09 阻断白色念珠菌粘附口腔粘膜上皮细胞的实验研究

文章编号:10052376X (2001) 0620164202

【口腔微生态学】

阻断白色念珠菌粘附口腔粘膜上皮细胞的实验研究

刘为国, 伦永志, 黄　敏, 徐曼丽

(1. 大连大学医学院, 辽宁大连　116001; 2. 大连医科大学, 辽宁大连　116027)

　　摘要　白色念珠菌的粘附与其表面甘露糖结构有关, 为探讨阻断粘附的方法, 我们采用体外法测定其

对口腔上皮细胞的粘附数量, 显示:白色念珠菌粘附感染上皮细胞后, 甘露糖可以在一定程度上减少粘附, 绿慕安及刀豆素A 可以有效地减少粘附。提示甘露糖及绿慕安可能有助于治疗白色念珠菌感染。关键词:白色念珠菌; 粘附; 口腔上皮细胞1

中图分类号:R 37914　　　　文献标识码:A

EXPER I M ENTAL STUDY OF INH IB IT ING

CAN S AD HERE T O HU M AN EP ITHEL IU M

L I U W ei 2guo , LU N Yong 2zh i , HU AN G M in , et a l 1

THE CAD A IB I -

(M ed ica l colleg e of d a lian un iversity , D a lian Abstract :M anno se 2con tain of s cou ld m ediate the adherence of th is yeasts to hum ib iting adherence , w e m easu red the quan 2tity of cells in vitro . T he resu lts show ed that m anno se can inh ib 2ited , 2M (P seudomonas aerugino sa w ith M anno se Sen sitive hem agglu tinati on P ili ) vaccin A can inh ib ited adherence effectively after Cadida alb ican s adhered to ep ithelial . T herefo re m anno se and PA 2. cells M SHA vaccin cou ld p reven t adhesi on and infecti on s Key words :Cad id a a lbicans ; hum an ep ithelial cells ; adherence 1

　　白色念珠菌是真菌中最常见的致病菌, 据认为25%～

50%的健康人, 其口腔、消化道、阴道可有白色念珠菌, 但并不发病, 当宿主防御机能降低以后, 这种非致病性念珠菌转化为致病性菌。Sandin RL 等研究刀豆素A 对白色念球菌粘附的抑制作用可以被甘露糖所抑制, 因而甘露糖介导白色念珠菌粘附[1]。我们通过刀豆素A 与白色念珠菌的结合实验证明:白色念珠菌表面甘露糖结构是其表面识别配体, 与Sandin RL 等的结论一致。为进一步研究抑制粘附打下了基础。

本研究采用白色念珠菌标准株, 以人口腔粘膜上皮细胞进行粘附实验, 并测定糖类等受体物质在不同浓度下, 不同条件下对粘附作用的影响。1　材料与方法1. 1　材料

1. 1. 1　菌种　白色念珠菌标准株, 由中国生物制品鉴定所提供。

1. 1. 2　人口腔粘膜上皮细胞　取自健康志愿者口腔粘膜。志愿者口腔状况良好, 一周内无应用药物史。

1. 1. 3　主要试剂　D 2甘露糖:分析纯, 上海试剂二厂; D 2葡萄糖:分析纯, 沈阳市试剂一厂; D 2半乳糖:分析纯, 上海试剂二厂; L 2岩藻糖:分析纯, SERVA 公司; D 2果糖:分析纯, 上海试剂二厂; 蔗糖:分析纯, 哈尔滨市化工试剂厂; 乳糖:分析纯, 麦芽糖:分析纯, 中国科学院上海生物化学研究所; 绿慕安(绿脓杆菌M SHA 菌毛株免疫制剂) :广东宝舜集团公司; 刀豆素A :分析纯, Sigm a 公司。

1. 1. 4　仪器及器材　分析天平:Sarto ri ou s 瑞士; LD 422A 离心机:北京医用离心机厂; 水浴恒温振荡器(SHA 2C 型) :江苏金坛市医疗仪器厂; 吸液器(100Λl ) :上海医械专机厂。1. 2　方法

收稿日期:2001202226

1. 2. 1　白色念珠菌菌悬液的制备　白色念珠菌接种至新鲜的沙堡氏固体培养基, 37℃培养18h , 收集菌细胞, 用pH 7. 4的hank’s平衡盐溶液离心洗涤3次, 用血细胞计数板调整菌细胞浓度为1×107 m l 。

1. 2. 2　颊粘膜上皮细胞(BEC ) 悬液的制备　用无菌筷子轻刮健康志愿者双侧颊粘膜, 用pH 7. 4的hank’s平衡盐溶液离心洗涤3次, 用血细胞计数板调整BEC 浓度至1×105 m l 。

1. 2. 3　试剂的制备　前述糖类制备成1%、0. 5%、0. 1%三个浓度, 刀豆素A 制备成500、100及10Λg m l 3个浓度, 绿慕安浓度为18亿 m l , 分成3组:一组:1%糖类, 500Λg m l 刀豆素, 18亿 m l 绿慕安; 二组:0. 5%糖类, 100Λg m l 刀豆素; 三组:0. 1%糖类, 10Λg m l 刀豆素。1. 2. 4　粘附实验

1. 2. 4. 1　白色念珠菌粘附上皮细胞实验(对照组)

白色念珠菌与上皮细胞悬液各0. 1m l 混合, 37℃水浴恒温振荡器中, 每15m in 振一次, 1h 后取出, 离心洗涤3次(每次离心力为150×g , 3m in ) , 弃上清液, 沉淀物涂片, 风干、无水乙醇固定, 革兰染色, 镜下随机计数100个上皮细胞, 算出每个口腔上皮细胞粘附白色念珠菌数。

1. 2. 4. 2　上皮细胞与白色念珠菌作用后, 再加入受体物质(绿慕安或某一浓度的糖类或刀豆素) 作用1h 及2h 对粘附的影响, 方法同上。

1. 3　统计方法　统计三次实验, 每次实验两次重复计数的结果, 白色念珠菌对上皮细胞的粘附率为均值±标准差。经t 检验与对照组比较, P 值小于0. 01者为有显著性差异。2　结　果

2. 1　白色念珠菌粘附上皮细胞后, 再加入受体物质分别作用1h , 2h 对粘附作用的影响, 见表1。

表1　白色念珠菌粘附上皮细胞后, 加入受体物质对粘附作用的影响

粘附数(±S )

受体物质

1组

2组

3组

D 2甘露糖18±114+1612±112+1917±019+1718±110+2119±1142117±110D 2葡萄糖D 2半乳糖L 2岩藻糖D 2果糖

2118±1122116±11022±1132213±1142214±1102211±0192119±1122115±0192117±0192118±11022±1102213±1122116±0192117±1102311±1122218±1132217±0192219±1102119±1102213±1102215±1102312±0192216±1122216±1112214±1112215±01823±1122219±1142312±0192316±0192218±0192217±1112313±1102315±1112411±0192412±1102314±1102315±1122317±0192318±0192319±1112316±1121119±112+1018±110+1412±111+1319±112+1519±112+1518±110+1415±111+1317±019+2215±110

蔗糖乳糖麦芽糖刀豆素A 绿慕安对照组

　　注:P

表中显示:白色念珠菌粘附上皮细胞后,

素A 可以有效地减少粘附,

D 2少粘附, 著。, 但没有显著性差异。

图1　白色念珠菌粘附上皮细胞对照组×400

212　形态学观察　显微镜下所见:经革兰染色后, 颊粘膜上皮细胞染成红色, 白色念珠菌染成紫色。照片1为白色念珠菌粘附感染上皮细胞, 见白色念珠菌成簇聚集在上皮细胞的细胞膜上。照片2为绿慕安预处理白色念珠菌后, 白色念珠菌分散在上皮细胞周围, 未发生粘附。照片3为刀豆素A 预作用于白色念珠菌后, 白色念珠菌未发生粘附。3　讨　论

　关于糖类物质对白色念珠菌粘附的影响, 各国学者作了很多工作, 把白色念珠菌的单一菌株培养在一种富含不同糖类(以作碳源) 的培养基中, 如含500mM 的半乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖, 便能粘附于颊粘膜上皮细胞。生长在加半乳, 依次使其粘附力降低的是加蔗糖、[2]。白色念珠菌N 2乙酰葡糖胺D 2D 2半乳糖

]

, Α2甲基2D 2甘露糖苷所抑制, 却能被岩藻糖和L 2岩藻糖所抑制, 葡萄糖则能增加粘附[4]。这些实验产生的差异可能与白色念珠对细胞进行粘附的配体—受体识别有关。宿主细胞的膜受体根据部位不同, 具体的化合物也不同:口腔粘膜是纤维粘连蛋白、酯质、甘露糖和N —乙酰葡糖胺; 肠道粘膜为粘蛋白; 阴道粘膜为岩藻糖。因而, 糖类对白色念珠菌表面结构的封闭作用也不同, 对粘附的影响也会产生差异。

实验结果显示:当白色念珠菌粘附口腔上皮细胞后, 再加入受体物质则只有D —甘露糖、绿慕安及刀豆素A 可以产生作用, D 2甘露糖与白色念珠菌竞争上皮细胞上的粘附受体而发挥作用, 绿幕安及刀豆素A 通过与白色念珠菌的凝集作用而减少其对上皮细胞的粘附。延长作用时间, 只能部分地减少粘附。而其他糖类对已经粘附到上皮细胞的白色念珠菌几乎没有影响。

绿慕安是以绿脓杆菌菌毛株制成的免疫制剂, 该绿脓杆菌为甘露糖敏感血凝菌毛株[5]。因其M SHA 周身性复合菌毛的高效跨菌属的免疫原性, 免疫人体后能广泛封闭复合性糖蛋白和糖脂类受体[6]。本实验证实其有抗白色念珠菌粘附上皮细胞的功效。同时, 绿慕安与白色念珠菌的凝集, 也间接地证实了其甘露糖敏感血凝的特点。

综上所述, 甘露糖及甘露糖识别物质—刀豆素A 、绿慕安均可以影响白色念珠菌的粘附作用, 甘露糖类物质及绿慕安是否可以治疗口腔白色念珠菌病, 还需要进一步的临床研究, 这对于探索口腔白色念珠菌病的防治具有积极的意义。参考文献:

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图2　绿慕安预作用白色念珠菌后, 白色念珠菌未粘附到上皮细胞上×400

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图3　刀豆素A 预作用白色念珠菌后, 白色念珠菌未粘附到上皮细胞上×400

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[6]牟希亚1菌毛学研究进展[M ]1大连:大连出版社, 1999, 4:1181

到了抑制。

A rtem ia

Gom ez -Gil et al (1998) 报道了在实验前接种了C 14菌株的A rtem ia 幼体, 感染副溶血弧菌(Parahaemo lyticu s ) HL 58后死亡率下降, 而HL 58菌株仍能在幼体定植(Gom ez -Gil , B . 1998) 。V erschuere et al (1999) 筛选出了九种对幼体盐水虾的生长、存活有促进作用的菌株。这九种菌株都能延长感染病原性弧菌(V . p ro teo lyticu s ) C W 8T 2的A rtem ia 存活时间, 尽管不同菌株间存在着很大差异, 在感染病原菌后的2天间, 无菌控制条件下的A rtem ia 在4天后的存活率高达80%(V erschuere , L . , 2000) , 而且在LV S 8菌株存在时, A rtem ia 养殖水中弧菌(V . p ro teo lyticu s ) C W 8T 2的生长放缓。

微生物熟化水

尽管这不是严格意义上的益生菌处理方法, 但在多数水生物种的幼体养殖的最适条件方面已经尝试着用称作微生物熟化水的方法(Sk jermo , J . , 1997; V adstein , O . , 1993) 。用熟。在大菱鲆鱼卵孵化后, 殖, ; 。

前面提到, 有时很难将辨别益生菌是作为水生生物食物还是作为环境控制制剂, 向养殖水中添加细菌, 可以促进轮虫、双壳类动物的幼体或成体、甲壳类幼体等对这些细菌的吸收, 这时的细菌可能是作为食物源或促进对食物的消化和吸收的因子, 即使应用益生菌的主要目的是抑制水体中病原菌的生长。关于益生作用是因为能够抑制病原菌还是因为益生菌营养作用的直接或间接结果, 目前还不十分清楚。

R iquel m e et al (1997) 和V erschuere et al (1999, 2000) 先后提到过这种两重性。R iquel m e et al 估测了体外实验中能抑制与弧菌(V . angu illarum ) 相关的11种细菌对Ch ilean 扇贝幼体存活率的影响, 这些扇贝幼体连续2周只喂饲不同的具有致病性菌株。只有两种菌株(V ib ri o 11和334菌株) 对扇贝幼体没影响, 而其它菌株均导致扇贝幼体极高的死亡率。在体内侵染实验中, 只有弧菌11弧菌V . angu et al (V er 2, L . , 方了9种能增加A ia , p s C W 8T 2的拮抗作用, 并。这种结果说明应将两方面分别考的益生效果。

原文:L au ren t V . , Greert R . , Patrick S and W illy V , M icrob i o logy and M o lecu lar B i o logy R eview D ec . 2000, P

(待续) 655-671.

(上接第182页) 同时, 根据菌株的不同特性, 加工成不同的剂

型, 开发生产适宜不同动物、不同生长阶段、针对性强的益生

菌产品, 成为益生菌研究应用的重点之一。

人类的发展正是人类同自然不断平衡协调的过程, 在水产品与人们生活紧密联系的今天, 将生物技术用于水产养殖业, 充分利用益生菌的生物特性, 是提高人类生活水平的有效途径。人类在开发利用自然资源的同时, 也使得人与自然的关系更加紧密, 协调好人与自然的关系, 实现可持续发展已经提到了人类的议事日程上来。利用益生菌作为水产动物的饲料添加剂, 掀起了养殖业的绿色革命, 是人类将自身健康发展融入到保持生态平衡的大主题的飞跃。参考文献:

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