不足之处，由于某些物质本身具有荧光性，对结果会造成一定的干扰；ＦＩＳＨ要求土壤微生物基因必须要有很高的拷贝数，否则那些非优势微生物很难被检测出来。
但是，随着原位ＰＣＲ技术的开发和应用，上述问题已经被克服，通过在细胞内扩增目标基因片段然后用特异探针进行杂
交可以更加准确地评价土壤微生物多样性［２８］
。２畅２畅４ 核糖体间隔分析（ＲＩＳＡ）／自动核糖体间隔分析（ＡＲＩＳＡ的间隔区的长度多态性ＲＩＳＡ）
和ＡＲＩＳＡ是基于原核生物，用ＰＣＲ方法对该间隔区进行扩增１６Ｓ和２３ＳｒＤＮＡ基因之间，扩增产物用凝胶电泳分离并分析带谱，也可对ＤＮＡ带进行测序，从而获得更详细的信息。许多生物包括真核生物、原核生物，都含有高度重复的短的ＤＮＡ序列（也称为微卫星区），它们的长度在１～１０个碱基，在整个基因组中重复出现。根据进化的
速率，利用这些序列可以探测到种，甚至菌株的水平［４０］
。此方法用探针检测因环境条件改变而造成的微生物群落变化时非常有用。
缺点是ＲＡＰＤ技术受外界因素的干扰，如模板的质量、浓度、引物设计、ＰＣＲ循环数等，使得研究复杂的环境样品ＤＮＡ时重复性不太好。
要弥补该技术存在的不足，首先要解决ＤＮＡ提取过程的问题，根据文献［４１］的研究发现，反复冻融法所提取的ＤＮＡ能够最大程度的反应微生物的丰度。其次，通过单因子实验，依次对影Ｍｇ响ＰＣＲ产物品质的因素（模板浓度、引物浓度、２＋／ｄＮＴＰｓ的比例和浓度）进行研究。确定最优的反应体系，最大程度的减少对整个实验的影响。２畅２畅５ 环境基因组技术
环境基因组技术由于能有效地分析整个庞大而复杂的微生物基因组并空前的研究了基因组的异质性和进化性而成为新的迅速发展的领域。通过功能基因组技术发现了多种抗生素及活
性物质［４２－４４］
。该技术的优点是不需要通过序列分析来认识基因，并具有了解已知和未知功能的所有基因类型的潜能。
缺点就是许多基因在特定的寄主细菌中不能表达，异源性表达的不足仍然是从功能基因组分析中得到最大量信息的障碍。
需要改进的地方：一方面要克服异源表达的不足；另一个方面，要有效地筛选出稀有克隆。
２畅２畅６ 高通量测序技术
高通量测序技术是传统测序一次划时代的改变，也被称作下一代测序技术、深度测序技术。目前该技术在土壤微生物多样性的研究中应用很广泛。研究土壤微生物的物种多样性主要是通过对土壤中细菌、真菌、放线菌三大类群菌类的数目及其比例来描述采样点微生物的多样性，从而对整个区域土壤微生物的多样性进行探究。功能多样性的研究是通过高通量测序测得的微生物群落结构及组成和土壤的理化性质来了解微生物的
［４５］
功能及其多样性。Ｃａｍｐｂｅｌｌ研究发现，长期施肥明显降低了
［４６］
北极冻土带土壤微生物的多样性。Ｌｉｍ等通过对韩国黄海３个岛屿的土壤真菌多样性进行研究发现了多种未知的真菌。
［４７］
张彩霞等用高通量测序技术对祁连山土壤研究发现，不同海［４］ ＲａｆｅｄｚｉＥ，ＫｒｅｓｋＭ，ＫｕｓｅｌＫ．ＴｈｅＤＧＧＥｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄ１６ＳＲＮＡ
ｃｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｉｅｓａｎａｌｙｓｉｓａｓａｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｓｏｉｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｍ］．ＷｏｒｌｄｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂＣｏＩｎｃ．，２０１０：３４２．
［５］ ＬａｇｅｒｓｔｒｏｍＡ，ＮｉｌｓｓｏｎＭ．Ｃ，ＷａｒｄｌｅＤ．Ａ．Ｄｅｃｏｕｐｌｅｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｔｒｅｅ
ａｎｄｓｈｒｕｂｌｅａｆａｎｄｌｉｔｔｅｒｔｒａｉｔｖａｌｕｅｓｔｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｒｅｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎａｃｒｏｓｓａｎ［６］ ＧｅｒｍａｎＤ．Ｐ，ＣｈａｃｏｎＳ．Ｓ，ＡｌｌｉｓｉｏｎＳ．Ｄ．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄ
ｅｎｚｙｍｅａｌｌｏｃａｔｉｏｎｃａｎａｆｆｅｃｔｒａｔｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．［７］ ＭｏｒｅｎｏＬ．Ｉ，ＭｉｌｌｓＤ．Ｅ，ＦｅｔｓｃｈｅｒＪ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｍｐｌｉｃｏｎ
ｌｅｎｇｔｈｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙＰＣＲｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８４：３８８－３９３．
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃａｄａｖｅｒｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｌｏｇｙ，２０１１，９２：１４７１－１４８０．
ｉｓｌａｎｄａｒｅａｇｒａｄｉｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａｎｄｓｏｉｌ，２０１２，３２（１）：１－１５．
拔中占主导地位的微生物是变形菌门、酸杆菌门和放线菌门，同时发现与海拔相关的土壤性质的变化是影响土壤微生物结构变化的主要因素。该技术的优点是花费小，单位数据的成本非常低；准确度高；操作简单、速度快，不需要提前克隆以及图谱制作；可以获得大量克隆方法无法得到的微生物类群。
缺点是在测定一连串相同核苷酸时容易产生错误；测序会产生大量的数据，对信息学分析是个巨大的挑战。
3 展 望
目前，在土壤微生物群落结构多样性的研究方面已经取得
了重大成就。但是随着科学技术的进步和各种新方法新设备的问世，土壤微生物群落多样性的研究领域将会取得更多成果，以后该领域的研究工作应该集中在一下几个方面：
首先是技术、方法的不断创新。随着生物学的发展，尤其是最近几年，分子生物学和信息学的发展，多种新型的技术已被应用到土壤微生物多样性的研究中，同时也取得了瞩目的成效。但是由于各种原因每种方法都有其无法兼顾的地方，所以对研究技术和方法的进一步创新是今后工作中重要的一块。
其次是多种研究方法优势互补。目前，在土壤微生物多样性研究方面单一方法的应用和研究已经趋于成熟，今后要加强多种方法之间的优势互补，探讨不同研究方法获得的研究结果之间的异同，进行对比分析，以便能更加快速、准确地对土壤中微生物多样性进行全面的研究。
再次是更好地将科学研究成果应用到生产和社会实践中。现阶段，对此领域研究成果的应用主要集中在通过对土壤微生物多样性的研究来监测土壤环境方面。今后就要加大对微生物功能基因多样性方面的研究，进一步加强基因组和转录组方面的研究，特别是研究极端环境微生物多样性及其特殊功能基因，并将其应用到人类的生产和生活中去，为人类服务。同时，通过土壤微生物多样性及其与环境因子之间的关系的研究，进一步揭示微生物对环境的适应机制和影响机理，使其为生态环境保护和治理提供科学依据和方法指导，从而确定行之有效的生态环境保护和治理方案。
参考文献
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ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃａｒｂｏｎ，ｎｉｔｒｏｇｅｎｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｃｈａｎｇｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｅｄｏｂｉｏｌｏｇｉａｆｏｒｂｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ，２０１１，５４：３０９ｃｙｃｌｉｎｇｏｆ３２０．
－
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ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎ
１０广 州 化 工
ｗａｔｅｒ－ｓｔａｂｌｅａｇｇｒｅｇａｔｅｓｏｆｓｏｉｌｓｕｎｄｅｒｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌａｎｄｚｅｒｏｔｉｌｌａｇｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＳｏｉｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００１，１６：２５１－２６１．
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（上接第３页）
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第４２卷第２０期２０１４年１０月
广 州 化 工
Ｖｏｌ畅４２Ｎｏ畅２０
土壤微生物多样性研究的新进展倡
李旭东，徐莉娜，薛林贵
（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 ７３００７０）
摘 要：土壤微生物是土壤生态系统的一个重要组成部分，在维持整个土壤生态系统能量流动和物质循环中发挥着关键作
用，同时，土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构、功能和过程。因此，对土壤微生物多样性的研究有着重大意义。本文从
土壤微生物多样性的影响因素以及目前该领域研究所采用的研究方法等方面阐述了国内外土壤微生物多样性的研究现状，同时对各种研究方法的适用范围、优缺点等作了较为详细的分析、比较，并对该领域未来研究工作的重点方面作了展望。
关键词：微生物多样性；土壤；影响因素；研究方法
１＋３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－９６７７（２０１４）０２０－０００６－０５中图分类号：Ｑ９３８畅
New Research Progress on Soil Microbial Community Diversity
倡
LI Xu －dong ，XU Li －na ，XUE Lin －gui
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＬａｎｚｈｏｕＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧａｎｓｕＬａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）Abstract ：Ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｗａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐａｒｔｏｆｓｏｉｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈｐｌａｙｅｄａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｅｎｅｒｇｙｆｌｏｗｉｎｇａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｃｙｃｌｉｎｇｏｆｔｈｅｅｎｔｉｒｅｓｏｉｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍ畅Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｓｏｉｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍ畅Ｓｏｉｔｗａｓｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ畅Ｔｈｅａｄｖａｎｃｅｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙ畅Ｔｈｅｄｅｔａｉｌｅｄａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｅｖｅｒｙｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅａｌｓｏｍａｄｅ畅Ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔａｓｐｅｃｔｓｏｆｆｕｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ畅
Key words ：ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｓｏｉｌ；ｅｆｆｅｃｔｆａｃｔｏｒｓ；ｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄ
土壤中存在着种类丰富和数量及其庞大的微生物，到目前
［１］
为止，已经被描述出来的微生物大约有５０００种。但是由于培养技术和仪器设备的局限，可培养微生物只占土壤中全部微
［２］
生物的１％左右。作为土壤生态系统的一个重要组成部分，土壤微生物在维持整个土壤生态系统能量流动和物质循环中发
［３］
挥着关键作用。土壤微生物在种类和数量上都是最多的，而且它影响土壤生态系统的结构、功能和过程，是维持土壤生产
［４］
力的重要指标。土壤微生物扮演着主要分解者的角色。从植
［５］［６］［７］
物的凋落物、纤维素的分解，到动物尸体的分解，土壤
［８］
微生物都发挥着主要的作用。在污染土壤，原油泄漏等环境［９］
中，起到恢复生态环境的作用。其次，土壤微生物是物质和能量循环的重要成员，能够推动Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｓ等的循环。
近年来由于人口的增加、工农业生产的大力发展、自然资源的过度开发、环境污染的日益加剧以及外来物种的入侵，土壤微生物多样性受到了强烈的干扰和严重的破坏，许多土壤环境中微生物的多样性降低。所以土壤微生物多样性研究就显得格外重要。此外，微生物多样性研究是微生物生态学的重要研究内容之一，是微生物学发展进入新阶段的标志，更是生物多
［１０］
样性科学的重要进展。微生物多样性研究在环境监测、遗传研究、物种多样性保护以及新资源开发等方面都发挥着至关重
倡
要的作用。本文综述了土壤微生物多样性的影响因素及目前在土壤微生物多样性研究方面所采用的研究方法并进行比较，以期为进一步开展同类研究工作提供科学依据和方法指导。
［１１］
1 土壤微生物多样性的影响因素
1畅1 土 壤
土壤是一个非常复杂的生态系统，是由无数个拥有不同物化性质和独特环境条件的微小生境组成的。近年来大量实验都证明了土壤类型是土壤微生物群落结构和种群密度的主要影响
［１２］
因素。Ｓｅｓｓｉｔｓｃｈ等通过Ｔ－ＲＦＬＰ技术对长期施肥土壤中微生物多样性研究表明，微生物的群落结构与土壤颗粒之间有显
［１３］
著的相关性。土壤颗粒越小，微生物多样性越高。Ｓｍｉｔｈ等通过对五大细菌分枝的１６ＳｒＲＮＡ序列的分布，寻找微生物类群丰度同土壤营养状况之间的关系，分析结果表明，在可利用营养基质较高的土壤中，α－和γ－Proteobacteria 丰度较高；在营养状况较差或者存在大量不可利用基质的土壤中，Acidobacterium 比例升高。
1畅2 植 被
地上植被是土壤中细菌多样性的重要影响因子之一
［１４］
。地
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ：３１２６０１３５）；教育部长江学者和创新团队发展计划项目（Ｎｏ：ＩＲＴ０９６６）。
作者简介：李旭东（１９８８－），男，硕士研究生，主要从事环境微生物学的研究工作。通讯作者：薛林贵（１９６２－），男，教授，博士，主要从事环境微生物学的研究工作。
上植被通过影响土壤中的有机氮和有机碳、土壤水分、温度、通气性和ｐＨ值等来影响土壤微生物多样性。植被的存在有利于增加土壤微生物多样性和微生物生物量；反之，植被的破坏
［１５］
可能改变微生物组成并降低微生物多样性。Ｈａｃｋｌ等采用Ｔ－ＲＦＬＰ和１６ＳｒＲＮＡ分析澳大利亚六个天然森林土壤中真细菌群落结构，发现不同森林土壤之间细菌群落结构存在变化，在松树林土壤中，依照相对丰度优势真细菌类群依次为α－Proteobacterial （２０％）和Holophage ／Acidobacteri （１２％），而橡胶树林中真细菌类群依次为Holophage ／Acidobacteri （３５％），Verrucomicrobia （２４％）和α－Proteobacterial （２７％）。
1畅3 季节变化（温度，水分）
磷脂脂肪酸是构成活体细胞膜的重要组成部分，其含量在正常生理条件下相对稳定且具有特异性，因此ＰＬＦＡ可作为微
［２７］
生物群落标记分析物。细胞死亡后细胞膜水解同时释放
［２８］
ＰＬＦＡ，ＰＬＦＡ的总量可以用来表征微生物的生物量。因此可以用ＰＬＦＡ的变化来了解自然环境中微生物的种类组成和数量的变化。该方法不需要对微生物进行培养，可直接鉴定群落动态。
但是ＰＬＦＡ图谱分析法并不能反映一个单独的微生物种的情况，仅是反映群落结构的特性。而且其分析结果的准确性与微生物体内的ＰＬＦＡ是否完全提取、操作过程是否稳定等有很
［２９］
大的关系。
随着季节变化，土壤中的微生物多样性会随周围气候环境（温度和水分）变化而变化。温度和水分对土壤微生物多样性
的影响存在交互性，具有协同效应［１６］
。夏季温度高，植物代谢旺盛，植物根际分泌物会刺激微生物繁殖；秋季植物生长减缓或者停止，能利用植物凋落物的微生物在土壤中表现活跃；冬
季后，嗜冷和耐冷微生物丰度增加［１７］。Ｌｉｐｓｏｎ等［１８］
对高山冻土土壤细菌群落的研究结果表明，细菌群落结构组成具有季节性变化规律。因此可以用季节的概念来说明不同温度和水分对
微生物多样性和活性的影响［１９］
。
1畅4 管理方式
不同的土壤管理方式会影响土壤中微生物多样性。人们通过施用农药、施肥、改变土壤的耕作方式等因素人为的改变土
壤的理化性质，从而对土壤中微生物的分布产生影响［２０］
。农药（除草剂，杀虫剂等）的使用会改变土壤微生物群落结构，影
响其多样性，也会使土壤中微生物功能发生改变［２１］
。
施肥对土壤微生物多样性及活性的影响非常复杂，可能与肥料的种类、施用方式（施用量、长期施用或短期施用）、土
壤类型和利用方式等因素有关。Ｋａｍｍａ等［２２］
对肯尼亚一处施肥３２年的试验样地分析结果显示，无机肥对细菌多样性产生消极影响Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ，等有机肥（农家肥）对细菌多样性产生积极影响。
［２３］的实验结果表明，长期施用有机肥使得Ｇ＋／Ｇ－
和细菌／真菌的比例提高，细菌和真核微生物多样性受土壤有机碳和Ｃ／Ｎ比的影响。不同的耕作方式也会对微生物多样性产
生影响。Ｌｕｐｗａｙｉ等［２４］和Ｆｅｎｇ等［２５］
通过实验表明，免耕土壤中微生物的多样性高于使用传统耕种方式的土壤中。原因是传统耕种致使土壤团聚体的破裂和有机质的消耗。
2 土壤微生物多样性研究方法
2畅1 基于生化技术的方法
２畅１畅１ 平板培养法
传统的平板培养方法就是根据目标微生物选择相应的专性培养基进行分离培养，然后通过各种微生物的生理生化特性、
外观形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型［２６］
。此方法廉价、易于操作，可以提供活的、异养类型的种群信息。
但是该方法也存在着许多不足之处。首先，土壤中的可培养微生物只占微生物总数的１％左右。其次，富集培养方法存在着高度的选择性。所以，实验室的培养条件不可能完全满足微生物生长所需的温度、ｐＨ、通气等条件，不适应实验室条件的微生物就无法培养。
因此，这种传统的平板培养方法只能作为一种辅助工具，需要结合现代生物技术方法才能更客观而全面地反应微生物群落结构的真实信息。２畅１畅２ 磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡ）图谱分析法
对多个环境微生物样品分析而言，先用全细胞脂肪酸甲酯谱图法（ＷＣＦＡ－ＦＡＭＥｓ）预先筛选再用ＰＬＦＡ法进行分析是提高效率的较佳选择ＧＣ。ＰＬＦＡ２畅１畅－３ ＭＳ的测定方法经过不断完善，采用
［２８］
ＢＩＯＬＯＧ法会更加准确、方便和快捷。会产生自由电子ＢＩＯＬＯＧ方法的测定原理微量分析法
，与四唑盐染料发生氧化还原反应：微生物在对碳源利用的过程中，呈现不同的颜色。颜色的变化可以反映微生物对碳源的利用情况。微生物群落结构差异，每个孔的颜色变化就会不同，这样就可以知道不同样点微生物多样性的差异。
然而，ＢＩＯＬＯＧ系统仅限于检测那些可培养、能迅速生长的微生物。检测结果并不能完全代表原位的代谢多样性。另外，样本处理、培养条件和微平板应用类型等都会给微生物多
样性评价带来误差［３０］
。
根据测试对象的特点（例如ｐＨ，碳源利用类型及利用能力）改进ＢＩＯＬＯＧ体系，并且研究更好的指示剂来代替红四氮唑（ＴＴＣ）。
2畅2 基于分子生物学技术的方法
２畅２畅１ 基于１６ＳｒＲＮＡ基因技术
Ａｐｐｒｏａｃｈ（１）基于ＰＣＲ的测序技术（ＴｈｅＰＣＲ－Ｃｌｏｎｅ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ将微生物土样制成悬液）
，用微孔过滤法或其他方法聚集微生物细胞后提取ＤＮＡ作为模板，设计引物扩增１６ＳｒＲＮＡ基因，将ＰＣＲ产物连接克隆载体建立克隆文库，进行基因测序。将测得序列与基因库内已知序列进行比对，分析。最后进行微生物多样性等的鉴定。该方法实验周期短，准确性高，在微生物多样性研究中有着广泛的应用。
但是实验的准确性与ＤＮＡ的提取程度有直接关系，也就是受提取工艺及方法的影响较大。
不过现在有多种试剂盒可以解决这个问题。（２）实时荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）
１９９６年美国ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出了成熟的实时荧光定量ｒｅａｃｔｉｏｎ测ＰＣＲ，ＰＣＲ产物中荧光讯号强度来达到定量的目的ＦＱ（－ｒｅａｌＰＣＲ－）ｔｉｍｅ技术ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，由此得以广泛应用ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ。ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ。该技术通过检采用实时荧光定量ＰＣＲ技术可以用于环境微生物群落结构与群落动态的研
究ＰＣＲ，可定量检测目标菌的含量和分布例，技术快速检测出目标细菌进而推算出目标细菌在环境样本中的丰度ＤＮＡ模板在总。ＳｋｏｖｈｕＤＮＡ等［３１］
运用ＦＱ－。杨秀丽等模板中的比
［３２］
通过ＦＱ－ＰＣＲ技术对疏勒河上游芨芨草根际微生物基因丰度的分析推算出了可培养细菌的多样性。
（３）变性凝胶电泳技术（ＤＧＧＥ）
变性凝胶电泳技术（ＤＧＧＥ）是一种能通过电泳方法将具
有同样长度但组成不同的ＤＮＡ片段分开的技术。段学军等
［３３］
通过ＤＧＧＥ技术研究了重金属镉对土壤微生物群落的影响。结果表明，不同浓度镉胁迫下土壤中的微生物群落有明显差异。ＤＧＧＥ可信度高，重复性好，快速，同时可以分析多个样品，相对较经济。不需要培养，直接从所研究的样品中抽提总ＤＮＡ，然后对１６ＳｒＲＮＡ基因的可变区进行ＰＣＲ扩增，扩增产物通过变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）进行分析，能检测到难以培养或不能培养的微生物，发现一些原来没有检测到的新的微生物种类。
但是ＤＧＧＥ受样品ＤＮＡ提取质量、ＰＣＲ结果的影响较大。另外，不同序列的ＤＮＡ片段在聚丙烯酰胺凝胶中也可以有相
［３４］
同的移动特性，因此，一个条带不一定就代表一个种。
便，已经被广泛地应用于土壤微生物群落分析。
然而，ＳＳＣＰ的重现性较差，易受电泳温度和凝胶浓度等条
［２８］
件的影响，对于３００ｂｐ以上的ＤＮＡ序列，分离效率低下。
为了使单链ＤＮＡ保持一定的稳定立体构象，ＳＳＣＰ应在较低温度下进行（一般１０～１５℃）。在没有冷却装置的电泳槽进行ＳＳＣＰ时，开始的５ｍｉｎ应用较高的电压（２５０Ｖ），以后用１００Ｖ左右电压进行电泳。胶的浓度一般为５％～６％，特殊情况再进行调整，胶的厚度小于１ｍｍ。解决了温度、电压、胶浓度等问题后ＳＳＣＰ图谱也会保持良好的重复性。为了提高单链ＤＮＡ的分离效率，可以在聚丙烯酰胺凝胶中加入化学交联剂如甘油或者聚乙二醇。为了提高ＤＮＡ的提取质量，可采用连续重复提取法［３５］
，在ＰＣＲ扩增土壤基因组时，ＰＣＲ引物的一端加上一个约３０～４０个碱基的ＧＣ夹子以保证扩增产物在被凝胶电泳分离时，不至于将双链ＤＮＡ完全熔解成单链。２畅２畅２ 基于ＰＣＲ的核酸技术
（１）限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）、末端限制性长度多态性（Ｔ－ＲＦＬＰ）和扩增核糖体ＤＮＡ限制性分析（ＡＲＤＡＲ）
限制性片段长度多态性是一种综合利用限制性内切酶和电泳技术对产物进行分析的方法。该方法的优点是所获得的谱带易于分析，不受菌株是否纯培养的干扰，不受宿主干扰，具有
特异性强［２８］
ＲＦＬＰＴ－ＲＦＬＰ，效率高等特点的原理。
能够更加准确的反的发展与完善，Ｔ和－ＲＦＬＰ的相同，只不过Ｔ－ＲＦＬＰ是ＲＦＬＰ多样性已被广泛的应用于研究各种土壤中的微生物群落结构和
映土壤中微生物的多ＲＦＬＰ克服了ＲＦＬＰ样性图谱复杂的缺点［３６］
。现在Ｔ－，
［３７－３８］
。
该方法也存在一些缺陷：在Ｔ－ＲＦＬＰ的峰值图上，一个峰代表的有可能不只是一个种；样品中的总ＤＮＡ的提取和限制性内切酶的选择是影响到分析结果的关键因素；随着ＤＮＡ片
段长度的增加，测序仪检测分辨率降低等［２９］
。
由于核糖体ＤＮＡ常常被用来作为基因标记，故ＲＦＬＰ也通
常被称作扩增核糖体ＤＮＡ限制性分析［２８］
。
ＱＣ），在操作过程中需要严格把握质量保证和质量控制（ＱＡ／（２）尽量做到排除各种可能发生的误差干扰随机扩增片段多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）。
技术
量少ＲＡＰＤ、灵敏度高技术继承了、容易检测等ＰＣＥ技术的众多优点。同时有其独特的优势：效率高、：样品用勿需知道模板ＤＮＡ任何序列信息，对其进行扩增，构建不同种、不同菌株的基因指纹图谱ＲＡＰＤ或其他技术技术无需，进而分析ＤＮＡ的多态性；鉴别力强；，实验周期短ＤＮＡ探针，，成本较低不涉及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，能在较短的时间内筛选
杂交，放射自显影大量样品［２７］
。
但是ＲＡＰＤ技术容易受到多种因素的影响。重复性不好也是该技术的主要问题。
要克服ＲＡＰＤ技术上存在的问题，取得较好的实验结果，在进行ＲＡＰＤ分析时，首先应建立一个稳定的反应体系，即对于同一个实验采用相同的条件。如Ｔａｑ酶等采用同一厂家生产的，最好是同一批次的。通用的反应体系适合于大多数研究材料，但对于某一材料并不一定是最适的。因此，应针对具体材料进行优化，以取得最佳实验结果。
（３）ＤＮＡ单链构象多态性（ＳＳＣＰ）图谱分析
单链构象多态性（ＳＳＣＰ）技术对３００ｂｐ的ＤＮＡ片断中的单碱基突变，可以达到９０％以上的检出率。该技术的优点是无需ＤＮＡ片断带ＧＣ夹和凝胶变性梯度的建设，故操作相对简２畅２畅３ 荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）技术
荧光原位杂交技术是结合了分子生物学和显微技术发展起来用于环境监测和鉴定不同的微生物个体，对环境微生物进行
分析的技术。Ｌｉｅｂｎｅｒ等［３９］
通过ＦＩＳＨ法发现永久冻土中存在极其多样的细菌群落，并且观察到拟杆菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）和放线菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）是优势菌群。ＦＩＳＨ技术使用快速、安全、特异性好，先后被广泛应用。
但是同时还有一些不足之处，由于某些物质本身具有荧光性，对结果会造成一定的干扰；ＦＩＳＨ要求土壤微生物基因必须要有很高的拷贝数，否则那些非优势微生物很难被检测出来。
但是，随着原位ＰＣＲ技术的开发和应用，上述问题已经被克服，通过在细胞内扩增目标基因片段然后用特异探针进行杂
交可以更加准确地评价土壤微生物多样性［２８］
。２畅２畅４ 核糖体间隔分析（ＲＩＳＡ）／自动核糖体间隔分析（ＡＲＩＳＡ的间隔区的长度多态性ＲＩＳＡ）
和ＡＲＩＳＡ是基于原核生物，用ＰＣＲ方法对该间隔区进行扩增１６Ｓ和２３ＳｒＤＮＡ基因之间，扩增产物用凝胶电泳分离并分析带谱，也可对ＤＮＡ带进行测序，从而获得更详细的信息。许多生物包括真核生物、原核生物，都含有高度重复的短的ＤＮＡ序列（也称为微卫星区），它们的长度在１～１０个碱基，在整个基因组中重复出现。根据进化的
速率，利用这些序列可以探测到种，甚至菌株的水平［４０］
。此方法用探针检测因环境条件改变而造成的微生物群落变化时非常有用。
缺点是ＲＡＰＤ技术受外界因素的干扰，如模板的质量、浓度、引物设计、ＰＣＲ循环数等，使得研究复杂的环境样品ＤＮＡ时重复性不太好。
要弥补该技术存在的不足，首先要解决ＤＮＡ提取过程的问题，根据文献［４１］的研究发现，反复冻融法所提取的ＤＮＡ能够最大程度的反应微生物的丰度。其次，通过单因子实验，依次对影Ｍｇ响ＰＣＲ产物品质的因素（模板浓度、引物浓度、２＋／ｄＮＴＰｓ的比例和浓度）进行研究。确定最优的反应体系，最大程度的减少对整个实验的影响。２畅２畅５ 环境基因组技术
环境基因组技术由于能有效地分析整个庞大而复杂的微生物基因组并空前的研究了基因组的异质性和进化性而成为新的迅速发展的领域。通过功能基因组技术发现了多种抗生素及活
性物质［４２－４４］
。该技术的优点是不需要通过序列分析来认识基因，并具有了解已知和未知功能的所有基因类型的潜能。
缺点就是许多基因在特定的寄主细菌中不能表达，异源性表达的不足仍然是从功能基因组分析中得到最大量信息的障碍。
需要改进的地方：一方面要克服异源表达的不足；另一个方面，要有效地筛选出稀有克隆。
２畅２畅６ 高通量测序技术
高通量测序技术是传统测序一次划时代的改变，也被称作下一代测序技术、深度测序技术。目前该技术在土壤微生物多样性的研究中应用很广泛。研究土壤微生物的物种多样性主要是通过对土壤中细菌、真菌、放线菌三大类群菌类的数目及其比例来描述采样点微生物的多样性，从而对整个区域土壤微生物的多样性进行探究。功能多样性的研究是通过高通量测序测得的微生物群落结构及组成和土壤的理化性质来了解微生物的
［４５］
功能及其多样性。Ｃａｍｐｂｅｌｌ研究发现，长期施肥明显降低了
［４６］
北极冻土带土壤微生物的多样性。Ｌｉｍ等通过对韩国黄海３个岛屿的土壤真菌多样性进行研究发现了多种未知的真菌。
［４７］
张彩霞等用高通量测序技术对祁连山土壤研究发现，不同海［４］ ＲａｆｅｄｚｉＥ，ＫｒｅｓｋＭ，ＫｕｓｅｌＫ．ＴｈｅＤＧＧＥｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄ１６ＳＲＮＡ
ｃｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｉｅｓａｎａｌｙｓｉｓａｓａｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｓｏｉｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｍ］．ＷｏｒｌｄｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂＣｏＩｎｃ．，２０１０：３４２．
［５］ ＬａｇｅｒｓｔｒｏｍＡ，ＮｉｌｓｓｏｎＭ．Ｃ，ＷａｒｄｌｅＤ．Ａ．Ｄｅｃｏｕｐｌｅｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｔｒｅｅ
ａｎｄｓｈｒｕｂｌｅａｆａｎｄｌｉｔｔｅｒｔｒａｉｔｖａｌｕｅｓｔｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｒｅｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎａｃｒｏｓｓａｎ［６］ ＧｅｒｍａｎＤ．Ｐ，ＣｈａｃｏｎＳ．Ｓ，ＡｌｌｉｓｉｏｎＳ．Ｄ．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄ
ｅｎｚｙｍｅａｌｌｏｃａｔｉｏｎｃａｎａｆｆｅｃｔｒａｔｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．［７］ ＭｏｒｅｎｏＬ．Ｉ，ＭｉｌｌｓＤ．Ｅ，ＦｅｔｓｃｈｅｒＪ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｍｐｌｉｃｏｎ
ｌｅｎｇｔｈｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙＰＣＲｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８４：３８８－３９３．
ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃａｄａｖｅｒｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｌｏｇｙ，２０１１，９２：１４７１－１４８０．
ｉｓｌａｎｄａｒｅａｇｒａｄｉｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａｎｄｓｏｉｌ，２０１２，３２（１）：１－１５．
拔中占主导地位的微生物是变形菌门、酸杆菌门和放线菌门，同时发现与海拔相关的土壤性质的变化是影响土壤微生物结构变化的主要因素。该技术的优点是花费小，单位数据的成本非常低；准确度高；操作简单、速度快，不需要提前克隆以及图谱制作；可以获得大量克隆方法无法得到的微生物类群。
缺点是在测定一连串相同核苷酸时容易产生错误；测序会产生大量的数据，对信息学分析是个巨大的挑战。
3 展 望
目前，在土壤微生物群落结构多样性的研究方面已经取得
了重大成就。但是随着科学技术的进步和各种新方法新设备的问世，土壤微生物群落多样性的研究领域将会取得更多成果，以后该领域的研究工作应该集中在一下几个方面：
首先是技术、方法的不断创新。随着生物学的发展，尤其是最近几年，分子生物学和信息学的发展，多种新型的技术已被应用到土壤微生物多样性的研究中，同时也取得了瞩目的成效。但是由于各种原因每种方法都有其无法兼顾的地方，所以对研究技术和方法的进一步创新是今后工作中重要的一块。
其次是多种研究方法优势互补。目前，在土壤微生物多样性研究方面单一方法的应用和研究已经趋于成熟，今后要加强多种方法之间的优势互补，探讨不同研究方法获得的研究结果之间的异同，进行对比分析，以便能更加快速、准确地对土壤中微生物多样性进行全面的研究。
再次是更好地将科学研究成果应用到生产和社会实践中。现阶段，对此领域研究成果的应用主要集中在通过对土壤微生物多样性的研究来监测土壤环境方面。今后就要加大对微生物功能基因多样性方面的研究，进一步加强基因组和转录组方面的研究，特别是研究极端环境微生物多样性及其特殊功能基因，并将其应用到人类的生产和生活中去，为人类服务。同时，通过土壤微生物多样性及其与环境因子之间的关系的研究，进一步揭示微生物对环境的适应机制和影响机理，使其为生态环境保护和治理提供科学依据和方法指导，从而确定行之有效的生态环境保护和治理方案。
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ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｒｅｓｅａｒｃｈ［１８］ＬｉｐｓｏｎＤ．Ａ，ＳｃｈｍｉｄｔＳ．Ｋ．Ｓｅａｓｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎａｎａｌｐｉｎｅｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｙＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｔｈｅＣｏｌｏｒａｄｏ，２００４，７０：２８６７ＲｏｃｋｙＭｏｕｎｔａｉｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄ［１９］ＰａｐａｔｈｅｏｄｏｒｏｕＥ．Ｍ，ＡｒｇｙｒｏｐｏｕｌｏｕＭ．Ｄ，Ｓｔａｍｏｕ－２８７９．Ｇ．Ｐ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆ
ｌａｒｇｅｂａｃｔｅｒｉａｌ－ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｍａｌｌ－ｓｃａｌｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｎｄｉｎｔｈｅｓｏｉｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆａｎｄｂａｃｔｅｒｉｖｏｒｏｕｓｍｏｉｓｔｕｒｅｏｎ［２０］ｎｅｍａｔｏｄｅｓＫｉｒｋＪ．Ｌ，［ＪＢｅａｕｄｅｔｔｅ］．ＡｐｐｌｉｅｄＬ．ＳｏｉｌＡ，ＥｃｏｌｏｇｙＨａｒｔＭ，２００４，２５：３７，ｅｔａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ－４９．
ｏｆｓｔｕｄｙｉｎｇｓｏｉｌ
１６９ｍｉｃｒｏｂｉａｌ－１８８．
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［２２］ＫａｍｍａＭ，ＭｂｕｒｕＨ，ＢｌａｎｃｈａｒｔＥ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｇａｎｉｃａｎｄ
ｉｎｏｒｇａｎｉｃｔｈｅＫａｂｅｔｅｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｏｎｔｒｉａｌｓｏｉｌ，ｂａｃｔｅｒｉａｌＫｅｎｙａ［Ｊａｎｄ］．Ｂｉｏｌｏｇｙｆｕｎｇａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｎｄｆｅｒｔｉｌｉｔｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｓｏｉｌｓｉｎ２０１１，４７：３１５－３２１．
，［２３］ＭａｒｓｃｈｎｅｒＰ，ＹａｎｇＣ．Ｈ，ＬｉｅｂｅｒｅｉＲ，ｅｔａｌ．Ｓｏｉｌａｎｄｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｅｆｆｅｃｔｓＢｉｏｌｏｇｙｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，２００１，３３：ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ１４３７ｉｎｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ［２４］ＬｕｐｗａｙｉＮ．Ｚ，ＡｒｓｈａｄＭ．Ａ，ＲｉｃｅＷ．Ａ，－ｅｔ１４４５．
ａｌ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎ
１０广 州 化 工
ｗａｔｅｒ－ｓｔａｂｌｅａｇｇｒｅｇａｔｅｓｏｆｓｏｉｌｓｕｎｄｅｒｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌａｎｄｚｅｒｏｔｉｌｌａｇｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＳｏｉｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００１，１６：２５１－２６１．
ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆ
ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ
２０１４年１０月
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ｉｎ
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