仲恺农业工程学院
课程学习报告
课程名称：细胞工程大实验
学期：2008-2009学年第一学期
实验一 培养基母液和培养基的配制 实验二 水稻及胡萝卜再生体系的建立 实验三 悬浮细胞体系的建立 实验四 植物遗传转化 实验五 原生质体游离与培养 实验六 玉米幼胚接种
院 系： 生命科学学院
班 级： 生物技术081班 姓 名： 钱烈贤 学 号： [1**********]5
实验一 培养基母液和培养基的配制
摘要
为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。各种混合液（母液）或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。
关键词
培养基母液、培养基、无机盐、有机物、激素、附加物
前言
本实验的目的是要学习并掌握培养基母液配制的方法和培养基配制的方法，掌握不同物质浓度按比列稀释和转化的计算方法。
在配制培养基前，先配制单一化合物母液可以提高称量的准确性并减少多次称量的麻烦，配制多种培养基都需要的同一种母液，放置冰箱中保存，用时按比例稀释即可。培养基实际一是一个人工模拟的植物生长、发育环境，在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养万分生长因子、理化环境等主要同培养基提供。不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。另外，组织培养物的脱分化、分化等状态的调控，次生代谢物的产出等都要通过调节培养基成分来实现。
一 材料与方法步骤
（一）试剂
培养基母液（以MS为例）：NH4NO3；KNO3 ；CaCl2.2H2O；MgSO4.7H2O；KH2PO4；(NH4)2SO4；H3BO3；KI；MnSO4.H2O；ZnSO4.7H2O；NaMoO4.2H2O；CuSO4.5H2O；CoCl2.6H2O；Na2EDTA.2H2O；FeSO4. 7H2O；甘氨酸；盐酸吡哆醇；盐酸硫氨素；烟酸；肌醇；2，4—D；6—BA；NAA 培养基：1N HCl ；1N KOH； 标准pH溶液（25℃下，pH4.01和pH6.08的标准溶液各100ml）；蔗糖；琼脂；水解蛋白酶；谷氨酰胺；脯氨酸。 （二）方法步骤
1、培养基母液配制 (1) 大量元素母液
大量元素母液含N、P、K、Ca、Mg、S等六种盐类的混合溶液，可配置10倍或20倍的母液，使用时每配置1000ml培养基时取100ml或50ml母液。
表1 MS培养基大量元素母液制备 序号 药品名称 1 2 3 4 5
NH4NO3 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO4
培养基浓度（mg/L）
1650 1900 440 370 170
扩大10称量(mg)
16500 19000 4400 3700 1700
备注
蒸馏水定容至1000ml
1 将1升培养基所需各种微量元素扩大10倍，进行实际称量。分别称取上述药品：16.5g，19g，4.4g，3.7g，1.7g。
2 将混合液倒入1000ml量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4℃储
存。
（2）微量元素母液
1 按培养基配方所列元素成分，取相应分析纯化学试剂（对水合分子不同的试剂要进行换算）。例如换算MnSO4·4H2O：MnSO4·4H2O分子质量/ MnSO4·7H2O分子质量，再乘以11.15g。
2 将1升培养基所需各种微量元素扩大1000倍，进行实际称量。分别称取上述药品：8.45g，4.3g，3.1g，0.425g，0.125g，0.0125g，0.0125g。
3 将混合液倒入500ml量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4℃储存。
序号 1 2 3 4 5 6 7
化合物名称 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O
H3BO3 KI
Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O
培养基浓度（mg/L）
22.3
8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025
扩大1000倍称量(mg)
22300 8600 6200 830 250 25 25
备注
蒸馏水定容至500ml
（3）铁盐母液
铁盐与其他无机成分混合易产生沉淀，须单独配制。通常采用硫酸亚铁和Na2-EDTA混合物，以形成络合物，提高铁盐的利用率。铁盐一般配成100倍的螯合铁盐母液，使用时每配置1000ml培养基取10ml。
表3 MS铁盐母液的配制 序号 1 2
化合物名称 Na2-EDTA FeSO4·7H2O
培养基浓度（mg/L）
3.73
2.78
扩大100倍称量(mg)
373 278
备注 蒸馏水定容至
100ml
分别称取药品：0.373g，0.278g，置于烧杯中，在沸水浴中加热搅拌20-30min，当出现金黄色时拿出来，调PH至5.5，冷却后倒入棕色瓶保藏。 （4）有机成分母液
有机化合物母液原则上应分别单独配制，实际使用时，往往配制成除肌醇外其他有机成分的混合液，一般配置成100倍或1000倍母液，使用时每配置1000ml培养基取10ml或1ml。
表3 MS培养基有机物质母液的制备 序号 1 2 3 4 5
化合物名称 甘氨酸
盐酸硫胺素(VB1) 盐酸吡哆素(VB6)
烟酸 肌醇
培养基浓度（mg/L）
2 0.4 0.5 0.5 100
扩大100倍称量(mg)
200 40 50 50 10000
备注
蒸馏水定容至1000ml 单独配制
（5）激素母液
激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg/ml到1.0mg/ml不等。 1 2，4－D母液（20 mg／100 ml）：用万分之一天平称取2，4-D 20 mg →用少量95%乙醇充分溶解 → 加水定容为100 ml。
2 6－BA 母液（20 mg／100 ml）：用万分之一天平称取6－BA 20 mg →用少量1N HCl充分溶解 → 加水定容为100 ml。
3 NAA母液（20mg／100 ml）：用万分之一天平称取NAA 20 mg →用少量95%乙醇充分溶解 → 加水定容为100 ml。 2、培养基的配制（300ml） B5培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe盐）+0.5mg/L 2，4-D+7g/L 琼脂 +30g/L
蔗糖，PH=5.8
N6培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe盐）+0.5mg/L 2，4-D+水解蛋白酶500mg/L+
谷氨酰胺700mg/L+脯氨酸700mg/L+7g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，PH=5.8
(1) 混合培养基中的各成分（取母液）：200ml烧杯一只，用50ml量筒量取大量元素20ml（10X），再用移液管分别吸取微量元素2ml（100X），铁盐2ml（100X），有机成分2ml（100X）肌醇2ml（100X）和激素类（浓度临时确定），最后用蒸馏水定容至所需配制的培养基体积的一半。
(2) 溶化琼脂：称取应加的琼脂和蔗糖，加蒸馏水至所需配制的培养基体积的一半，在壁上做一液面记号，放置约0.5-1h，待蔗糖溶解，琼脂发胀后，加热烧开溶化琼脂。若失水，则加蒸馏水至液面记号处。
(3) 混合：把1和2混合在一起，搅匀。
(4) pH值：培养基的pH值会影响植物对养分的吸收与利用，还会影响琼脂等固化剂量的凝固，因此培养基必须调至一定的pH值。用pH计或pH试纸测pH值，并用1N的NaOH或HCl调至pH为5.8。不同植物培养所要求的pH值有所不同。此外，培养基经高压灭菌后pH值一般要降低0.1——0.2，所以在灭菌前调pH值时要相应提高。
(5) 分装：用玻璃漏斗将配好的培养基分装于10个三角瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口或内外壁上，以防引起污染，然后用棉塞或硫酸纸封好瓶口。写明培养基代号，日期，实验人等，扎好线绳。 3、培养基的灭菌
培养基必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，从而导致培养外植体死亡。本实验采用高压蒸汽灭菌法。
二 结果讨论
1、PH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。而这次实验我们实验室里的pH计出现了一些问题，导致测量的pH值有偏差。因此，在实验的时候要注意考虑周全，不能全信仪器的测定，同时也要用PH试纸检验一下，这样就不会使结果出现太大偏差。 2、 琼脂的溶解要注意搅拌均匀才分装，否则就会导致每个培养皿的琼脂含量不等，会出现有的培养皿不凝固的现象。
3、 灭菌时要包扎好，否则取出灭好菌的器皿时会散开。 4蛋白胨很容易吸湿，称取时动作要迅速。
实验二 胡萝卜再生系的建立
摘要
以胡萝卜块根及水稻种子为材料诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转入分化培养基进行培养。结果表明，在试用的培养基中．以2，4-D浓度为0．1mg／L时．愈伤组织状态为最佳；愈伤组织的诱导宜在黑暗条件下；培养基种类时愈伤组织的分化率影响不大，且主要以胚状体形式出芽。
组织培养的物的脱分化、生长及分化均是基因选择地表达和关闭地结果，作为第一信使的植物激素在这些过程中是信号传导地发起者。因此，培养物地生长、分化方向地控制主要是通过添加不同种类和浓度的植物激素来实现的。由外植体诱导愈伤组织是一个脱分化的过程，通常需要加入较高比例的生长类激素，如2，4－D。
关键词
水稻；胡萝卜；愈伤组织；继代
前言
在一定的培养条件下，愈伤组织通过器官发生途径形成芽或根的分生组织，继而发育成完整的植株，或通过体细胞胚胎发生途径形成胚状体，继而发育成完整的植株。由愈伤组织再生植株是一个再分化过程。一般而言，高比例的细胞分裂素/生长素有利于芽的形成；低比例时有利于根的形成。再生植株移至生根培养基上可以生根，生根的小苗经过练苗后可移栽室外培育。本实验的目的是学习利用外植体诱导形成愈伤组织的方法，了解其诱导继继代培养的过程。
一 材料与方法
1.1植物材料 胡萝卜块根
1.2方法
1.2.1愈伤组织诱导 1）外植体的消毒
胡萝卜：将胡萝卜块洗净，削皮、切除两端、切成小块，75%酒精浸泡3分钟，倒掉酒精，无菌水洗1次，用1%HgCl2消毒12分钟，在用无菌水洗3～4次。
水稻：挑选约100粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水洗3～4次 2）接种
胡萝卜愈伤组织诱导培养基为：B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 2，4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8；B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 6-BA0.2mg/l+ 2,4-D0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8；MS(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒后的胡萝卜切除两端和外层部分，切成0.5～1mm左右的小圆片，切下形成层部分，并切成长2mm宽1.5的小长块，接种于诱导培养基上（三角瓶和平板培养基），25℃暗培养。
水稻愈伤组织诱导培养基为：N6(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D2mg/L+水解酪蛋白500mg/L＋脯蛋白700mg/L+谷氨酰氨700mg/L＋蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒
的种子接种在上述培养基中（三角瓶和平板），25℃暗培养。 1.2.2胡萝卜愈伤组织的继代与分化 1) 培养基的配制
胡萝卜愈伤组织继代培养基（pH5.8）
B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 2，4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L 胡萝卜愈伤组织分化培养基 （PH 5.8-6.0） 150ml/组 ① MS+蔗糖30g/L +琼脂7g/L
② MS+BA 1.0 mg/L +蔗糖30g/L +琼脂7g/L
③ MS +BA 1.0 mg/L +NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L +琼脂7g/L ④ MS+ BA 3.0 mg/L +NAA1.0mg/L +蔗糖30g/L +琼脂7g/L
⑤ MS+ BA 1.0 mg/L +NAA0.5mg/L +水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L ⑥ MS+ BA 3.0 mg/L +NAA1.0mg/L +水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L ⑦ B5+ BA 3.0 mg/L +NAA1.0mg/L +水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L 2) 诱导3周后的愈伤组织在灭菌的培养皿上切成小块，接入继代培养基中。三周左右观察生长状态。
3) 胡萝卜愈伤组织继代：
污染率=（污染外植体块数/接种的外植体块数）×100%
诱导率=（形成愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数）×100%
4) 胡萝卜愈伤组织的分化
出绿率=（出现的愈伤块数/接种分化的总块数）×100% 分化率=（分化组织的愈伤块数／接种分化的总块数）×100%
二 结果与分析
1. 胡萝卜愈伤组织的诱导率和污染率
培养基种类
B5(MS)+2,4-D 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L B5(MS)+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L
B5(MS)+2,4-D 0.1mg/L+BA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L B5(MS)+2,4-D 0.5mg/L+BA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L
污染率（%）
诱导率（%）
100 75 100 100
0 25 0 0
2. 胡萝卜愈伤组织继代
继代前 继代后
3. 胡萝卜愈伤组织分化
1 号 2 号 3号
总共有接了17个胡萝卜愈伤组织
培养瓶 1 2 3
污染率 0 0 0
出绿点率 60% 25% 14.3%
出芽率 20% 50% 14.3%
这个培养基的出绿点率为33.1%，出芽率为28.1%。 4. 本组实验结果
本组在本次实验中胡萝卜愈伤组织的诱导的感染率为100%。分析其原因，第一，因为超净工作台上太多人一起操作，导致环境较差，较易污染实验材料。第二，外植体的消毒可能不够彻底。由于操作有失误，无菌水的浸泡次数不够，只有三次。第三，镊子和刀在火上烧得太热，在灭过菌的带滤纸的培养基上预冷不够就直接接触实验材料，导致胡萝卜的灼伤。第四，因为本着学习的态度，所以我们每个组员都有去亲自操作接培养基，由于每个人的手法不同，也会容易引起污染。这些原因都是我们组污染率较高的原因。
实验三 悬浮细胞体系的建立
摘要
本实验从建立稳定的水稻悬浮细胞系开始，将悬浮细胞分别转入分化培养基进行培养，水稻愈伤组织分化的培养基是N6。植物细胞悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中于摇床上进行培养增殖的无菌培养技术，在培养过程中能够保持良好的分散状态。目前这项技术已广泛用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
关键词
愈伤组织 悬浮细胞系 继代 分化
前言
一个成功的悬浮细胞系必须具备以下条件：（1）悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30-50个细胞下，在实际培养中很少有由单细胞组成的植物细胞悬浮系。（2）均一性好，细胞形状和细胞大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色彩呈鲜艳的乳白或蛋黄色。（3）细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般为2-3天或更短时间内细胞数量更加一倍。
使悬浮系分散的基本方法有：（1）选择松散易碎的愈伤组织进入悬浮培养。（2）高auxin/cytokinin的比例，或完全去除cytokinin。（3）使用更强的auxin，如将IAA改为NAA，NAA改为2，4-D。（4）加少量的cellulase(0.1%)/pectinase(0.05%).（5）粗研愈伤组织使之成为较小的细胞团再进行悬浮培养。（6）固-液反复交替培养。（7）选择继代。
本实验的目的是了解植物悬浮细胞培养过程，掌握悬浮细胞系建立和继代保持的方法。
一 材料与方法
1.1实验材料
水稻种子 水稻愈伤组织 1.2方法
1.2.1水稻愈伤组织诱导 1）外植体的消毒
挑选约100粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水洗3～4次 2）接种
水稻愈伤组织诱导培养基为：N6(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D2mg/L+水解酪蛋白500mg/L＋脯蛋白700mg/L+谷氨酰氨700mg/L＋蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒的种子接种在上述培养基中（三角瓶和平板），25℃暗培养。 1.2.2愈伤组织的继代
将无菌的水稻愈伤组织接种在MS(大量,微量,有机,肌醇,铁盐)+水解蛋白酶300mg/L+6-BA3mg/L + NAA 1mg/L +蔗糖（30g/L）+琼脂7g ，PH 5.8的培养基中（平板和三角瓶），25℃光培养。 1.2.3愈伤组织的分化
取上述三角瓶继代培养的水稻愈伤组织继续在25℃下光培养。 1.2.4水稻悬浮体系的建立 1）培养基
（1）MS + 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（2）N6+ 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯
氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（3）MB + 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（4）NB+ 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8。 2）接种
挑选疏松，生长旺盛的水稻愈伤组织1～2g放入盛有30ml液体培养基的100mL三角瓶中；用镊子轻轻捏碎愈伤，增加细胞的分散程度；把培养基放入温度为25℃的摇床中进行暗培养，转速为160r/min，观察悬浮细胞系的生长状态。 1.3.2水稻悬浮体系的继代
培养一段时间后，待有新的愈伤组织长出，在无菌工作台上将各种培养基倒掉一半，用镊子夹除较大块的愈伤组织，分别加入各种新的培养基，用锡箔纸盖好，继续放入温度为25℃的摇床中进行暗培养，转速为160r/min，观察悬浮细胞系的生长状态。
二 结果与分析
下图为我组的水稻愈伤组织的结果示意图，总共接种了4个三角瓶十九个水稻种子，都没有污染，因此，污染率为0，诱导率未100%。
水稻愈伤组织的诱导
悬浮培养
继代后培养
培养基种类
MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L MS+2,4-D 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L MS+脯氨酸0.7g/l+谷氨酰胺0.7g/L+水解酪蛋白0.5g/L+2,4- D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L MS+脯氨酸0.7g/l+谷氨酰胺0.7g/L+水解酪蛋白0.5g/L+2,4- D 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L
接种数 27 38 24 36
愈伤个数 17 27 11 29
诱导率 62.96% 71.05% 45.83% 80.56%
1. 水稻愈伤组织诱导统计表
由上表我们可以得出，MS+脯氨酸0.7g/l+谷氨酰胺0.7g/L+水解酪蛋白0.5g/L+2,4- D 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基的诱导率是最高的，所以这个培养基相对来说是最适合水稻愈伤组织的诱导的。
实验四 植物遗传转化
摘要：研究胡萝卜胚胎发生过程的基因表达变化具有重大的理论和实际意义。目前通过遗
传转化技术获得了许多植物的转基因植株，一些重要农作物转基因新品种已进入产业化阶段，展现出极好的应用前景。本实验依据T-DNA能自由转移的特征采用农杆菌介导法来将外源基因导入胡萝卜愈伤细胞，再继续进行愈伤组织培养，实验胡萝卜的遗传转化。
关键词
胡萝卜愈伤组织 农杆菌 介导法 遗传转化 Ti质粒
前言
农杆菌介导法相对于其他转化法而言，具有明显的优点：①农杆菌介导水稻转化时，外源基因多以单拷贝或低拷贝数插入，并优先插入转录活性区域，因较少出现基因沉默现象；②转化效率高，双子叶植物可达80%-90%，单子叶如水稻也可达20%-30%，这可能与T-DNA链在转移过程中受到蛋白质（VirE2、VirD2）的保护及其定向作用，不易被细胞内核酸酶降解有关；③T-DNA具有左右边界，转移的是位于左右边界的外源片段，故导入细胞的目的片断明确；④可以转移大片断DNA，并可以稳定整合到基因组中；⑤转化植株通常可育，大多数呈孟德尔式遗传；⑥方法简单、有效；⑦转基因植株很少出现形态变异。
影响根瘤农杆菌介导植物转化的因素很多，主要影响因素有：植物品种；农杆菌侵染的植物组织的生理状态的选材；培养基的组成成分；农杆菌菌株和载体；转化体的筛选；启动子；其他处理的影响等。
本实验的目的是为了了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握农杆菌介导植物遗传转化的基本操作技术。
一 材料与方法 1材料与方法
1.1实验材料：胡萝卜愈伤组织 1.2仪器设备及用具
仪器：超净工作台，摇床，培养箱，高压灭菌锅，ph酸度计，培养室等 用具：无菌培养皿，无菌三角瓶，镊子，移液枪，无菌水 试剂及培养基 1.3试剂
无菌水，培养基母液，头孢唑啉钠，羧苄西林钠，潮霉素，卡那霉素，Basta，乙酰丁香酮（AS），蔗糖，麦芽糖等 1.4 培养基
（1）LB培养基：15g/L Yeasr Extract+10g/L Trypton+10g/L NaCl pH 7.0 （2）农杆菌悬浮培养基：B5基本母液+（0.1μM）AS pH 5.0
（3）共培养培养基：B5基本母液+（0.1μM）AS pH 5.5 （4）筛选培养基：B5基本母液+头孢+羧苄+潮霉素 pH 5.8 （5）预分化培养基：
B5+30g/L蔗糖+cefo100mg/L+carb100mg/L+Basta 0.5mg/L+琼脂7g/L pH 5.8 （6）分化培养基： MS+Bastas 0.5mg./L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L pH 5.8 （7）生根培养基：1/2MS培养基+Basta 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L pH 5.8
1.3实验方法
1. 愈伤组织的诱导，继代….取实验室已有的胡萝卜愈伤组织 2. 农杆菌的活动，悬浮
挑去-70°保存的农杆菌转化子在YEP培养基（含25μg/ml kan和25μg/mlStr）上划线培养，28°C，暗室培养3天，取单菌落涂布于加有相同抗生素的YEP培养基上，28°C，暗培养2天，用勺子刮取一定量的农杆菌悬浮于加有100uM乙酰丁香酮的AAM或B5液体培养基中，使OD600为0.8—1.0，放置或摇床摇动培养1-2小时后用于愈伤组织的浸染。…..取用实验员已准备好的农杆菌 3. 愈伤组织的浸染及共培养
挑选颜色鲜艳，生长旺盛的胚性愈伤组织，将愈伤组织和农杆菌菌液按一定的比例混合，浸染20分钟，期间摇动几次。取出愈伤组织，并用灭菌的带滤纸的培养皿吸去多余的菌液。将愈伤组织接到加有一张滤纸的共培养基上，26°C，暗培养2-3天。
二 结果与分析
上图示，实验已成功的转化目的基因潮霉素到胡萝卜愈伤组织细胞中，筛选出含有目的基因潮霉素的愈伤组织细胞，可进行继代培养。
实验五 原生质体游离与培养
摘要
原生质体培养是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗，最终再生成完整植株。一般用酶解去壁法获得原生质体。本实验以胡萝卜愈伤组织进行原生质体游离。
关键词
原生质体 游离 细胞密度 细胞计数
一 材料与方法
1.1植物材料 胡萝卜愈伤组织 1.2方法
1.2.1实验用具和试剂的准备 （1） 实验用具和试剂
灭菌的4个6cm培养皿/组 、2根10ml离心管/组 、5ml枪头 10 根/组 、1个细胞筛/2组 、1ml枪头 1盒/组 和细菌过滤器 2个/组 （中间加细菌过滤纤维膜）
250ml三角瓶、玻璃棒、精密PH试纸、电子天平、酒精灯、打火机、滴管、移液管、锡箔纸、封口纸、记号笔、血球计数板、载玻片、盖玻片、显微镜、离心机等
实验试剂: MS 培养基母液、2，4-D 0.2mg/ml，NAA 0.2mg/ml ,1M NAOH ，1M HCL .，葡萄糖 、无菌水、KH2PO4、CUSO4· 5H2O、KNO3 、MES 、CaCl2·2H2O 、甘露醇、MgSO4·7H2O、KI、纤维素酶R-10、果胶酶等 （2） CPW 培养基
CPW 50ml/组 ，高压灭菌 ，组成成分：
KH2PO4 27.2mg/L CUSO4· 5H2O 0.025mg/L
KNO3 101mg/L MES 5 mmol /L CaCl2·2H2O 1.48mg/L 甘露醇 72.9g/L MgSO4·7H2O 246mg/L PH 5.6 KI 0.16mg/L
（3） 胡萝卜原生质体培养基 （PH 5.8）
MS基本培养基+0.4ml/L 葡萄糖+2，4-D 0.5mg/L +NAA 0.2mg/L
调好PH 值的培养基放到高压灭菌锅里灭菌30分钟（温度为121摄氏度），然后分装到6cm的培养皿 ，在无菌超净台存放备用
1.2.2 原生质体游离与培养
（1）酶液的配制
1%纤维素酶R-10+0.1%果胶酶 （以CPW 配制 ，全班 配100ml ） （2）接种
取胡萝卜愈伤组织约1g（愈伤组织尽量夹碎），放入约10ml酶液中，黑暗振荡 （30-50rpm） 4-5小时
（3）原生质体的提纯
将原生质体-酶混合物通过44um不锈钢网过滤，除去未消化的细胞团。过滤后用800rpm离心4min，使原生质体下沉，除去酶液。
去酶液 ，沉淀（原生质体）用10ml的CPW洗涤2次，每次在800rpm离心 4min，
（4）原生质体的培养
5
纯化的原生质体悬浮在2ml 原生质体培养基中，使细胞溶液在1x10个/ml
1.2.3 胡萝卜细胞的生长计量技术
（1）检查血球计数板 在正式计数前，先用显微镜检查计数板的计数室，看是否沾有杂质或干涸的菌体，若有污体，则需作以下步骤清洗：
擦洗 ： 用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室
冲洗 ： 用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分，最后用擦镜纸擦干净 镜检 ： 镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数
（2）加样 先将盖玻片安放在计数室上，然后摇匀样品，吸取细胞悬浮液一滴至计数板上，将盖玻片由一边向另一边轻轻盖上，再用两只拇指紧压盖玻片两边，使盖玻片和计数板紧密结合，以防形成气泡。数分钟后，细胞沉降至载玻片表面，即可在显微镜下计数。 （3）计数 将加好样品的计数板至于显微镜的载物台中央，然后按照下列步骤操作： 找计数室 ：先在低倍镜下寻找计数板上的大方格位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。
转换高倍镜 ：转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野上。 计数 ：
5
1ml悬浮液中的原生质体数 =个大格中的细胞数x10x1000=51x10x1000=5.1x10个 （4）清洗
计数完毕后，计数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，再用擦镜纸擦干净
二 结果与分析
1. 计数室中一个大格的细胞数量
次数 1个大格的细胞数（个）
1 51
2 49
3 56
平均数 52
5
1ml悬浮液中的原生质体数 =个大格中的细胞数x10x1000=51x10x1000=5.1x10个
本组实验结果为在计数室中一个大格中的细胞数为52个，1ml悬浮液中的原生质体数为
5
5.2x10个，介于一个大格中的细胞数介于10个到100个的密度。
2. 讨论
为防止原生质体在失去细胞壁的负压下吸水膨胀破裂。酶解液以及原生质体起始培养液要保持较高的渗透压。.由于细胞吸收营养物质的同时，还吸收了更多的水分；另外，细胞产生的大量代谢废物也会排入培养基。细胞数目逐渐增加，需要的营养物质越来越多。这些原因造成培养基渗透压（浓度）过高、营养物质缺乏，所以要定期添加新鲜的。
实验六 玉米幼胚接种
摘要
以玉米幼胚作为外植体,研究了基因型、培养基和激素对玉米幼胚愈伤组织的诱导及植株再生的影响。结果表明，供试材料均能进行愈伤组织的诱导，相同自交系在MS和N6不同培养基上胚性愈伤的诱导率存在显著或极显著的差异。并发现N6A培养基为供试材料的最适培养基，18—599（红）为胚性愈伤诱导率最高的基因型。研究的结果还表明，不同基因型要求的最适培养基存在差异， 2,4-D在愈伤组织的诱导中起着关键性作用，NAA的添加不能显著提高愈伤组织的诱导率。
关键词
幼胚 愈伤组织 激素类物质
前言
幼胚培养在远缘杂交、诱导基因转化受体、筛选突变体方面都具有重要的应用价值，因此幼胚培养越来越受到科学家们的关注。幼胚在胚珠中是异养的，需要从母体和胚乳中吸取各类营养物质与生物活性物质，因此进行幼胚培养时，必须通过培养基向它提供足够的营养，并提供适宜的培养条件。
本实验利用玉米幼胚的培养，主要目的是学习和掌握幼胚培养的一般方法，从而可以在现实生活中有所应用。
一 材料与方法
1.1实验材料 玉米幼胚 1.2方法
1.2.1培养基：
1）NB+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 2）N6+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 3）MS+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 4）MB+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 1.2.2比较不同培养基的诱导率
剥去玉米包被→75%酒精清洗→将玉米棒子切成3、4段→75%酒精浸5min→倒去酒精，加0.1%升汞浸泡1min→无菌水冲洗3次→取出切籽粒→挑幼胚→接种于培养基。于25℃暗培养。
二 实验结果
下图为我们组的玉米幼胚接种结果图示
1号 2号 3号 4号
总共有19个幼胚 1 0 0 100% 2 0 25% 75% 3 0 20% 80% 4 0
100%
这个培养基的诱导率为11.25%。从本组实验的结果来看，污染率比较低，说明在无菌操作方面掌握地比较好。尽管污染率低，但是出芽率太高了。
仲恺农业工程学院
课程学习报告
课程名称：细胞工程大实验
学期：2008-2009学年第一学期
实验一 培养基母液和培养基的配制 实验二 水稻及胡萝卜再生体系的建立 实验三 悬浮细胞体系的建立 实验四 植物遗传转化 实验五 原生质体游离与培养 实验六 玉米幼胚接种
院 系： 生命科学学院
班 级： 生物技术081班 姓 名： 钱烈贤 学 号： [1**********]5
实验一 培养基母液和培养基的配制
摘要
为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。各种混合液（母液）或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。
关键词
培养基母液、培养基、无机盐、有机物、激素、附加物
前言
本实验的目的是要学习并掌握培养基母液配制的方法和培养基配制的方法，掌握不同物质浓度按比列稀释和转化的计算方法。
在配制培养基前，先配制单一化合物母液可以提高称量的准确性并减少多次称量的麻烦，配制多种培养基都需要的同一种母液，放置冰箱中保存，用时按比例稀释即可。培养基实际一是一个人工模拟的植物生长、发育环境，在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养万分生长因子、理化环境等主要同培养基提供。不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。另外，组织培养物的脱分化、分化等状态的调控，次生代谢物的产出等都要通过调节培养基成分来实现。
一 材料与方法步骤
（一）试剂
培养基母液（以MS为例）：NH4NO3；KNO3 ；CaCl2.2H2O；MgSO4.7H2O；KH2PO4；(NH4)2SO4；H3BO3；KI；MnSO4.H2O；ZnSO4.7H2O；NaMoO4.2H2O；CuSO4.5H2O；CoCl2.6H2O；Na2EDTA.2H2O；FeSO4. 7H2O；甘氨酸；盐酸吡哆醇；盐酸硫氨素；烟酸；肌醇；2，4—D；6—BA；NAA 培养基：1N HCl ；1N KOH； 标准pH溶液（25℃下，pH4.01和pH6.08的标准溶液各100ml）；蔗糖；琼脂；水解蛋白酶；谷氨酰胺；脯氨酸。 （二）方法步骤
1、培养基母液配制 (1) 大量元素母液
大量元素母液含N、P、K、Ca、Mg、S等六种盐类的混合溶液，可配置10倍或20倍的母液，使用时每配置1000ml培养基时取100ml或50ml母液。
表1 MS培养基大量元素母液制备 序号 药品名称 1 2 3 4 5
NH4NO3 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO4
培养基浓度（mg/L）
1650 1900 440 370 170
扩大10称量(mg)
16500 19000 4400 3700 1700
备注
蒸馏水定容至1000ml
1 将1升培养基所需各种微量元素扩大10倍，进行实际称量。分别称取上述药品：16.5g，19g，4.4g，3.7g，1.7g。
2 将混合液倒入1000ml量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4℃储
存。
（2）微量元素母液
1 按培养基配方所列元素成分，取相应分析纯化学试剂（对水合分子不同的试剂要进行换算）。例如换算MnSO4·4H2O：MnSO4·4H2O分子质量/ MnSO4·7H2O分子质量，再乘以11.15g。
2 将1升培养基所需各种微量元素扩大1000倍，进行实际称量。分别称取上述药品：8.45g，4.3g，3.1g，0.425g，0.125g，0.0125g，0.0125g。
3 将混合液倒入500ml量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4℃储存。
序号 1 2 3 4 5 6 7
化合物名称 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O
H3BO3 KI
Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O
培养基浓度（mg/L）
22.3
8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025
扩大1000倍称量(mg)
22300 8600 6200 830 250 25 25
备注
蒸馏水定容至500ml
（3）铁盐母液
铁盐与其他无机成分混合易产生沉淀，须单独配制。通常采用硫酸亚铁和Na2-EDTA混合物，以形成络合物，提高铁盐的利用率。铁盐一般配成100倍的螯合铁盐母液，使用时每配置1000ml培养基取10ml。
表3 MS铁盐母液的配制 序号 1 2
化合物名称 Na2-EDTA FeSO4·7H2O
培养基浓度（mg/L）
3.73
2.78
扩大100倍称量(mg)
373 278
备注 蒸馏水定容至
100ml
分别称取药品：0.373g，0.278g，置于烧杯中，在沸水浴中加热搅拌20-30min，当出现金黄色时拿出来，调PH至5.5，冷却后倒入棕色瓶保藏。 （4）有机成分母液
有机化合物母液原则上应分别单独配制，实际使用时，往往配制成除肌醇外其他有机成分的混合液，一般配置成100倍或1000倍母液，使用时每配置1000ml培养基取10ml或1ml。
表3 MS培养基有机物质母液的制备 序号 1 2 3 4 5
化合物名称 甘氨酸
盐酸硫胺素(VB1) 盐酸吡哆素(VB6)
烟酸 肌醇
培养基浓度（mg/L）
2 0.4 0.5 0.5 100
扩大100倍称量(mg)
200 40 50 50 10000
备注
蒸馏水定容至1000ml 单独配制
（5）激素母液
激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg/ml到1.0mg/ml不等。 1 2，4－D母液（20 mg／100 ml）：用万分之一天平称取2，4-D 20 mg →用少量95%乙醇充分溶解 → 加水定容为100 ml。
2 6－BA 母液（20 mg／100 ml）：用万分之一天平称取6－BA 20 mg →用少量1N HCl充分溶解 → 加水定容为100 ml。
3 NAA母液（20mg／100 ml）：用万分之一天平称取NAA 20 mg →用少量95%乙醇充分溶解 → 加水定容为100 ml。 2、培养基的配制（300ml） B5培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe盐）+0.5mg/L 2，4-D+7g/L 琼脂 +30g/L
蔗糖，PH=5.8
N6培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe盐）+0.5mg/L 2，4-D+水解蛋白酶500mg/L+
谷氨酰胺700mg/L+脯氨酸700mg/L+7g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，PH=5.8
(1) 混合培养基中的各成分（取母液）：200ml烧杯一只，用50ml量筒量取大量元素20ml（10X），再用移液管分别吸取微量元素2ml（100X），铁盐2ml（100X），有机成分2ml（100X）肌醇2ml（100X）和激素类（浓度临时确定），最后用蒸馏水定容至所需配制的培养基体积的一半。
(2) 溶化琼脂：称取应加的琼脂和蔗糖，加蒸馏水至所需配制的培养基体积的一半，在壁上做一液面记号，放置约0.5-1h，待蔗糖溶解，琼脂发胀后，加热烧开溶化琼脂。若失水，则加蒸馏水至液面记号处。
(3) 混合：把1和2混合在一起，搅匀。
(4) pH值：培养基的pH值会影响植物对养分的吸收与利用，还会影响琼脂等固化剂量的凝固，因此培养基必须调至一定的pH值。用pH计或pH试纸测pH值，并用1N的NaOH或HCl调至pH为5.8。不同植物培养所要求的pH值有所不同。此外，培养基经高压灭菌后pH值一般要降低0.1——0.2，所以在灭菌前调pH值时要相应提高。
(5) 分装：用玻璃漏斗将配好的培养基分装于10个三角瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口或内外壁上，以防引起污染，然后用棉塞或硫酸纸封好瓶口。写明培养基代号，日期，实验人等，扎好线绳。 3、培养基的灭菌
培养基必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，从而导致培养外植体死亡。本实验采用高压蒸汽灭菌法。
二 结果讨论
1、PH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。而这次实验我们实验室里的pH计出现了一些问题，导致测量的pH值有偏差。因此，在实验的时候要注意考虑周全，不能全信仪器的测定，同时也要用PH试纸检验一下，这样就不会使结果出现太大偏差。 2、 琼脂的溶解要注意搅拌均匀才分装，否则就会导致每个培养皿的琼脂含量不等，会出现有的培养皿不凝固的现象。
3、 灭菌时要包扎好，否则取出灭好菌的器皿时会散开。 4蛋白胨很容易吸湿，称取时动作要迅速。
实验二 胡萝卜再生系的建立
摘要
以胡萝卜块根及水稻种子为材料诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转入分化培养基进行培养。结果表明，在试用的培养基中．以2，4-D浓度为0．1mg／L时．愈伤组织状态为最佳；愈伤组织的诱导宜在黑暗条件下；培养基种类时愈伤组织的分化率影响不大，且主要以胚状体形式出芽。
组织培养的物的脱分化、生长及分化均是基因选择地表达和关闭地结果，作为第一信使的植物激素在这些过程中是信号传导地发起者。因此，培养物地生长、分化方向地控制主要是通过添加不同种类和浓度的植物激素来实现的。由外植体诱导愈伤组织是一个脱分化的过程，通常需要加入较高比例的生长类激素，如2，4－D。
关键词
水稻；胡萝卜；愈伤组织；继代
前言
在一定的培养条件下，愈伤组织通过器官发生途径形成芽或根的分生组织，继而发育成完整的植株，或通过体细胞胚胎发生途径形成胚状体，继而发育成完整的植株。由愈伤组织再生植株是一个再分化过程。一般而言，高比例的细胞分裂素/生长素有利于芽的形成；低比例时有利于根的形成。再生植株移至生根培养基上可以生根，生根的小苗经过练苗后可移栽室外培育。本实验的目的是学习利用外植体诱导形成愈伤组织的方法，了解其诱导继继代培养的过程。
一 材料与方法
1.1植物材料 胡萝卜块根
1.2方法
1.2.1愈伤组织诱导 1）外植体的消毒
胡萝卜：将胡萝卜块洗净，削皮、切除两端、切成小块，75%酒精浸泡3分钟，倒掉酒精，无菌水洗1次，用1%HgCl2消毒12分钟，在用无菌水洗3～4次。
水稻：挑选约100粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水洗3～4次 2）接种
胡萝卜愈伤组织诱导培养基为：B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 2，4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8；B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 6-BA0.2mg/l+ 2,4-D0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8；MS(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒后的胡萝卜切除两端和外层部分，切成0.5～1mm左右的小圆片，切下形成层部分，并切成长2mm宽1.5的小长块，接种于诱导培养基上（三角瓶和平板培养基），25℃暗培养。
水稻愈伤组织诱导培养基为：N6(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D2mg/L+水解酪蛋白500mg/L＋脯蛋白700mg/L+谷氨酰氨700mg/L＋蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒
的种子接种在上述培养基中（三角瓶和平板），25℃暗培养。 1.2.2胡萝卜愈伤组织的继代与分化 1) 培养基的配制
胡萝卜愈伤组织继代培养基（pH5.8）
B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 2，4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L 胡萝卜愈伤组织分化培养基 （PH 5.8-6.0） 150ml/组 ① MS+蔗糖30g/L +琼脂7g/L
② MS+BA 1.0 mg/L +蔗糖30g/L +琼脂7g/L
③ MS +BA 1.0 mg/L +NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L +琼脂7g/L ④ MS+ BA 3.0 mg/L +NAA1.0mg/L +蔗糖30g/L +琼脂7g/L
⑤ MS+ BA 1.0 mg/L +NAA0.5mg/L +水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L ⑥ MS+ BA 3.0 mg/L +NAA1.0mg/L +水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L ⑦ B5+ BA 3.0 mg/L +NAA1.0mg/L +水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖30g/L +琼脂7g/L 2) 诱导3周后的愈伤组织在灭菌的培养皿上切成小块，接入继代培养基中。三周左右观察生长状态。
3) 胡萝卜愈伤组织继代：
污染率=（污染外植体块数/接种的外植体块数）×100%
诱导率=（形成愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数）×100%
4) 胡萝卜愈伤组织的分化
出绿率=（出现的愈伤块数/接种分化的总块数）×100% 分化率=（分化组织的愈伤块数／接种分化的总块数）×100%
二 结果与分析
1. 胡萝卜愈伤组织的诱导率和污染率
培养基种类
B5(MS)+2,4-D 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L B5(MS)+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L
B5(MS)+2,4-D 0.1mg/L+BA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L B5(MS)+2,4-D 0.5mg/L+BA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L
污染率（%）
诱导率（%）
100 75 100 100
0 25 0 0
2. 胡萝卜愈伤组织继代
继代前 继代后
3. 胡萝卜愈伤组织分化
1 号 2 号 3号
总共有接了17个胡萝卜愈伤组织
培养瓶 1 2 3
污染率 0 0 0
出绿点率 60% 25% 14.3%
出芽率 20% 50% 14.3%
这个培养基的出绿点率为33.1%，出芽率为28.1%。 4. 本组实验结果
本组在本次实验中胡萝卜愈伤组织的诱导的感染率为100%。分析其原因，第一，因为超净工作台上太多人一起操作，导致环境较差，较易污染实验材料。第二，外植体的消毒可能不够彻底。由于操作有失误，无菌水的浸泡次数不够，只有三次。第三，镊子和刀在火上烧得太热，在灭过菌的带滤纸的培养基上预冷不够就直接接触实验材料，导致胡萝卜的灼伤。第四，因为本着学习的态度，所以我们每个组员都有去亲自操作接培养基，由于每个人的手法不同，也会容易引起污染。这些原因都是我们组污染率较高的原因。
实验三 悬浮细胞体系的建立
摘要
本实验从建立稳定的水稻悬浮细胞系开始，将悬浮细胞分别转入分化培养基进行培养，水稻愈伤组织分化的培养基是N6。植物细胞悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中于摇床上进行培养增殖的无菌培养技术，在培养过程中能够保持良好的分散状态。目前这项技术已广泛用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
关键词
愈伤组织 悬浮细胞系 继代 分化
前言
一个成功的悬浮细胞系必须具备以下条件：（1）悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30-50个细胞下，在实际培养中很少有由单细胞组成的植物细胞悬浮系。（2）均一性好，细胞形状和细胞大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色彩呈鲜艳的乳白或蛋黄色。（3）细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般为2-3天或更短时间内细胞数量更加一倍。
使悬浮系分散的基本方法有：（1）选择松散易碎的愈伤组织进入悬浮培养。（2）高auxin/cytokinin的比例，或完全去除cytokinin。（3）使用更强的auxin，如将IAA改为NAA，NAA改为2，4-D。（4）加少量的cellulase(0.1%)/pectinase(0.05%).（5）粗研愈伤组织使之成为较小的细胞团再进行悬浮培养。（6）固-液反复交替培养。（7）选择继代。
本实验的目的是了解植物悬浮细胞培养过程，掌握悬浮细胞系建立和继代保持的方法。
一 材料与方法
1.1实验材料
水稻种子 水稻愈伤组织 1.2方法
1.2.1水稻愈伤组织诱导 1）外植体的消毒
挑选约100粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用0.1%升汞消毒12分钟，然后用无菌水洗3～4次 2）接种
水稻愈伤组织诱导培养基为：N6(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D2mg/L+水解酪蛋白500mg/L＋脯蛋白700mg/L+谷氨酰氨700mg/L＋蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L ，pH 5.8。将消毒的种子接种在上述培养基中（三角瓶和平板），25℃暗培养。 1.2.2愈伤组织的继代
将无菌的水稻愈伤组织接种在MS(大量,微量,有机,肌醇,铁盐)+水解蛋白酶300mg/L+6-BA3mg/L + NAA 1mg/L +蔗糖（30g/L）+琼脂7g ，PH 5.8的培养基中（平板和三角瓶），25℃光培养。 1.2.3愈伤组织的分化
取上述三角瓶继代培养的水稻愈伤组织继续在25℃下光培养。 1.2.4水稻悬浮体系的建立 1）培养基
（1）MS + 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（2）N6+ 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯
氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（3）MB + 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8；（4）NB+ 2 ,4 -D 2.5 mg/L +蔗糖30g/L＋谷氨酰胺500 mg/L+脯氨酸500 mg/L +水解酪蛋白500 mg/L pH 5.8。 2）接种
挑选疏松，生长旺盛的水稻愈伤组织1～2g放入盛有30ml液体培养基的100mL三角瓶中；用镊子轻轻捏碎愈伤，增加细胞的分散程度；把培养基放入温度为25℃的摇床中进行暗培养，转速为160r/min，观察悬浮细胞系的生长状态。 1.3.2水稻悬浮体系的继代
培养一段时间后，待有新的愈伤组织长出，在无菌工作台上将各种培养基倒掉一半，用镊子夹除较大块的愈伤组织，分别加入各种新的培养基，用锡箔纸盖好，继续放入温度为25℃的摇床中进行暗培养，转速为160r/min，观察悬浮细胞系的生长状态。
二 结果与分析
下图为我组的水稻愈伤组织的结果示意图，总共接种了4个三角瓶十九个水稻种子，都没有污染，因此，污染率为0，诱导率未100%。
水稻愈伤组织的诱导
悬浮培养
继代后培养
培养基种类
MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L MS+2,4-D 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L MS+脯氨酸0.7g/l+谷氨酰胺0.7g/L+水解酪蛋白0.5g/L+2,4- D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L MS+脯氨酸0.7g/l+谷氨酰胺0.7g/L+水解酪蛋白0.5g/L+2,4- D 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L
接种数 27 38 24 36
愈伤个数 17 27 11 29
诱导率 62.96% 71.05% 45.83% 80.56%
1. 水稻愈伤组织诱导统计表
由上表我们可以得出，MS+脯氨酸0.7g/l+谷氨酰胺0.7g/L+水解酪蛋白0.5g/L+2,4- D 4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基的诱导率是最高的，所以这个培养基相对来说是最适合水稻愈伤组织的诱导的。
实验四 植物遗传转化
摘要：研究胡萝卜胚胎发生过程的基因表达变化具有重大的理论和实际意义。目前通过遗
传转化技术获得了许多植物的转基因植株，一些重要农作物转基因新品种已进入产业化阶段，展现出极好的应用前景。本实验依据T-DNA能自由转移的特征采用农杆菌介导法来将外源基因导入胡萝卜愈伤细胞，再继续进行愈伤组织培养，实验胡萝卜的遗传转化。
关键词
胡萝卜愈伤组织 农杆菌 介导法 遗传转化 Ti质粒
前言
农杆菌介导法相对于其他转化法而言，具有明显的优点：①农杆菌介导水稻转化时，外源基因多以单拷贝或低拷贝数插入，并优先插入转录活性区域，因较少出现基因沉默现象；②转化效率高，双子叶植物可达80%-90%，单子叶如水稻也可达20%-30%，这可能与T-DNA链在转移过程中受到蛋白质（VirE2、VirD2）的保护及其定向作用，不易被细胞内核酸酶降解有关；③T-DNA具有左右边界，转移的是位于左右边界的外源片段，故导入细胞的目的片断明确；④可以转移大片断DNA，并可以稳定整合到基因组中；⑤转化植株通常可育，大多数呈孟德尔式遗传；⑥方法简单、有效；⑦转基因植株很少出现形态变异。
影响根瘤农杆菌介导植物转化的因素很多，主要影响因素有：植物品种；农杆菌侵染的植物组织的生理状态的选材；培养基的组成成分；农杆菌菌株和载体；转化体的筛选；启动子；其他处理的影响等。
本实验的目的是为了了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握农杆菌介导植物遗传转化的基本操作技术。
一 材料与方法 1材料与方法
1.1实验材料：胡萝卜愈伤组织 1.2仪器设备及用具
仪器：超净工作台，摇床，培养箱，高压灭菌锅，ph酸度计，培养室等 用具：无菌培养皿，无菌三角瓶，镊子，移液枪，无菌水 试剂及培养基 1.3试剂
无菌水，培养基母液，头孢唑啉钠，羧苄西林钠，潮霉素，卡那霉素，Basta，乙酰丁香酮（AS），蔗糖，麦芽糖等 1.4 培养基
（1）LB培养基：15g/L Yeasr Extract+10g/L Trypton+10g/L NaCl pH 7.0 （2）农杆菌悬浮培养基：B5基本母液+（0.1μM）AS pH 5.0
（3）共培养培养基：B5基本母液+（0.1μM）AS pH 5.5 （4）筛选培养基：B5基本母液+头孢+羧苄+潮霉素 pH 5.8 （5）预分化培养基：
B5+30g/L蔗糖+cefo100mg/L+carb100mg/L+Basta 0.5mg/L+琼脂7g/L pH 5.8 （6）分化培养基： MS+Bastas 0.5mg./L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L pH 5.8 （7）生根培养基：1/2MS培养基+Basta 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L pH 5.8
1.3实验方法
1. 愈伤组织的诱导，继代….取实验室已有的胡萝卜愈伤组织 2. 农杆菌的活动，悬浮
挑去-70°保存的农杆菌转化子在YEP培养基（含25μg/ml kan和25μg/mlStr）上划线培养，28°C，暗室培养3天，取单菌落涂布于加有相同抗生素的YEP培养基上，28°C，暗培养2天，用勺子刮取一定量的农杆菌悬浮于加有100uM乙酰丁香酮的AAM或B5液体培养基中，使OD600为0.8—1.0，放置或摇床摇动培养1-2小时后用于愈伤组织的浸染。…..取用实验员已准备好的农杆菌 3. 愈伤组织的浸染及共培养
挑选颜色鲜艳，生长旺盛的胚性愈伤组织，将愈伤组织和农杆菌菌液按一定的比例混合，浸染20分钟，期间摇动几次。取出愈伤组织，并用灭菌的带滤纸的培养皿吸去多余的菌液。将愈伤组织接到加有一张滤纸的共培养基上，26°C，暗培养2-3天。
二 结果与分析
上图示，实验已成功的转化目的基因潮霉素到胡萝卜愈伤组织细胞中，筛选出含有目的基因潮霉素的愈伤组织细胞，可进行继代培养。
实验五 原生质体游离与培养
摘要
原生质体培养是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗，最终再生成完整植株。一般用酶解去壁法获得原生质体。本实验以胡萝卜愈伤组织进行原生质体游离。
关键词
原生质体 游离 细胞密度 细胞计数
一 材料与方法
1.1植物材料 胡萝卜愈伤组织 1.2方法
1.2.1实验用具和试剂的准备 （1） 实验用具和试剂
灭菌的4个6cm培养皿/组 、2根10ml离心管/组 、5ml枪头 10 根/组 、1个细胞筛/2组 、1ml枪头 1盒/组 和细菌过滤器 2个/组 （中间加细菌过滤纤维膜）
250ml三角瓶、玻璃棒、精密PH试纸、电子天平、酒精灯、打火机、滴管、移液管、锡箔纸、封口纸、记号笔、血球计数板、载玻片、盖玻片、显微镜、离心机等
实验试剂: MS 培养基母液、2，4-D 0.2mg/ml，NAA 0.2mg/ml ,1M NAOH ，1M HCL .，葡萄糖 、无菌水、KH2PO4、CUSO4· 5H2O、KNO3 、MES 、CaCl2·2H2O 、甘露醇、MgSO4·7H2O、KI、纤维素酶R-10、果胶酶等 （2） CPW 培养基
CPW 50ml/组 ，高压灭菌 ，组成成分：
KH2PO4 27.2mg/L CUSO4· 5H2O 0.025mg/L
KNO3 101mg/L MES 5 mmol /L CaCl2·2H2O 1.48mg/L 甘露醇 72.9g/L MgSO4·7H2O 246mg/L PH 5.6 KI 0.16mg/L
（3） 胡萝卜原生质体培养基 （PH 5.8）
MS基本培养基+0.4ml/L 葡萄糖+2，4-D 0.5mg/L +NAA 0.2mg/L
调好PH 值的培养基放到高压灭菌锅里灭菌30分钟（温度为121摄氏度），然后分装到6cm的培养皿 ，在无菌超净台存放备用
1.2.2 原生质体游离与培养
（1）酶液的配制
1%纤维素酶R-10+0.1%果胶酶 （以CPW 配制 ，全班 配100ml ） （2）接种
取胡萝卜愈伤组织约1g（愈伤组织尽量夹碎），放入约10ml酶液中，黑暗振荡 （30-50rpm） 4-5小时
（3）原生质体的提纯
将原生质体-酶混合物通过44um不锈钢网过滤，除去未消化的细胞团。过滤后用800rpm离心4min，使原生质体下沉，除去酶液。
去酶液 ，沉淀（原生质体）用10ml的CPW洗涤2次，每次在800rpm离心 4min，
（4）原生质体的培养
5
纯化的原生质体悬浮在2ml 原生质体培养基中，使细胞溶液在1x10个/ml
1.2.3 胡萝卜细胞的生长计量技术
（1）检查血球计数板 在正式计数前，先用显微镜检查计数板的计数室，看是否沾有杂质或干涸的菌体，若有污体，则需作以下步骤清洗：
擦洗 ： 用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室
冲洗 ： 用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分，最后用擦镜纸擦干净 镜检 ： 镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数
（2）加样 先将盖玻片安放在计数室上，然后摇匀样品，吸取细胞悬浮液一滴至计数板上，将盖玻片由一边向另一边轻轻盖上，再用两只拇指紧压盖玻片两边，使盖玻片和计数板紧密结合，以防形成气泡。数分钟后，细胞沉降至载玻片表面，即可在显微镜下计数。 （3）计数 将加好样品的计数板至于显微镜的载物台中央，然后按照下列步骤操作： 找计数室 ：先在低倍镜下寻找计数板上的大方格位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。
转换高倍镜 ：转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野上。 计数 ：
5
1ml悬浮液中的原生质体数 =个大格中的细胞数x10x1000=51x10x1000=5.1x10个 （4）清洗
计数完毕后，计数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，再用擦镜纸擦干净
二 结果与分析
1. 计数室中一个大格的细胞数量
次数 1个大格的细胞数（个）
1 51
2 49
3 56
平均数 52
5
1ml悬浮液中的原生质体数 =个大格中的细胞数x10x1000=51x10x1000=5.1x10个
本组实验结果为在计数室中一个大格中的细胞数为52个，1ml悬浮液中的原生质体数为
5
5.2x10个，介于一个大格中的细胞数介于10个到100个的密度。
2. 讨论
为防止原生质体在失去细胞壁的负压下吸水膨胀破裂。酶解液以及原生质体起始培养液要保持较高的渗透压。.由于细胞吸收营养物质的同时，还吸收了更多的水分；另外，细胞产生的大量代谢废物也会排入培养基。细胞数目逐渐增加，需要的营养物质越来越多。这些原因造成培养基渗透压（浓度）过高、营养物质缺乏，所以要定期添加新鲜的。
实验六 玉米幼胚接种
摘要
以玉米幼胚作为外植体,研究了基因型、培养基和激素对玉米幼胚愈伤组织的诱导及植株再生的影响。结果表明，供试材料均能进行愈伤组织的诱导，相同自交系在MS和N6不同培养基上胚性愈伤的诱导率存在显著或极显著的差异。并发现N6A培养基为供试材料的最适培养基，18—599（红）为胚性愈伤诱导率最高的基因型。研究的结果还表明，不同基因型要求的最适培养基存在差异， 2,4-D在愈伤组织的诱导中起着关键性作用，NAA的添加不能显著提高愈伤组织的诱导率。
关键词
幼胚 愈伤组织 激素类物质
前言
幼胚培养在远缘杂交、诱导基因转化受体、筛选突变体方面都具有重要的应用价值，因此幼胚培养越来越受到科学家们的关注。幼胚在胚珠中是异养的，需要从母体和胚乳中吸取各类营养物质与生物活性物质，因此进行幼胚培养时，必须通过培养基向它提供足够的营养，并提供适宜的培养条件。
本实验利用玉米幼胚的培养，主要目的是学习和掌握幼胚培养的一般方法，从而可以在现实生活中有所应用。
一 材料与方法
1.1实验材料 玉米幼胚 1.2方法
1.2.1培养基：
1）NB+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 2）N6+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 3）MS+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 4）MB+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L pH5.8 1.2.2比较不同培养基的诱导率
剥去玉米包被→75%酒精清洗→将玉米棒子切成3、4段→75%酒精浸5min→倒去酒精，加0.1%升汞浸泡1min→无菌水冲洗3次→取出切籽粒→挑幼胚→接种于培养基。于25℃暗培养。
二 实验结果
下图为我们组的玉米幼胚接种结果图示
1号 2号 3号 4号
总共有19个幼胚 1 0 0 100% 2 0 25% 75% 3 0 20% 80% 4 0
100%
这个培养基的诱导率为11.25%。从本组实验的结果来看，污染率比较低，说明在无菌操作方面掌握地比较好。尽管污染率低，但是出芽率太高了。