木质素降解研究

本科毕业论文

木质素降解的研究

LIGINI DEGRADATION OF RESEARCH

学院（部）：化学工程学院

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指导教师：

2012 年 3 月 26 日

木质素降解的研究

摘要

评述了木质生物降解的最新研究进展，主要包括木质素的生物降解机制、降解木质素的微生物种类及其产生的相关酶类、微生物的代谢调控和分子生物学。此外，对木质素降解生物的实际应用和应用前景也进行了评论。

关键词：木质素；生物降解；秸杆；白腐真菌；环境保护

LIGINI DEGRADATION OF RESEARCH

ABSTRACT

The quality of the wood that the solution of the born down new grind investigate into the exhibition, The Lord will including wood grain life quality that machine system, drop down solution of grain of wood solution microscopic things kind of class and its production was born of enzyme in close, microscopic content of the generation x the control and points the son born to learn things. The outside, to wood quality grain drop solution which shall be born of border with and should be before using the scene also into the line evaluation theory.

KEYWORDS：wood qualitative element; Born content drop solution; Straw pole; White-rot fungus really; The environment the care

摘要 ............................................................................................................................................................ - 2 - 绪论 .......................................................................................................................................................... - 2 -

1．简介 ...................................................................................................................................................... - 3 -

1.1基本概念 ...................................................................................................................................... - 3 -

1.2单体与结构 .................................................................................................................................. - 3 -

1.3发展前景 ...................................................................................................................................... - 4 -

2.木质素的降解简略 ................................................................................................................................. - 4 -

2.1概况 .............................................................................................................................................. - 4 -

2.2木质素的结构特点 ...................................................................................................................... - 5 -

3.木质素降解微生物的种类 ..................................................................................................................... - 5 -

3.1三种重要木质素降解酶 .............................................................................................................. - 6 - I．木质素过氧化物酶(LiP) ...................................................................................................... - 6 - II．锰过氧化物酶(MnP) ........................................................................................................... - 8 - III．漆酶 .................................................................................................................................... - 9 -

3.2 三种木质素降解酶协同作用 ................................................................................................. - 10 - 4 应用全景 .............................................................................................................................................- 11 -

4.1 木质素降解酶的全景 ..............................................................................................................- 11 -

4.2 木质素降解酶的特性 ............................................................................................................... - 12 -

4.3 木质素的降解微生物的酶活性调控机理 ............................................................................. - 14 -

4.4 木质素的生物降解的应用 ................................................................................................... - 16 - 结论 ........................................................................................................................................................ - 18 - 参考文献 .................................................................................................................................................. - 19 -

谢辞 ............................................................................................................................................................... 2

绪论

木质素资源十分丰富，是植物光合作用制造的总量仅次于纤维素的有机化合物，估计全球的木质素年产量可达1500 亿t。然而，木质素资源并没有得到有效的利用，大量的木质素作为造纸工业的副产物而排放，不仅是资源的一大浪费，而且严重污染环境。采用物理和化学处理法，可减少约50% 的木质素排放，但治理成本高，易造成二次污染。利用生物技术降解木质素，可以减少环境污染，变废为宝，实现资源再利用。因此，认识木质素的结构特点和了解其生物降解的研究进展，对于木质素资源的合理化利用将具有一定的指导意义。

1．简介

1.1基本概念木质素（lignin）是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。在植物组织中具有增强细胞壁及黏合纤维的作用。其组成与性质比较复杂，并具有极强的活性。不能被动物所消化，在土壤中能转化成腐殖质。如果简单定义木质素的话，可以认为木质素是对羟基肉桂醇类的酶脱氢聚合物。它含有一定量的甲氧基，并有某些特性反应。木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用。在木本植物中，木质素占25%，是世界上第二位最丰富的有机物(纤维素是第一位)。

1.2单体与结构

包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质，并使这些细胞具有特定显色反应（加间苯三酚溶液一滴，待片刻，再加盐酸一滴，即显红色）的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。

木质素在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中则很少见含有。一般存在于豆类、麦麸、可可、巧克力、草莓及山莓的种子部分之中。其最重要的作用就是吸附胆汁的主要成分胆汁酸，并将其排除体外。

1.3发展前景随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入 ,天然高分子所具有的可再生、可降解等性质日益受到重视。废弃物的资源化与可再生资源的利用 ,是当代经济与社会发展的重大课题 ,也是对当代科学技术提出的新要求。在自然界中 ,木质素的储量仅次于纤维素 ,而且每年都以500 亿吨的速度再生。制浆造纸工业每年要从植物中分离出大约 1.4 亿吨纤维素 ,同时得到 5000万吨左右的木质素副产品,但迄今为止 ,超过95 %的木质素仍以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉 ,很少得到有效利用。

化石能源的日益枯竭、木质素的丰富储量、木质素科学的飞速发展决定木质素的经济效益的可持续发展性。木质素成本较低，木质素及其衍生物具有多种功能性，可作为分散剂、吸附剂/解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂，木质素对人类可持续发展最为重大贡献就在于提供稳定、持续的有机物质来源，其应用前景十分广阔。

研究木质素性能和结构的关系，利用木质素制造可降解、可再生的聚合物。木质素的物化性能和加工性能、工艺成为目前木质素研究的障碍。

2.木质素的降解简略

2.1概况

绿色植物占地球陆地生物量的 95% ，其化学物质组成主要是木质素、纤维素和半纤维素，它们占植物干重的比率分别为15%～20% 和20% 。农作物秸杆是这类生物质资源的重要组成部分，全世界年产量为20 多亿吨，而我国为 5 亿多吨。但是，要充分、有效地利用这类资源却相当困难，这是由于秸秆产量随季节变化，且量大、低值、体积大、不便运输，大多数动物都不能消化其木质纤维素，自然降解过程又极其缓慢，导致大部分秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的环境污染和浪费。存在于秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解，主要是因纤维素的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致。木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使酶不易与纤维素分子接触，而木质素的非水溶性、

化学结构的复杂性，导致了秸秆的难降解性。所以，要彻底降解纤维素，必须首先解决木质素的降解问题。

2.2木质素的结构特点

木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键联接的复杂的无定形高聚物，，难以被酸水解，是天然高聚物中最难搞清楚的一个领域 ’ 其原因有两个方面，一是木质素的结构单元之间除醚键联接外还有 C—C 键；另一方面是不可能把整个木质素分子以其完整状态分离出来。

典型木质素是由松柏醇（Conifery alcohol），芥子醇（Sinapyl alcohol）和对—香豆醇（p-Coumaryl alcohol））这3 种不同的醇作为先体结构物质组成基本的结构单元，这些木质素结构单元常常以它们的糖苷形式贮存在细胞中，一旦需要合成木质素，它们便从这些糖苷中释放出来 ’ 这些木质素结构单元之间主要是通过醚键和碳碳键的方式联接 % 醚键包括酚醚键、烷醚键和二芳醚键。在酚醚键中愈创木基-甘油-β-芳基醚键（β-0-4）数量最多，占酚醚键的1/2左右，其次是愈创木基-甘油-α-芳基醚键（β-0-4）。而木质素的C-C键的连接类型主要有β-5，β-β，β-1，β-2和

5-5.

3.木质素降解微生物的种类

3.1三种重要木质素降解酶

木质素是造纸工业排放黑液COD 和色度形成的主要原因, 其结构是由甲氧基取代的对- 羟基肉桂酸聚合而成的异质多晶三维多聚体, 分子间多为稳定的醚键、C- C 键, 是目前公认的微生物难降解芳香化合物之一。自1934 年Boruff 和Buswell 首次发现能降解木质素的微生物种群, 人们对木质素的生物降解进行了大量研究, 1983 年和1984 年发现了木质素过氧化物酶(LiP) 和锰过氧化物酶( MnP) , 由日本吉田首次在生漆中发现的漆酶( Laccase) , 也始终引起着人们的关注。这三种酶被公认为是木质素重要的降解酶。

I.木质素过氧化物酶(LiP)

I.I分布及种类

LiP 是第一个从黄孢原毛平革菌( Phanerochaetechrysosporium) 发现的木质素降解酶, 在木质素降解中起关键性作用。LiP 的产生菌在自然界分布相当广泛, 许多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以产生LiP, 主要产生菌见表1

I.II 结构及特点

LiP 代表一系列含Fe3+ 、卟啉环( IX) 和血红素附基的同工酶, 由不同微生物产生的酶的种类和理化性质各不相同。LiP 是一种带有糖基的胞外血红蛋白, 晶体结构已有报道, 确定血红素( heme) 埋在蛋白质内, 可连接至少一个VA。木质素大分子不能接近该酶的活性中心, 其结合位点是一段有序的糖残基, 位于接近活性中心通道表面的裂缝中。光谱学研究表明LiP 有五种氧化状态, 自然状态LiP 含有高自旋Fe3+ , 被H2O2 氧化两个电子后形成LiP I( 氧带铁卟啉环自由基含 + Fe4+ ) , LiP I 经单电子还原形成LiP II( 氧带铁卟啉环含Fe4+ ) , 再经一次单电子还原, 回到自然状态,His82在活性中心通道表面的裂缝的开口处,Trp170在酶蛋白表面, 其电子传递可能有两个不同的途径: 底物- His82- Ala83- Asn84- His47- Heme 或底物-Trp170- Leu171- Heme。

LiP 的特点是能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物, 在通过电子传递体攻击木质素时, 它能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子, 将其氧化成自由基, 继而

以链式反应产生许多不同的自由基, 导致木质素分子中主要键断裂。此过程需要H2O2 的驱动, 反应如下:

LiP+ H2O2→ LiP I+ H2O

LiP I+ SH2 → SH + LiP II

LiP II+ SH2 → SH + LiP

2SH ·+ 2木质素→2木质素自由基+ 2SH2

其中, SH2 为专一电子传递体。H2O2 可由白腐菌胞内H2O2 产生酶系产生, 且其胞内

还存在过氧化物水解酶, 保证其不会受到毒害。

I.III 作用机制

木质素分子间主要键型是β- O- 4, β- O- 4 模式复合物中有A, B 两个苯环, 均可被LiP 氧化。LiP 催化β- O- 4 模型物的主要反应是Cα- Cβ 断裂形成VA 和2- 甲氧基苯酚。另一个重要的分支反应是Cα- 氧化产物的形成, 结果表明: Cα- 氧化产物是酚型Cα- 氧合芳香化合物时, 可由漆酶催化, 酚氧化酶介导的氧化反应降解; 当Cα- 氧化产物是非酚型Cα- 氧合芳香化合物时, 由于其非各种氧化酶的底物, 氧化降解非常困难。VA 是LiP 的诱导剂, 还可以保护LiP 不受H2O2 的损害。对VA 的氧化目前认

为主要是由LiP 催化, 过氧化氢离子和H2O 同时参与芳香环的开裂。开环产物可被进一步代谢CO2。整个反应中生成的甲氧基酚衍生物, 由LiP 和漆

酶共同氧化, 形成醌, 在纤维二糖/ 醌还原酶系、芳香环开裂酶系的协同作用下, 生成酚, 最后形成环开裂产物, 进入Kerb 循环, 或者纤维二糖酸内脂的形式进入磷酸戊糖途径, 最终代谢为CO2。而非酚型的芳香醛酸,

由于其氧化还原电位太高, 需先被芳香醛酸还原酶还原成相应的醇, 然后才能被LiP 氧化成开环产物或醌。在木质素的模式复合物中, 已被深入研究的还有β- 1 型, LiP 氧化其它键型如β- 5、β- O- 4 模式复合物, 产物尚未被证实。

I.IV 基因结构及表达

在分子生物学领域, 研究较多的是P .chrysosporium、Trametes versicolor 、Bjerkandera adusta 等。在P. chrysosporium 中已经克隆出至少7 个相近的LiP基因家族, 定名为LiPA- LiPJ, 同源性很高。核型分析表明, 异源真核菌株约含10 个染色体, 而LiP 基因至少被分布在两个染色体上。LiP 序列排列紧密且高度保守, 氨基酸相似性53%~ 98%, 每个LiP 基因编码一个由343~ 345 个氨基酸组成的成熟蛋白质, 分子量约36360~ 36607Da。N 端有一个21 个氨基酸的信号肽, 且有6 或7 个氨基酸的前体肽。已测序的LiP 基因均含有8 或9 个内含子, 大小49~ 78bp, 5'端非编码区包含一个TATA 框( - 66~ -81bp) 和一个CAAT 框( - 107~ - 228bp) 的调节序列。在基因表达方面, 其转录明显受到C, N 水平的影响,LiP 的同工酶种类和数目随培养条件变化而改

变, 至少有五种:H1、H2、H6、H8、H10。其分子量大小、等电点、光谱特性、稳定性均有差别, N 端氨基酸序列也不相同。非限制性N 源条件下, H8 是主要的同工酶, 其cDNA 序列被命名为ML- 1,H2 的表达也稍占优势, 但H6 的表达较限制性N 源条件下大大下降。在异源表达上, 已得到许多重组LiP, 但重组LiP 的功能有所改变, 如催化能力改变, 不再受Mn2+ 抑制等。

II 锰过氧化物酶(MnP)

II.I 分布及种类

MnP 与LiP 一样, 都是代表一系列带有糖基的胞外过氧化物酶, 因二者都含有血红素, 又称血红素过氧化物酶。MnP 的主要产生菌见表2, 主要是一些白腐真菌, 多属担子菌亚门, 无隔担子菌亚纲, 无褶菌目的多孔菌科。

II.II 结构及特点

MnP 的晶体结构中包括17% 的中性糖类和大量酸性氨基酸, 血红素上仅有一个Mn2+ 的结合位点, MnP能将其氧化, 消耗一分子的H2O2, 产生两分子的Mn3+ 。Mn3+ 从MnP 上脱离后, 如果没有合适的螯合物与其结合, 保证其稳定性, 其可以在溶液中发生反应, 生成MnO2。在木质素降解过程中, MnO2 可保护LiP 免受H2O2 的损伤。而在LiP- MnP 组合酶体系中, 高浓度的Mn2+ 或Mn3+ , 加上合适的螯合物, 会导致LiP 的抑制,MnP 的诱导。可见, Mn 对LiP 和MnP 都具有重要的作用, 且作用大小与猛离子的浓度及添加时间有关。MnP 的特点是只能氧化酚型木质素。氧化苯酚的过程中, MnP 和H2O2 的启动下, 氧化Mn2+ 为Mn3+, 然后,Mn3+ 氧化苯酚生成苯氧残基。这与LiP 氧化苯酚的方式有明显不同。

II.III 作用机制

MnP 降解木质素的作用机制尚不清晰, 目前认为是一个循环催化过程见图1, AH 代表酚型底物。随着研究的逐渐深入, 它在木质素降解过程中的作用越来

越受到重视。

II.IV 基因结构及表达

从P . chrysosporium 的胞外液中分离出至少六种MnP 的同工酶, 均由多基因编码。通过全部RNA 的反转录PCR, 能得到MnP 的三个不同基因的mRNA:MnP1、MnP2、MnP3。静置培养条件下, MnP2 是主要的MnP 表达基因, 而搅拌培养时, MnP1 是主要的表达基因,MnP3 的表达较稳定。MnP 基因有6 或7 个内含子,N 端有21 或24 个氨基酸的信号肽, 但无前体肽。活性位点附近的序列非常保守, MnP 的5 非编码区包括1个TATAA 单元( - 81bp) 及3 个反向的CCAAT 单元。启动区包括大量热休克元件和序列, 这些元件与哺乳动物金属硫蛋白基因中的金属调节元件相同[ 4~ 5] 。

在基因表达方面, MnP 的产生明显依赖Mn2+ 浓度、培养基、热休克、C 和N 源变化, 且调节是在转录水平上。菌株P . chrysosporium OGC101 MnP1 编码一个357 个氨基酸的成熟蛋白, 内含子6 个, 大小57~ 72bp。

III 漆酶

III.I 分布及种类

1883 年漆酶被首次发现, 一百多年来, 人们通过大量研究发现漆酶广泛存在于多种植物和菌类的分泌物中。在真菌中, 漆酶大多分布在担子菌( Basidimycetes ) 、多孔菌( Polyporus ) 、柄孢壳菌( Podospora ) 等中。此外,一些动物肾脏和血清中也发现了漆酶, 近来, 人们发现一些细菌也能产生漆酶[ 6], 如生脂固氮螺菌( Azospirillum lipof erum) 。漆酶的主要高产白腐真菌王佳玲等曾作过统计。 III.II 结构与特点

漆酶的分子量在64 ~ 390kD 之间, 除Podosp oraanserina 产生的一种漆酶是四聚体外, 其它漆酶一般是单一多肽, 由约500 个氨基酸组成。不同种类的漆酶含铜数并不相同。一般含有四个铜离子, 根据光谱和磁性特征可分为三类: I型Cu2+ 一个, 单电子受体, 顺磁性, 蓝色, λ614nm 处有特征吸收蜂; II型Cu2+ 一个, 单电子受体, 顺磁性, 非蓝色, 无特征, 吸收光谱; III 型Cu24+ 两个, 双电子受体, 反磁性, 是偶合的离子

对( Cu2+ - Cu2+ ) , λ330nm 处有宽的吸收带。漆酶的三维结构尚不清晰, 但证实铜离子位于酶的活性部位, 在催化氧化过程中起决定性作用。漆酶是单电子氧化还原酶, 据统计它催化氧化的底物达250 多个, 最重要的是酚及其衍生物, 约占其底物总数的一半。此外漆酶还能催化芳胺、羧酸及其衍生物, 甾体激素和其它非酚类底物, 如抗坏血酸等。

III.III 作用机制

漆酶是一类以O2 为电子受体的蛋白酶, 对其作用机理, 目前研究较透彻的是其催

化多酚化物如氢醌, 此过程须经过四次单电子传递。首先, 底物氢醌向漆酶转移一个电子, 生成半醌- 氧自由基中间体。而后, 两分子半醌生成一分子氢醌和一分子苯醌, 氧自由基中间体还能转变成碳自由基中间体, 它们可以相互结合或相互偶连, 故在菌体内, 漆酶与其它氧化木质素酶系协同降解木质素。而在体外实验中, 木质素单体在Laccase/ O2 条件下会发生聚合反应。O2 存在条件下,还原态漆酶被氧化, O2 被还原成水, 此过程是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的:

Cu2+ Cu2+ Cu24+→2e底物→Cu+ Cu+ Cu24+→分子内电子转移→Cu2+ Cu2+ Cu22+→2e底物→Cu+ Cu+ Cu2+→2H+

O2H2O 快→Cu2+ Cu2+ ( Cu2O) 3+→2H+H2O 慢→Cu2+ Cu2+ Cu24+

III.IV 基因结构及表达

漆酶是由一个结构相近的基因家族编码, 许多真菌的漆酶基因已被克隆和测序, 如Agaricus bisporus 、Neurospora crassa。从Coprinus cinerens 中克隆出3 个漆酶基因Lcc1、Lcc2 和Lcc3。其中Lcc1 含7 个内含子, 大小为54~ 70bp, 成熟蛋白约521 个氨基酸, 有三个潜在的N- 连接糖基化位点, C 端有23 个氨基酸的延伸序列, 富含Arg 和Lys, 其酶蛋白成熟至少需剔除信号肽、前体肽和C 端延伸区。Lcc2 和Lcc3 均有13 个内含子,表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80% 。Lcc3 和Lcc1的氨基酸同源性58% , Lcc2 和Lcc1 的氨基酸同源性59%, 而Lcc3 与Aspergillus nidulan 漆酶的氨基酸同源性只有18%。因此, 异源真菌漆酶之间的氨基酸同源性较低, 但在铜结合区具有较高保守性。

在异源表达上, 曲霉是一个很好选择, A. oryazeTATAamylase 和Pichia past i 系统已成功表达若干不同来源的漆酶, Lcc1 在米曲霉中表达成功, 90% 以上的转化体表现出漆酶活性, 目前, 已有许多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表达。

3.2 三种木质素降解酶协同作用

对上述三种酶的研究主要集中在液体培养方式上, 结果显示采用静置培养, 深层培养利于酶的产生。已证明, 木质素降解酶活性受C 源、N 源、微量元素、诱导物、培养温度和pH 值等因素影响。而P.cinnabarinus 的漆酶产量却不受一些小分子芳香化合物的诱导。确定单一一种酶在木质素降解中的功能非常困难, 因为每一种白腐菌所产生的都不是一种木质素降解酶, 如Laccase 和MnP 单独存在都不能很好的降解木质素, 而两种酶同时存在时, 木质素却能得到很好降解, 表明两种酶具有协同作用。有趣的是当体系中一些条件变化时, 体系中的两种或几种木质素降解酶会发生相互抑制现象, 如液体培养条件下, Mn2+ 浓度增加会导致LiP 活力大大降低, 而MnP 和Laccase 的活力

却相应增加, 这启示我们这种协同作用可能存在正负两种机制。不同白腐菌木质素降解酶系的组成大不相同, 可分为四类: LiP - MnP, 如P . chrysosporium;

LiP_MnP_Laccase, 如Trametes gibbosa; MnP_Laccase, 如Lentinula

edodes ;LiP_Laccase, 如Pleurotus ostreatus 。最新研究表明, 不同降解酶系成分之间的比例将直接影响木质素降解效果。各种酶系具体如何分工协作降解木质素, 尚不清楚, 将是今后研究的一个热点。

4 应用全景

4.1 木质素降解酶的全景

在自然界中，能降解木质素并产生相应酶类的生物只占少数。木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果，其中真菌起着主要作用。降解木质素的真菌根据腐朽类型分为：白腐菌 —— — 使木材呈白色腐朽的真菌；褐腐菌 —— — 使木材呈褐色腐朽的真菌和软腐菌。前两者属担子菌纲，软腐菌属半知菌类。白腐菌降解木质素的能力尤于其降解纤维素的能力，这类菌首先使木材中的木质素发生降解而不产生色素。而后两者降解木质素的能力弱于其降解纤维素的能力，它们首先开始纤维素的降解并分泌黄褐色的色素使木材黄褐变，而后才部分缓慢地降解木质素。白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，因此被认为是最主要的木质素降解微生物。

目前，研究最多的白腐菌有：黄孢厚毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)、彩绒草盖菌（Coridus versicolor）、变色栓菌（Thametes versicolor）、射脉菌（Phlebia radiata）、凤尾菇（Pleurotus pulmononanus）、朱红密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）等.这些菌多属于担子菌亚门，无隔担子菌亚纲、无褶菌目的多孔菌科 . 王佳铃等曾评述过1981～1995 年间研究报道过的主要高产漆酶白腐真菌（表 1）。

褐腐菌的软腐菌中的有些种类也可以分泌一些降解木质素的酶类，但它们分解木质素的能力不是很强，因此，研究报道较少.

降解木质素的原核生物以放线菌为主，如链霉菌属

（Streptomyces）、节杆菌属（Arthrobaeter）、小单孢菌属（Micromonoyticum）和诺卡氏菌（Nocardia）等。细菌中有厌氧梭菌（Clostridum

xylanoyticum）、假单孢菌（Pseudomonas）、不动杆菌（Acinetobacter）和芽孢杆菌（Bacillus）等原核生物对于在土壤中木质素的转化和降解具有重要作用，但土壤中木质素的降解据报导是土壤微生物区系多种类型微生物协同进行的结果，而且进程缓慢，单一微生物纯培养的商业用途前景不很清晰，且这类原核生物的多酚氧化酶是胞内酶，这也决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对从属的地位.

此外，很多植物病原微生物如Rhizoctonia solani R.praticola等也具有分解木质素的能力，但这类微生物在处理秸秆上的应用前景不大.

在木质素降解微生物中，研究得最多最彻底和最具应用前景的是黄孢原毛平革菌。这种微生物的特点是培养温度高（37℃ 左右），无性繁殖迅速，菌丝生长快且分泌木质素降解酶能力强，它已经成为研究白腐真菌的一种模式微生物 ’ 它的培养条件、代谢调控、分子生物学和遗传学及其在生产实践上的应用等均已被研究的相当仔细。

4.2 木质素降解酶的特性

目前，关于木质素降解酶的研究工作主要集中在白腐菌所产生的酶系。研究得较多，并认为最为重要的木质素降解酶有3 种，即木质素过氧化物酶（Lignin peroxidases/Lip）、锰依赖过氧化物酶（Manganese perxidases/Mnp）和漆酶（Laccase）.LiP,MnP和Laccase只是分别代表一系列的同功酶。但各种微生物所产生的酶的种类和一些理化特性是有所不同的。其中 LiP 是第一个从黄孢原毛平革菌发现的木质素降解酶，以后又分别从射脉菌，彩绒革盖菌，变色栓菌中发现.Laccase 没有在黄孢原毛平革菌中发现，而在Phlebia,Trametes,Coriolus 等菌中发现。

木质素的降解酶系是非常复杂的一个体系，很多问题至今还不十分清楚. 除了上述3 种重要的酶外，其它的一些酶如芳醇氧化酶（AAO）、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及一些还原酶、甲基化酶和蛋白酶等都参与或对木质素的降解产生一定的影响 .

LiP 和 Mnp 都是带有糖基的胞外血红素蛋白.又称血红素过氧化物酶（Heme Peroxidase），它们在反应中从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子而使后者形成一个阳离子基团，从而导致木质素分子中主要键的断裂. LiP 主要是氧化苯酚使之成为苯氧残基. Mnp 主要是从 Mn2+ 和 H2O2 的氧化中得到Mn3+，然后Mn3+氧化苯酚

使之成为苯氧残基 ’ 而每种酶在木质素降解中的具体作用还不甚清楚.

漆酶（Laccase）是含铜的多酚氧化酶，主要来源于生漆和真菌。由于Laccase 的含糖量高，难得到X-衍射分析用的漆酶单晶，它的三维空间结构尚不清楚 . 但已经证实，漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用.根据磁学和光谱性质可将漆酶中的 4个铜离子分为 3类：I 型 Cu2+和 II型Cu2+各 1 个，是单电子受体，呈顺磁性，可以用核磁共振控测；III型Cu2+ 2 个，是双电子受体，反磁性，用核磁共振不能检测. ! I型Cu2+ 呈蓝色，在λ614nm特征吸收峰；II型Cu2+为非蓝色，没用特征吸收峰；III型Cu24+ 的离子对（Cu2+„

Cu2+ ），在30 处有宽的吸收峰.

在木质素降解过程的机制和作用至今人们还不完全清楚。作为一种多酚氧化酶，它可催化氧化酚类或芳胺类等多种底物的氧化作用。氧化酚或芳胺先失去一个电子生成自由基，后者发生一系列非酶反应，氧化成醌，在有O2存在时，还原态漆

酶被氧化，O2 还原成水 ’ 底物自由基不稳定，可进一步发生键

的断裂或生成，导致裂解或聚合反应。因此，底物分子可进一步合生成复杂的产物，也可催化芳香环支链 Cα -Cβ断裂。

GALIANO 等发现，当Laccase和MnP 分别单独存在时，都不能有效地降解木质素，而 2 种酶同时存在时则木质素得到有效的降解，这表明 2种酶在催化木质素生物降解反应中具有协同作用 .此外还发现在反应中加入其它的酶，如葡萄糖氧化酶时，可显著提高木质素的降解程度 .他们认为，这是由于Laccase 既有解

聚，又有聚合木质素的能力，加入葡萄糖氧化酶可原Laccase 氧化多酚产生的醌等阻止木质素的聚合作用，从而提高Laccase 的降解能力.

确定每一种酶在木质素降解过程中的作用和功能是困难的，因为至少目前木质素被微生物所产生的单一胞外酶彻底、完全地催化解聚和降解的情况还没被发现 .每一种白腐真菌所产生的都不只是一种能降解木质素的酶，在缺陷任一种酶的体系中木质素仍能够较好的降解，而这些酶之间又相互作用和影响，使其存在于一个协同作用体系中.虽然现在已能用 14C标识的合成木质素来研究木质素降解酶在木质素降解中的作用机理，但由于木质素的结构复杂，木质素的彻底降解需依赖微生物区系中多种微生物在较长时间内相互交替的生长繁殖才能完成.

4.3 木质素的降解微生物的酶活性调控机理

在白腐菌产酶的培养方式上，研究最多的是液体培养 .国内外曾利用多种不同有机、无机或复合碳源和氮源来研究它们对微生物的木质素降解能力和产酶能力的影响 .还研究了碳源或氮源限制对它们的影响 .结果表明，碳源和氮源是微生物降解木质素和产酶的一个极为重要的影响因素.

不同的单糖、双糖作碳源的矿质培养基培养豹斑革菌时，用麦芽糖生物的生长量最高. 标准培养条件下，以葡萄糖作对照，甘露糖和麦芽糖使MnP 分别增2倍和3.8 倍。酵母汁、牛肉膏等复合氮有利于LiP 活性的提高，而甘氨酸、柠檬酸铵、乙醇胺等则抑制LiP的生成和活性.

毛平革菌等白腐菌的木质素降解和木质素降解酶的产生是发生在氮源或其它营养被消耗的次级代谢过程中 .而细菌则与之相反，高浓度的有机或无机氮源都不能抑制木质素降解，所产生的过氧化物酶也具有与生长相联和不受高水平氮抑制的特点 .我国学者李越中等曾对黄孢原平革菌合成木质素过氧化物酶的营养调控进行过较为详细的研究报道（表

2、表 3）。

微量元素对于白腐菌相关酶类的产生是有较大影响的。漆酶是一种含铜的多酚氧酶，因此， Cu 对于漆酶的产生和酶活性是相当重要的Mn对LiP和MnP都具有重要的作用，对漆酶的影响也是显著的. BINNARME等认为， Mn2+对LiP 有抑制作用，而对MnP 则有诱导作用，其作用的大小与Mn2+ 的浓度及添加时间有关.

C.subuermispora在Mn2+ 浓度为11×10-6mol·L-1时，木质素矿化速率最大，而MnP 和Laccase 的活性在4.0×10-6 mol·L-1 时最高 . 不添加Mn2+可使

Agaricus campestris 的Laccase 活性显著降低，但Mn2+ 对其影响是以Cu2+ 的存在为前提，如果没有Cu2+存在，那么Laccase 的活性则与Mn2+ 浓度无关且酶活性始终很低.有报道，高浓度的Mn2+ 会提高Phlebia breispora 的Laccase 活性，但对Dichomitus 来说，Laccas 活性都不受Mn2+的影响.

结构和木质素有关的低分子芳香化合物或木质素降解的碎片化合物，可诱导Laccase 产生并提高其酶产量，这类化合物如香草酸、藜芦醇、愈创木酚、吐温、甲苯胺等.在豹斑革耳菌上还发现了专一的MnP 诱导物3-甲基苄醇.

培养温度、通气状况，P H 值乃至环境湿度等，也是影响木质素降解酶产生的因素 .如黄孢原毛平革菌的最适生长温度为 3 7 ℃ ，最适产酶温度为30℃豹斑革耳菌增加通气可使木质素矿化率有所提高，而对于 Phlebia radiata来说，通氧则抑制其酶活性 . 培养温度和 P H值对Laccas 的影响因具体菌种而异，不同的菌种有不同的适宜培养温度和 P H值.

4.4 木质素的生物降解的应用

木质素的生物降解目前成功地用于生产实践的实际应用尚不多见，但在有些方面的研究已经显现出诱人的前景.

1) 造纸工业分解木质素的酶类在造纸工业上的应用有两个方面，一是用改造旧的造纸工艺，用于生物制浆、生物漂白和生物脱色 - 黄孢原毛平革菌和P.brevispora等在国外已经得到成功利用 - 如用P.brevispora 进行生物制浆预处理可降低47% 的能耗并增加了纸浆的张力，但它们的木质素降解率和产酶量都还是极为有限的，处理时间过长，距大规模推广应用尚有

一定的距离 .二是木质素分解菌或酶类用于造纸废水的处理，这方面的国内外研究报告已有很多且已取得了一定的实效.

2) 饲料工业木质素分解酶或分解菌处理饲料可提高动物对饲料的消化率 - 实际上，木素酶和分解菌的应用已经突破了秸秆仅用于反刍动物饲料的禁地，已有报道饲养猪、鸡的实验效果 - 目前，以木素酶、纤维素酶和植酸酶等组成的饲料多酶复合添加剂已达到了商品化的程度

3）发酵与食品工业木质纤维素中木质素的优先降解是

制约纤维素进一步糖化和转化的关键，已有很多实验偿试使用秸秆进行酒精发酵或有机酸发酵，但看来这还有很长的路要走。在食品工业如啤酒的生产中，可使用漆酶等进行沉淀和絮凝的脱除，使酒类得到澄清。

4）生物肥料传统上曾使用高温堆肥的办法来使秸秆转化为有机肥料，但这些操作劳动强度大，近年来不为农民所欢迎 - 最近，秸秆转化为有机肥料的简单而行之有效的办法是秸秆就地还田 - 但是，还田秸秆在田间降解迟缓并带来了一系列的耕作问题，而解决这些问题的关键是加速秸秆的腐熟过程，因此，以白腐菌为代表的木质素降解微生物为这种快速腐熟提供了理论上的可能性 - 在国内，已有几家科研单位在进行相关的研究与探索。

5）环境保护降解木质素的主要酶系是过氧化物酶系，它们作用于底物的机制是夺取电子和自由基的形成，这些特点决定了它们的底物非专一性，即它们的底物不是一种而是一类或几类有机化合物。以漆酶为例，它是含铜的多酚氧化酶，它的底物涵盖了多种芳胺、酚类、二茂铁及共衍生物。季立才等人最近又确证了40 多个漆酶的新发现底物，如

1.5- 萘二胺、 1.5-二氨基蒽醌、邻和对乙酰氨基苯酚、 3-氨基-4- 硝基苯酚、3- 氨基-4- 羟基苯磺酸、3-羟基-4- 氨基萘磺酸、原儿苯酸硝类、茜素红、茜素紫、醌茜素、苏木精等。鉴于木质素降解菌和它们产生的相关酶类对多种有机化合物的降解能力，因此它们也是化工废水处理研究最为活跃的领域之

一，这方面已不乏成功的范例。另外，在国外，黄孢原毛平革菌已被成功地用于有机氯农药污染土壤的生物修复。

结论

木质素生物降解技术在污水的有效治理和资源的合理利用方面将发挥巨大的作用，然而木质素复杂的化学结构及其特殊的理化性质决定了其尚有诸多问题需要解决，如可高效特异降解木质素理想微生物菌株的筛选、多菌种协同效应生物降解木质素的特性、生物与物理和化学多种技术手段联合运用降解木质素的效果、木质素降解产物精细化利用的途径等。其研究成果必将为木质素资源的合理有效利用提供强有力的技术支撑，在造纸、环境、饲料、肥料等领域将有相当广阔的应用前景。

参考文献

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谢辞

感谢我的导师王震老师，他严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；他循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪；从开始的搜集材料，初稿的审核到最后论文的定稿的整个过程中，老师都及时给予我建议，指出不足之处，帮助我更好地组织论文结构，不断充实论文的内容。这次能够顺利完成自己的本科毕业论文设计，得益于他们的帮助，在这里表示自己衷心的感谢！