斑点杂交实验
【实验原理】用的高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。
【实验步骤】
1．处理：将尼龙膜浸泡于20×SSC 中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）
2．变性：将待测DNA 样品（HCV 经RT-PCR 扩增产物；HBV 的PCR 扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL ）置于PCR 仪中100℃加热10min ，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min 。
（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上）
【原理】 使DNA 样品变性，即双链DNA →单链DNA 。
3．点样：将上述变性后的样品各2μL 点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。
【原理】 使样品中的DNA 与膜结合牢固。
4．预杂交：将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。用1000μL 加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL 全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL 预杂交液不足，可适当补加。除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min 。
【原理】 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA 结合位点。
5．杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。 （已准备好）
6．杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL ，除去气泡，封口。置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。
7．洗膜：（1）回收杂交液；
（2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min ；
（3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min 。
【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。
8. 封闭：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL BufferⅡ中，室温作用30-60min 。
【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。
（在此阶段末期，准备下一步的抗体稀释。稀释方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL Buffer Ⅱ后轻轻混匀，4℃ 可保存12h 。）
9. 酶联抗体结合：将杂交膜封入一个新的杂交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ Buffer Ⅱ中室温作用30min ，经常摇动，使酶联抗体与地高辛结合。
10. 洗膜：（1）取出膜，将膜放入含有30mL BufferⅠ的培养皿中，洗膜两次，
每次15min 。
【原理】洗去未结合的酶联抗体。
（2）取出膜，将膜放入含有20mL BufferⅢ的培养皿中平衡2min 。
11．显色：（1）将45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL Buffer
Ⅲ中，显色液必需现配现用！
（2）在10mL 新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时，常在12h 内完成显色反应。
斑点杂交实验
【实验原理】用的高辛标记的HCV RNA探针检测HCV RT-PCR产物。
【实验步骤】
1．处理：将尼龙膜浸泡于20×SSC 中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30 min。（将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作）
2．变性：将待测DNA 样品（HCV 经RT-PCR 扩增产物；HBV 的PCR 扩增产物作为阴性对照，每组两种样品各10μL ）置于PCR 仪中100℃加热10min ，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min 。
（每一排共三组的样品点在同一张尼龙膜上）
【原理】 使DNA 样品变性，即双链DNA →单链DNA 。
3．点样：将上述变性后的样品各2μL 点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30 min。
【原理】 使样品中的DNA 与膜结合牢固。
4．预杂交：将杂交膜封入杂交袋中（每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中），做好剪角标记（勿过大）。用1000μL 加样器，加入预杂交液（Dig Easy Hyb），每组5mL 全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5mL 预杂交液不足，可适当补加。除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min 。
【原理】 封闭杂交膜上多余的非特异性DNA 结合位点。
5．杂交液制备：用预杂交液将探针按100ng/mL浓度稀释，即为杂交液。 （已准备好）
6．杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3mL ，除去气泡，封口。置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。
7．洗膜：（1）回收杂交液；
（2）室温下，用2×wash solution洗膜两次，每次5min ；
（3）将0.1×wash solution预热到50℃洗膜两次，每次15min 。
【原理】洗去未结合的探针，否则会导致过高的本底。
8. 封闭：取出膜，在含有30mL BufferⅠ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mL BufferⅡ中，室温作用30-60min 。
【原理】封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点。
（在此阶段末期，准备下一步的抗体稀释。稀释方法：加1μL Anti-DIG-AP到10mL Buffer Ⅱ后轻轻混匀，4℃ 可保存12h 。）
9. 酶联抗体结合：将杂交膜封入一个新的杂交袋中，加入3mL Anti-DIG-AP/ Buffer Ⅱ中室温作用30min ，经常摇动，使酶联抗体与地高辛结合。
10. 洗膜：（1）取出膜，将膜放入含有30mL BufferⅠ的培养皿中，洗膜两次，
每次15min 。
【原理】洗去未结合的酶联抗体。
（2）取出膜，将膜放入含有20mL BufferⅢ的培养皿中平衡2min 。
11．显色：（1）将45μL NBT solution和35μL X-Phosphate加入到10mL Buffer
Ⅲ中，显色液必需现配现用！
（2）在10mL 新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时，常在12h 内完成显色反应。