[摘要]目的：比较四种脱钙方法对人牙牙体组织免疫组化染色抗原活性的影响。方法：40颗人牙随机分为四组，分别在微波、超声、微波-超声联合及常温下用10%乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA-2Na)脱钙。应用SABC免疫组化染色技术检测Ⅰ型胶原蛋白、纤维粘连蛋白在各组牙体组织中的表达情况。结果：在微波-超声联合组脱钙所需时间最短，且免疫组化染色效果最好﹙P＜0.05﹚；微波组脱钙时间较超声组略短，但二者免疫组化染色效果无显著差异（P＞0.05）。常温组所需脱钙时间最长且免疫组化染色效果最差。结论：微波-超声联合法脱钙速度较快，免疫组化染色效果较好，是一种较为理想的脱钙方法。
[关键词]微波；超声；牙齿；脱钙方法；免疫组化
[中图分类号]R783.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）06-0955-03
牙体组织结构较为特殊，其硬组织中含有大量钙盐（洛氏硬度值达340）[1]，是全身最坚硬的组织，不易切片极易脱片，因此在病理制片过程中首先要脱去其中的钙盐再进行制片，而位于牙体硬组织中心的牙髓为柔软的结缔组织，在制片过程中易受挤压、牵拉而至变形、分离甚至脱落流失，脱钙不佳也会影响组织细胞染色效果或使组织抗原丢失[2]，从而影响对病变组织的病理诊断或科学研究工作。因此合适的脱钙方法成为牙体组织制片，进行免疫组化染色实验首先要解决的难题。本实验中对微波、超声、微波-超声联合脱钙法的脱钙效果，及不同脱钙方法对牙体组织免疫组化染色抗原的影响程度进行了初步检测，旨在寻找出更适合牙体组织免疫组化染色实验的脱钙方法。
1 材料和方法
1.1 材料：收集因正畸拔除的健康人前磨牙40颗,患者年龄17～25岁,牙齿完好。经生理盐水冲洗后,入4%多聚甲醛溶液固定24h。
1.2 仪器试剂：微光波炉（WG700TL20Ⅱ-k6,广东格兰仕集团有限公司）；KQ118型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ⅰ型胶原蛋白抗体(武汉博士德公司)；纤维粘连蛋白抗体(武汉博士德公司)；SABC试剂盒(武汉博士德公司)。
1.3 脱钙液配制：10% EDTA脱钙液：EDTA-2Na 100g，NaOH 10g，加双蒸水1000ml于容量瓶中,微加温溶解，调pH值至7.2～7.4[3]。
1.4 方法：40颗牙随机分成四组：微波组（Ⅰ），超声组（Ⅱ），微波-超声联合组（Ⅲ），常温对照组（Ⅳ）。将四组牙分别放入四只250 ml小烧杯内，各加入脱钙液150～200ml。按下列四种方法脱钙：Ⅰ组：将小烧杯放入加有冷水的500ml大烧杯内；置于微波炉中（低档，输出功率150W），脱钙10min后，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅱ组：将小烧杯放入超声波清洗器中（35℃，150W），脱钙10min，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅲ组：将小烧杯放入超声清洗器中脱钙10min（条件同Ⅱ组），再放入微波炉中脱钙（条件同Ⅰ组）进行第二次脱钙，如此反复进行，每日脱钙24次。Ⅳ组：将小烧杯放于室温下静置脱钙。注意各组脱钙过程中脱钙液温度以不超过50℃为宜，各组每日更换新脱钙液一次，直至脱钙完成（以大头针无阻力可刺入组织为脱钙完成的标志）。牙齿脱钙完成后,常规石蜡包埋，唇舌向切片数张。进行免疫组织化学染色。
1.5 免疫组化染色：石蜡切片经常规脱蜡至水,蒸馏水洗5min×3次；3% H2O2室温孵育10min,蒸馏水洗5 min×3次；室温下复合消化酶消化10 min,PBS洗2 min×3次；滴加BAS封闭液,室温20 min,甩去多余液体；分别滴加一抗（兔抗人Ⅰ型胶原抗体，抗体滴度1∶50；兔抗人纤维粘连蛋白抗体，抗体滴度1∶150），4℃过夜；PBS洗2 min×3次；生物素化二抗室温孵育20 min,PBS洗2 min×3次；SABC液室温作用20 min,PBS洗5min×4次；显微镜监控下DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、树胶封片,显微镜下观察。阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤同上。
1.6 图像分析及统计学处理：应用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统，运用Image-Pro-Plus图像分析软件进行平均光密度值（integral optical density，IOD）测定，取其平均值。图像分析结果以均数±标准差 (x±s)形式表示。运用SPSS13.0统计软件对所测得的数据进行方差分析。各实验组与对照组OD值之间进行Dunnett-t检验。各实验组OD值之间进行SNK-q检验。
2 结果
2.1 四种脱钙方法完成脱钙所需时间的比较 (见表1) 。
2.2 免疫组化染色结果：四种不同脱钙方法免疫组化染色效果存在差异，两种不同抗体染色结果均表明：微波-超声联合组免疫组化染色效果佳，好于其它各组(P 3 讨论
免疫组织化学染色技术是用已知的标记的特异性抗体或抗原对组织内相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，从而了解抗原或抗体结合部位和含量的一门新兴检测技术[4]。在探讨疾病的病因学、发病机制及科研工作中起到了不可估量的作用。免疫组化染色过程环节较多，而组织的脱钙方法是牙体组织免疫组化染色的最关键的步骤之一。如果脱钙不彻底可导致切片破碎甚至无法制片，脱钙方法不佳导致组织抗原丢失影响实验结果。因此，如何快速有效脱钙至关重要。
目前，有研究表明，与其他强酸(如硝酸、盐酸、甲酸等)相比EDTA-2Na是科研中较理想的脱钙剂，尤其是免疫组织化学实验，而微波-EDTA联合脱钙时，则可以明显提高脱钙速度[2,4,10]。也有学者研究发现，超声振动可加增加相互碰撞机会，提高分子平均能量，加剧分子运动降低反应活化能，从而提高化学反应速度，甚至改变化学反应机理，启动新的反应渠道[5-6]。使用超声波对骨组织进行脱钙，也可取得较好的脱钙效果[7-8]。但超声用于免疫组化实验中牙齿脱钙的相关报道较少。
本研究中，用EDTA脱钙液，采用微波、超声、微波-超声联合及常温下对牙体组织的脱钙情况以及不同脱钙方法对免疫组化染色的影响程度进行了比较。对两种抗体的检测结果均表明：在四种脱钙方法中微波-超声联合组脱钙效果最好，免疫组化染色效果最佳。其原因可能是因为在微波电磁场作用下，使脱钙组织中排列混乱的极性分子快速转向，并定向排列，在运动、摩擦、碰撞过程中产热使脱钙速度加快；超声辐射所产生的能量可以使反应体系破碎、分散、雾化混合,增加反应界面，打开化学键，反应的进行同时也可引起加热效应等来促进化学反应的进行。另外超声波的作用使络合产物和中间体及时离开反应界面，类似高效的机械搅拌[9]。因此可能是当微波-超声联合应用时，通过超声将牙体表面磷酸钙晶体溶解，形成EDTA-2Na和钙的螯合物，超声振动，将牙体表面钙团洗脱，打开更多通道与脱钙液接触，进而更加利于微波脱钙，从而使脱钙时间缩短。另外分析可能是因为EDTA-2Na有萃取某些基质蛋白的作用[11],常温组脱钙时间过长降低了抗原的免疫反应性。而微波组和超声组可能是由于在脱钙时间上没有明显的差别，因此其免疫组化染色强度无显著差异（P＞0.05）。微波-超声联合组由于脱钙时间的缩短，减轻了脱钙液对脱钙组织的破坏，使组织中的抗原以及细胞形态和组织结构得到了较好的保护，因此免疫组化染色更强。并且，可能是因为该法脱钙更为均匀彻底[3]，更进一步提高了制片的质量。
总之，在实验中发现，采用微波-超声联合脱钙，且注意实验中各环节标准化操作，可缩短脱钙时间，获得较满意的染色效果，提高制片质量。但本实验中仅对Ⅰ型胶原蛋白、FN两种抗体的某一选定浓度进行了检测，尚未对其它浓度及更多抗原进行测定，仍存在不足之处，对微波-超声联合法脱钙的化学反应机理还需进一步研究。
[参考文献]
[1]于世凤.口腔组织病理学[M],5版.北京:人民卫生出版社,2003:42．
[2]熊正文,黄勇,胡海霞,等.微波-EDTA快速脱钙技术及其在免疫组化染色中的应用[J].解剖学杂志,2003,26(5):506-508．
[3]刘英群,祝莹颖,王桐.微波和超声对人牙脱钙效果的比较研究[J].中国地方病学杂志,2006,25(6)：707-709.
[4]熊正文.免疫组织化学中抗原修复的研究进展[J].中华病理学杂志,1997,26:124.
[5]Said K,Moussaoui Y,Kammoun M,et al.Ultrasonic activation of Heck type reactions in the presence of Aliquat-336[J]．Ultrason Sonochem,2011,18(1):23-27．
[6]Kumar D,Kumar G,Poonam,et al．Ultrasonic assisted transesterification of Jatropha curcus oil using solid catalyst，Na/SiO［J］．Ultrason Sonochem,2010,17(5):839-844．
[7]法京,沈强,俞彰,等.超声波骨组织电镜样品脱钙处理的实验研究，复旦学报(医学版),2003，30 (2):117-119.
[8]任智超,王欣,刘宝林.超声波辅助脱钙技术用于猪脱钙骨基质制备的效果评价[J]第三军医大学学报,2011,33(11):1165-1169.
[9]Zabaneh M,Bar R.Ultrasound-enhanced bioprocess.Ⅱ:dehydrogenation of hydrocortisone by arthrobacter simplex[J].Biotechnol Bioeng ,1991,37:998.
[10]任智超,王欣,刘宝林.微波辅助脱钙技术在猪脱钙骨基质制备中的应用研究[J].中国生物医学工程学报,2011,39(5):762-767.
[11]Holly C,Peter D.Form and function：the laminin family of heteotrimers[J].Dev Dyn,2000，218(2):213-234.
[收稿日期]2012-02-21 [修回日期]2012-04-13
编辑/张惠娟
[摘要]目的：比较四种脱钙方法对人牙牙体组织免疫组化染色抗原活性的影响。方法：40颗人牙随机分为四组，分别在微波、超声、微波-超声联合及常温下用10%乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA-2Na)脱钙。应用SABC免疫组化染色技术检测Ⅰ型胶原蛋白、纤维粘连蛋白在各组牙体组织中的表达情况。结果：在微波-超声联合组脱钙所需时间最短，且免疫组化染色效果最好﹙P＜0.05﹚；微波组脱钙时间较超声组略短，但二者免疫组化染色效果无显著差异（P＞0.05）。常温组所需脱钙时间最长且免疫组化染色效果最差。结论：微波-超声联合法脱钙速度较快，免疫组化染色效果较好，是一种较为理想的脱钙方法。
[关键词]微波；超声；牙齿；脱钙方法；免疫组化
[中图分类号]R783.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）06-0955-03
牙体组织结构较为特殊，其硬组织中含有大量钙盐（洛氏硬度值达340）[1]，是全身最坚硬的组织，不易切片极易脱片，因此在病理制片过程中首先要脱去其中的钙盐再进行制片，而位于牙体硬组织中心的牙髓为柔软的结缔组织，在制片过程中易受挤压、牵拉而至变形、分离甚至脱落流失，脱钙不佳也会影响组织细胞染色效果或使组织抗原丢失[2]，从而影响对病变组织的病理诊断或科学研究工作。因此合适的脱钙方法成为牙体组织制片，进行免疫组化染色实验首先要解决的难题。本实验中对微波、超声、微波-超声联合脱钙法的脱钙效果，及不同脱钙方法对牙体组织免疫组化染色抗原的影响程度进行了初步检测，旨在寻找出更适合牙体组织免疫组化染色实验的脱钙方法。
1 材料和方法
1.1 材料：收集因正畸拔除的健康人前磨牙40颗,患者年龄17～25岁,牙齿完好。经生理盐水冲洗后,入4%多聚甲醛溶液固定24h。
1.2 仪器试剂：微光波炉（WG700TL20Ⅱ-k6,广东格兰仕集团有限公司）；KQ118型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ⅰ型胶原蛋白抗体(武汉博士德公司)；纤维粘连蛋白抗体(武汉博士德公司)；SABC试剂盒(武汉博士德公司)。
1.3 脱钙液配制：10% EDTA脱钙液：EDTA-2Na 100g，NaOH 10g，加双蒸水1000ml于容量瓶中,微加温溶解，调pH值至7.2～7.4[3]。
1.4 方法：40颗牙随机分成四组：微波组（Ⅰ），超声组（Ⅱ），微波-超声联合组（Ⅲ），常温对照组（Ⅳ）。将四组牙分别放入四只250 ml小烧杯内，各加入脱钙液150～200ml。按下列四种方法脱钙：Ⅰ组：将小烧杯放入加有冷水的500ml大烧杯内；置于微波炉中（低档，输出功率150W），脱钙10min后，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅱ组：将小烧杯放入超声波清洗器中（35℃，150W），脱钙10min，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅲ组：将小烧杯放入超声清洗器中脱钙10min（条件同Ⅱ组），再放入微波炉中脱钙（条件同Ⅰ组）进行第二次脱钙，如此反复进行，每日脱钙24次。Ⅳ组：将小烧杯放于室温下静置脱钙。注意各组脱钙过程中脱钙液温度以不超过50℃为宜，各组每日更换新脱钙液一次，直至脱钙完成（以大头针无阻力可刺入组织为脱钙完成的标志）。牙齿脱钙完成后,常规石蜡包埋，唇舌向切片数张。进行免疫组织化学染色。
1.5 免疫组化染色：石蜡切片经常规脱蜡至水,蒸馏水洗5min×3次；3% H2O2室温孵育10min,蒸馏水洗5 min×3次；室温下复合消化酶消化10 min,PBS洗2 min×3次；滴加BAS封闭液,室温20 min,甩去多余液体；分别滴加一抗（兔抗人Ⅰ型胶原抗体，抗体滴度1∶50；兔抗人纤维粘连蛋白抗体，抗体滴度1∶150），4℃过夜；PBS洗2 min×3次；生物素化二抗室温孵育20 min,PBS洗2 min×3次；SABC液室温作用20 min,PBS洗5min×4次；显微镜监控下DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、树胶封片,显微镜下观察。阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤同上。
1.6 图像分析及统计学处理：应用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统，运用Image-Pro-Plus图像分析软件进行平均光密度值（integral optical density，IOD）测定，取其平均值。图像分析结果以均数±标准差 (x±s)形式表示。运用SPSS13.0统计软件对所测得的数据进行方差分析。各实验组与对照组OD值之间进行Dunnett-t检验。各实验组OD值之间进行SNK-q检验。
2 结果
2.1 四种脱钙方法完成脱钙所需时间的比较 (见表1) 。
2.2 免疫组化染色结果：四种不同脱钙方法免疫组化染色效果存在差异，两种不同抗体染色结果均表明：微波-超声联合组免疫组化染色效果佳，好于其它各组(P 3 讨论
免疫组织化学染色技术是用已知的标记的特异性抗体或抗原对组织内相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，从而了解抗原或抗体结合部位和含量的一门新兴检测技术[4]。在探讨疾病的病因学、发病机制及科研工作中起到了不可估量的作用。免疫组化染色过程环节较多，而组织的脱钙方法是牙体组织免疫组化染色的最关键的步骤之一。如果脱钙不彻底可导致切片破碎甚至无法制片，脱钙方法不佳导致组织抗原丢失影响实验结果。因此，如何快速有效脱钙至关重要。
目前，有研究表明，与其他强酸(如硝酸、盐酸、甲酸等)相比EDTA-2Na是科研中较理想的脱钙剂，尤其是免疫组织化学实验，而微波-EDTA联合脱钙时，则可以明显提高脱钙速度[2,4,10]。也有学者研究发现，超声振动可加增加相互碰撞机会，提高分子平均能量，加剧分子运动降低反应活化能，从而提高化学反应速度，甚至改变化学反应机理，启动新的反应渠道[5-6]。使用超声波对骨组织进行脱钙，也可取得较好的脱钙效果[7-8]。但超声用于免疫组化实验中牙齿脱钙的相关报道较少。
本研究中，用EDTA脱钙液，采用微波、超声、微波-超声联合及常温下对牙体组织的脱钙情况以及不同脱钙方法对免疫组化染色的影响程度进行了比较。对两种抗体的检测结果均表明：在四种脱钙方法中微波-超声联合组脱钙效果最好，免疫组化染色效果最佳。其原因可能是因为在微波电磁场作用下，使脱钙组织中排列混乱的极性分子快速转向，并定向排列，在运动、摩擦、碰撞过程中产热使脱钙速度加快；超声辐射所产生的能量可以使反应体系破碎、分散、雾化混合,增加反应界面，打开化学键，反应的进行同时也可引起加热效应等来促进化学反应的进行。另外超声波的作用使络合产物和中间体及时离开反应界面，类似高效的机械搅拌[9]。因此可能是当微波-超声联合应用时，通过超声将牙体表面磷酸钙晶体溶解，形成EDTA-2Na和钙的螯合物，超声振动，将牙体表面钙团洗脱，打开更多通道与脱钙液接触，进而更加利于微波脱钙，从而使脱钙时间缩短。另外分析可能是因为EDTA-2Na有萃取某些基质蛋白的作用[11],常温组脱钙时间过长降低了抗原的免疫反应性。而微波组和超声组可能是由于在脱钙时间上没有明显的差别，因此其免疫组化染色强度无显著差异（P＞0.05）。微波-超声联合组由于脱钙时间的缩短，减轻了脱钙液对脱钙组织的破坏，使组织中的抗原以及细胞形态和组织结构得到了较好的保护，因此免疫组化染色更强。并且，可能是因为该法脱钙更为均匀彻底[3]，更进一步提高了制片的质量。
总之，在实验中发现，采用微波-超声联合脱钙，且注意实验中各环节标准化操作，可缩短脱钙时间，获得较满意的染色效果，提高制片质量。但本实验中仅对Ⅰ型胶原蛋白、FN两种抗体的某一选定浓度进行了检测，尚未对其它浓度及更多抗原进行测定，仍存在不足之处，对微波-超声联合法脱钙的化学反应机理还需进一步研究。
[参考文献]
[1]于世凤.口腔组织病理学[M],5版.北京:人民卫生出版社,2003:42．
[2]熊正文,黄勇,胡海霞,等.微波-EDTA快速脱钙技术及其在免疫组化染色中的应用[J].解剖学杂志,2003,26(5):506-508．
[3]刘英群,祝莹颖,王桐.微波和超声对人牙脱钙效果的比较研究[J].中国地方病学杂志,2006,25(6)：707-709.
[4]熊正文.免疫组织化学中抗原修复的研究进展[J].中华病理学杂志,1997,26:124.
[5]Said K,Moussaoui Y,Kammoun M,et al.Ultrasonic activation of Heck type reactions in the presence of Aliquat-336[J]．Ultrason Sonochem,2011,18(1):23-27．
[6]Kumar D,Kumar G,Poonam,et al．Ultrasonic assisted transesterification of Jatropha curcus oil using solid catalyst，Na/SiO［J］．Ultrason Sonochem,2010,17(5):839-844．
[7]法京,沈强,俞彰,等.超声波骨组织电镜样品脱钙处理的实验研究，复旦学报(医学版),2003，30 (2):117-119.
[8]任智超,王欣,刘宝林.超声波辅助脱钙技术用于猪脱钙骨基质制备的效果评价[J]第三军医大学学报,2011,33(11):1165-1169.
[9]Zabaneh M,Bar R.Ultrasound-enhanced bioprocess.Ⅱ:dehydrogenation of hydrocortisone by arthrobacter simplex[J].Biotechnol Bioeng ,1991,37:998.
[10]任智超,王欣,刘宝林.微波辅助脱钙技术在猪脱钙骨基质制备中的应用研究[J].中国生物医学工程学报,2011,39(5):762-767.
[11]Holly C,Peter D.Form and function：the laminin family of heteotrimers[J].Dev Dyn,2000，218(2):213-234.
[收稿日期]2012-02-21 [修回日期]2012-04-13
编辑/张惠娟