设计跨内含子引物的方法
一、为什么要设计跨内含子的引物
区别或消除gDNA 的扩增
二、如何设计
1、 在pubmed 上找到目标基因的DNA 序列以及其内含子和外显子情况
步骤：
打开NCBI 主页面，选GENE ，输入基因名称，找到符合要求的基因，links 到geneback 即可显示出该基因DNA 的信息, 这是基因组DNA, 从mRNA 选项中JION 后面的是外显子的位置，为了以后的操作，可以把这个DNA 序列、外显子和CDS 序列的起至位置记下来。
2、 在pubmed 上找到目标基因的mRNA 序列
步骤：
打开NCBI 主页面，选GENE ，输入基因名称，找到符合要求的基因，点击进入基因页面，即可显示出这个基因的mRNA 信息，最后的ORIGIN 是CDNA 序列，把它记下来。
注：最好能找到以NM 或XM 开头的序列，以此做为设计引物的模板。
NCBI RefSeq (美国国立生物技术信息中心参考序列库) 是目前世界上最完整和最具有权威性的人类基因组编码mRNA 序列数据库。它已收集了大约17,500个经cDNA 测序证实的"NM" 序列，还有大约10,000个主要由计算机推测产生的"XM" 序列。由于一些序列来自异常连接产生的转录物或由计算机推演产生的不正确内含子-外显子剪切，因此该数据库所收集的参考序列一直在不断地被修改中，尽管如此，NCBI RefSeq仍是目前最可信赖的人类基因mRNA 序列数据库。
3、 如何设计跨内含子的引物（利用primer 5）
步骤：
1）、在第2步页面右边，点击
real time PCR 一般产物长度为80～150bp ，引物长度15~20bp，点击GET primer。
2）、会得到若干条引物，从图中信息即可看出跨内含子的引物，建议只用BLST 找到跨内含子的引物在CDNA 的定位，然后，用primer 5继续设计引物。此时，需记下跨内含子引物所在2个外显子的位置（确认是否在CDS 序列内）。
3）、打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy
步
骤1的CDNA 序列在输入框内（选择As ），[此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白]。点击Primer ，进入引物窗口。
4）、此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers ”——“Pairs ”，设定搜索区域、引物长度和产物长度。搜索区域即为上一步记下的两外显子序列位置，QPCR 引物长度大约为15~20bp,产物长度为80~150bp.在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可。
5）、点击OK ，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
6）、对于引物的序列，可以简单查看一下， Tm 应该在55～70度之间，GC ％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm 值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None ”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.
7）、在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF 虚拟打印机，即可转换为Pdf 文档，里面有该引物的详细信息。
4、用PRIMER 5查找已知引物的在DNA 序列内的产物位置，确定其是否跨内含子 步骤：
打开PRIMER 5，将DNA 序列贴入，点击primer ，显示primer primer界面，点击左上方的“S ”，再点击EDIT primer，显示EDIT primer界面，在“5‘-3‘”框中贴入上一步确定的Forward primer，点击as is，显示序列已被贴入，点击analyze ，再点击primer ，显示输入的序列和已知DNA 良好配对，点击OK 。显示“primer primer界面”， 点击左上方的“A ”，再点击EDIT primer，显示EDIT primer界面，在“3‘-5‘”框中贴入已知的REVERSE primer ，点击REVERSE ，显示序列已被贴入，点击analyze ，再点击primer-，显示输入的序列和已知DNA 良好配对，点击OK ，显示“primer primer界面”，在右上角显示PCR 产物的起始和结束位点。对照步骤1记录的CDS 起始位点，即可验证。
5、用Oligo 验证评估引物
1）、在Oligo 软件界面，File 菜单下，选择Open ，定位到目的cDNA 序列（在primer 中，该序列已经被保存为Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm 窗口。在Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change －Current oligo length 来改变。定位后，点击Tm 窗口的Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower 按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
2）、Analyze 中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm 值，此值Oligo 是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引
物的Tm 值略高，此窗口中还给出引物的Delta G.3’端的Delta G 过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA 聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
3）、Analyze 中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR 反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo 此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
4）、Analyze 中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
5）、Analyze 中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm 值。上下游引物的GC ％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC ％ 不要相差太大。Tm 值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method 、％GC method和2(A＋T) ＋4(G＋C)method ，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。
6）、第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo 详细，并且oligo 会给出正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
7）、其次，Internal stability 很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。
8）、Analyze 中，有参考价值的最后一项是“PCR ”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR 反应Summary ，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR 反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo 在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
9）、引物评价完毕后，可以选择File －Print ，打印为PDF 文件保存，文件中将会包括所有Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm 窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR 窗口。
10）、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast 分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast 结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
设计跨内含子引物的方法
一、为什么要设计跨内含子的引物
区别或消除gDNA 的扩增
二、如何设计
1、 在pubmed 上找到目标基因的DNA 序列以及其内含子和外显子情况
步骤：
打开NCBI 主页面，选GENE ，输入基因名称，找到符合要求的基因，links 到geneback 即可显示出该基因DNA 的信息, 这是基因组DNA, 从mRNA 选项中JION 后面的是外显子的位置，为了以后的操作，可以把这个DNA 序列、外显子和CDS 序列的起至位置记下来。
2、 在pubmed 上找到目标基因的mRNA 序列
步骤：
打开NCBI 主页面，选GENE ，输入基因名称，找到符合要求的基因，点击进入基因页面，即可显示出这个基因的mRNA 信息，最后的ORIGIN 是CDNA 序列，把它记下来。
注：最好能找到以NM 或XM 开头的序列，以此做为设计引物的模板。
NCBI RefSeq (美国国立生物技术信息中心参考序列库) 是目前世界上最完整和最具有权威性的人类基因组编码mRNA 序列数据库。它已收集了大约17,500个经cDNA 测序证实的"NM" 序列，还有大约10,000个主要由计算机推测产生的"XM" 序列。由于一些序列来自异常连接产生的转录物或由计算机推演产生的不正确内含子-外显子剪切，因此该数据库所收集的参考序列一直在不断地被修改中，尽管如此，NCBI RefSeq仍是目前最可信赖的人类基因mRNA 序列数据库。
3、 如何设计跨内含子的引物（利用primer 5）
步骤：
1）、在第2步页面右边，点击
real time PCR 一般产物长度为80～150bp ，引物长度15~20bp，点击GET primer。
2）、会得到若干条引物，从图中信息即可看出跨内含子的引物，建议只用BLST 找到跨内含子的引物在CDNA 的定位，然后，用primer 5继续设计引物。此时，需记下跨内含子引物所在2个外显子的位置（确认是否在CDS 序列内）。
3）、打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy
步
骤1的CDNA 序列在输入框内（选择As ），[此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白]。点击Primer ，进入引物窗口。
4）、此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers ”——“Pairs ”，设定搜索区域、引物长度和产物长度。搜索区域即为上一步记下的两外显子序列位置，QPCR 引物长度大约为15~20bp,产物长度为80~150bp.在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可。
5）、点击OK ，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
6）、对于引物的序列，可以简单查看一下， Tm 应该在55～70度之间，GC ％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm 值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None ”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.
7）、在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF 虚拟打印机，即可转换为Pdf 文档，里面有该引物的详细信息。
4、用PRIMER 5查找已知引物的在DNA 序列内的产物位置，确定其是否跨内含子 步骤：
打开PRIMER 5，将DNA 序列贴入，点击primer ，显示primer primer界面，点击左上方的“S ”，再点击EDIT primer，显示EDIT primer界面，在“5‘-3‘”框中贴入上一步确定的Forward primer，点击as is，显示序列已被贴入，点击analyze ，再点击primer ，显示输入的序列和已知DNA 良好配对，点击OK 。显示“primer primer界面”， 点击左上方的“A ”，再点击EDIT primer，显示EDIT primer界面，在“3‘-5‘”框中贴入已知的REVERSE primer ，点击REVERSE ，显示序列已被贴入，点击analyze ，再点击primer-，显示输入的序列和已知DNA 良好配对，点击OK ，显示“primer primer界面”，在右上角显示PCR 产物的起始和结束位点。对照步骤1记录的CDS 起始位点，即可验证。
5、用Oligo 验证评估引物
1）、在Oligo 软件界面，File 菜单下，选择Open ，定位到目的cDNA 序列（在primer 中，该序列已经被保存为Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm 窗口。在Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change －Current oligo length 来改变。定位后，点击Tm 窗口的Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower 按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
2）、Analyze 中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm 值，此值Oligo 是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引
物的Tm 值略高，此窗口中还给出引物的Delta G.3’端的Delta G 过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA 聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
3）、Analyze 中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR 反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo 此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
4）、Analyze 中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
5）、Analyze 中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm 值。上下游引物的GC ％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC ％ 不要相差太大。Tm 值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method 、％GC method和2(A＋T) ＋4(G＋C)method ，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70度之间。
6）、第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo 详细，并且oligo 会给出正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
7）、其次，Internal stability 很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。
8）、Analyze 中，有参考价值的最后一项是“PCR ”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR 反应Summary ，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR 反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo 在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
9）、引物评价完毕后，可以选择File －Print ，打印为PDF 文件保存，文件中将会包括所有Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm 窗口和Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR 窗口。
10）、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast 分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast 结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。