实验一、碱裂解法提取质粒DNA 及检测
一、 实验目的与原理简介
质粒DNA 的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下
列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借
助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。②在非必要的DNA 克隆区有多
种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有天与一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反
应等）。④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA 分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA 的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解
细菌；分离和纯化质粒DNA 。
碱裂解法质粒DNA 是基于染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到
分离目的的。在强碱性pH 时，染色体线性DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而
变性。质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会
完全分离，调节pH 值至中性时，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型，而染色
体DNA 不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子
RNA 、蛋白质-SDS 复合物等一直沉淀下来而被除去。
提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA 的方法。
二．实验试剂
1，Sol Ⅰ100ml ： 1M Tris-HCL （pH8.0）2.5ml ，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%
葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加进Sol I)，高压灭菌，4°保存。
2，Sol Ⅱ100ml ：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml。使用
前将两种溶液混合。
3，Sol Ⅲ 500ml：KAc 147g， HAc57.5ml，加300mlDDW 搅拌，定容至500ml 。
高压灭菌，4°保存。
4，TE 100ml ：1M Tris-HCl （pH8.0）1ml ， 0.5 M EDTA 0.2 ml, 加DDW 至100ml 。
高压灭菌！
5，70%乙醇
6，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机
相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀
性，操作时应戴手套。
7，无菌水DDW
三、实验步骤
按1/100的比例接种保存的pPIC9K 大肠杆菌克隆菌种到3 mL 的含有适当抗
生素LB 培养基，37℃、180rpm 培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数
生长期) 。将活化的菌种按1/100接种至200 ml 的LB 培养基，37℃、250rpm 剧
烈震荡培养过夜。
1、离心管（10mL ）分装菌10ml ，离心去上清（10000rpm ，5min ，4℃）；弃上
清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。
2、重悬于800µl 冰冷的Sol Ⅰ中；剧烈震荡重悬菌体。
3、加入1.6mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA 形成碎片），
彻底混匀，室温放置10min （SolⅡ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
4、加入1.2mL 冰冷的 SolⅢ立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min 。
5、4℃，12000rpm 离心10min 。Sol Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA 复性，染色体
和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K +使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀, 沉淀核酸，
室温放置大于10min 。12000rpm 离心5min ，小心移出上清于一新离心管中。
7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min ，离心
12000rmp×10min。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗
沉淀一次，12000rmp 离心5 min 。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
10、将沉淀溶于50μl DDW中，储于-20℃冰箱中。
实验二 基因的PCR 扩增技术
一、实验目的与原理简介
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方
法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获
得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有
用的研究手段。
常规PCR 反用于已知DNA 序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA 双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA 分子，温度为94℃，
时间1min 。二、复性。降低温度使DNA 单链分子同引物结合。温度为55℃，时
间1min 。三、延深。升高温度，在DNA 聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加
入dNTP ，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min 。同时第一步变性前要在94℃
下预变性5分钟，使DNA 双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继
续延伸10分钟。
PCR 反应包含的七种基本成分：
1）热稳定性DNA 聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA
酶的特异性活性约为80000单位/mg.
2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR 扩增反应的效率与特异性
的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP ）：标准的PCR 反应体系应包括4种等摩尔浓度的
脱氧核苷三磷酸，即dATP 、dTTP 、dCTP 和dGTP 。每种dNTP 的浓度一般在
200-250μl 之间，高浓度的dNTP 对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP
与Mg 2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg 2+来激活热稳定的DNA 聚合酶，由于dNTP 与寡聚
核酸结Mg 2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP 和引物来源
的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg 2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH 值的缓冲液：用Tris-Cl 在室温将PCR 缓冲液的PH 值调至8.3-8.8
之间，标准PCR 缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温
度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH 值接近7.2。
6）一价阳离子：标准PCR 缓冲液内含有50mmol/L的KCl ，它对扩增大于500bp
长度的DNA 是有益的。
7）模板DNA ：含有靶序列的模板DNA 可以以单链或双链形式加入到PCR 混合
液中，闭环DNA 的及增效率略低于线性DNA 。
学习PCR 反应的基本原理和基本技术。
了解引物设计的一般要求。
二 、材料和试剂
10Х扩增缓冲液
4种dNTP 贮存液（20mmol/L，PH 8.0）
Tap DNA 聚合酶
5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L）
模板DNA
琼脂糖凝胶
PCR 仪（Bio-Rad 公司） 移液枪（0.5-10μL 5-50μL ） 枪头 微量
移液管
二、 实验操作
1） 将各成分加到微量离子管内混合：
10Х扩增缓冲液 2. 5μl
M g 2+ 1. 5μl
5端引物 1μl
3端引物 1μl
D D W 16. 2μl
d N T P 2. 5μl
T a q 酶 0. 3μl
模板 1 μl
2） 按照以下方法进行PCR 扩增：
预变性： 95ºC 5min
35个循环： 94 ºC 1min,63 ºC 1min, 72 ºC 1min；
延伸： 72 ºC 10min
注：聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp 的速率来计算出来
的。
3） 抽取每种扩增样品5-10μl ，用琼脂糖电泳来分析扩增结果， 用DNA marker
来判断扩增片段的大小 。凝胶一般用Goldview 染色后观察扩增的量与片段大
小。
从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR 扩增的
效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。
三、
问
题 可能原因
模板浓度偏低或偏高
模板降解
模板中含有抑制反应的杂质
引物浓度不足
引物存在二级结构
引物降解
Mg 2+浓度偏低
dNTP 降解
无酶纯度低，扩增效率差 产
物酶量不足
或
产用酶不当
量
低 缓冲液失效
模板变性不充分
退火温度偏高
延伸时间不足
循环数目不够
PCR 管污染
PCR 仪故障
其他
体系污染
引物浓度过高
引物序列特异性差
Mg 2+浓度过高
非
特dNTP 浓度过高
异酶量过多
产退火温度过低 物
过延伸时间过短
多 循环次数过多
模板结构过于复杂或目标片
段过长
其他
引物3’末端存在互补序列
引引物浓度过高
物
二模板浓度过低
聚退火温度不合适
体 循环次数过多
其他
引物浓度过高
引物序列特异性差或模板上
存在同源序列
模板降解
模板浓度过高
dNTP 浓度过高
拖Mg 2+浓度过高 解决方法 电泳检测模板浓度，调整模板用量 重新制备；基因组DNA 、cDNA 应小量分装后低温保存 纯化模板 调整引物浓度，特别是针对长片段PCR 重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度 引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融 适当提高Mg 2+浓度，从1 mM 到3 mM 以0.5 mM 间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg 2+浓度 -20℃保存，小量分装，避免反复冻融 选用高质量DNA 聚合酶 适当增加酶量 针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR 产品选择指南) 更换缓冲液或使用预混PCR 反应体系 适当延长变性时间；对高GC 或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃ 降低退火温度，应比引物Tm 低至少5℃ 增加延伸时间，特别是针对长片段PCR 增加循环数 质量可靠的PCR 管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR 管不可清洗后重复使用 检查程序和模块温度 使用PCR 增强剂 设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染 适当减少引物浓度 重新设计引物 降低Mg 2+浓度，从1 mM 到3 mM 以0.5 mM 间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg 2+浓度 降低dNTP 浓度 减少酶量，以0.5 U间隔递减 提高退火温度 增加延伸时间，以1 min间隔递增 减少循环次数 特选择适当的酶(详见PCR 产品选择指南) ；使用PCR 增强剂 HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR 重新设计引物 降低引物浓度 提高模板浓度 优化退火温度 减少循环次数 HotStart PCR 调整引物浓度 重新设计引物 重新制备模板 降低模板浓度 减少dNTP 用量 降低Mg 2+浓度，从1 mM 到3 mM 以0.5 mM 间隔递增，
针对不同模板和引物摸索最佳Mg 2+浓度
实验三、酶切与连接
一、实验目的与原理简介
限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和
进行基因克隆。制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带：而利用基因
克隆时选择酶应注意以下几个方面：1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的
情况3）载体上切点的情况；4）切割与连接方式；5）接头状态。
酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同一DNA 片段上有
些被切开而另一些 未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是
基于基因 内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的
时间 内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种
是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方
法因易于控制反应而被广泛应用。2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱
的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切
两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时 进
行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这
样可以避免片段混乱现象的出现。
二、材料和试剂
限制性内切栈酶XhoI 、EcoRI ；10×Buffer PCR产物、pPIC9K 质粒、10×T4连
接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试
剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪
三、实验步骤
1）PCR 产物双酶切（XhoI 、EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(XhoI部分酶切、EcoRI
完全酶切) ；PCR 体系如下：
产物PCR 体系
DDW
10×H Buffer
PCR 产物
XhoI
EcoRI 23μl 5μl 20μl 1μl 1μl(37℃恒温4小时) DDW 产物PCR 体系 23μl 5μl 20μl 1μl 1μl(37℃恒温4小时) 10×H Buffer PCR 产物 XhoI EcoRI
以上两步酶切都要制备两管, 酶产物置于-20℃, 电泳检测酶切结果并回收一
管做连接. 由于pPI9K 质粒有两个XhoI 酶切位点(1193\5730),故采用部分酶切法,
并电泳回收, 酶切后9K 大小的线性片段用于连接。PCR 产物双酶切可用乙醇沉淀
回收。
2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。
3）切胶回收（尽量更要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。
4）回收产物电泳检测后进行连接：
连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl
目的基因 6μl
质粒载体 2μl
T4 Ligase 1μl
混合后16℃，过夜连接。完成后放入4℃冰箱可，备用。
四、注意事项
1、加样次序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶。
2、限制性内切酶的量不要过多，最多不超过部体积的1/10，否则易发生酶的星
号反应。所谓酶的星号反应就是指改变酶切条件时酶的识别位点专一性下降，导
致酶切图谱混乱的现象。
3、内芭栈瓣选择和使用方案须根据具体的实验情况来精心设计。
4、限制性内切酶和连接酶都 极易失活，须在冰盒上操作，同时防止污染。
实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化
一 、实验原理与目的
感受态就是受体菌能接受外源DNA （周围环境中的DNA 分子）能力的一种生
理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发
展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。用CaCl 2处
理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。冷冻也能增
加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。
学习CaCl 2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；
掌握外源DNA 重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。
二、材料与试剂
1.5ml EP管 灭菌枪头 移液枪 冰盒 低温离心机 涂布
棒 大肠杆菌Top10、重组质粒（实验三的连接产物）、LB 固体培养基、
氨苄青霉素储存液 0.1M CaCl2
三、实验方法
1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl 2法）
1 ）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌Top10菌液 30μl （过夜菌液约16
小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm ）培养过
夜；（OD=0.2—0.4）。
2 ）将过夜培养的菌液移入3ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm ），至
OD=0.4—0.6（约2小时）；冰浴30分钟，使培养物冷却至0度。
3 ）取1ml 菌液于1.5ml EP 管中，4度时4000rpm 离心10分钟，去上清。（倒
出培养液将管倒置1 分钟，以使前后残留的培养液流尽。）沉淀用1ml
冰上预泠的0.1M CaCl 2（抽滤灭菌）悬浮，混合均匀，置于冰浴上30min 。
4 ）4度4000rpm 离心10min ，去上清沉淀再加200μl 的0.1M CaCl 2重悬，冰
上放置2-7h 后可用于转化；或者每管加20-30%的灭菌甘油，-70℃保存。
2、转化大肠杆菌感受态胞
1）取上述方法制备的感受态细胞，或者从-70℃超低温冰箱取出一管感受态
细胞融化。
2）按每200μl 菌液加100ng 已纯化的质粒DNA （无菌操作）的标准，将5-10
μlDNA 的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30min 。（同时
作两个对照组即受体菌对照组（-）和质粒DNA 对照组（+），检测感受态
细胞的质量及有无污染情况）
3）42℃水浴中热激90sec ，迅速取出立即放于冰上2min 。注意：在水浴中
切勿乱晃动。
4）上述各管中分别加入800μl 37℃预热的LB 培养基至总体积为1ml ，混匀
后37℃ 180rpm培养1-2小时左右复苏。
5）4000rpm 离心10min ，去800μl 上清液，将剩余的200μl 菌液混匀。
6）用烧烤过的涂布将100μl 的菌液涂布于加相应抗生素（Amp+50ppm）的LB
固体培养基，涂匀，置于超净台上1小时左右至菌液完全被培养基吸收。
7）37℃倒置培养12-24小时。从平板上挑选抗性菌落进行鉴定。
四、主意事项
1、为了提高转化效率活细胞 数务必少于108个/ml，即OD 600值为0.4左右，
为了确保生长浓度不会太高，可每隔15-20min 进行一次OD 值监测。
2、热激是一个非常重要的步骤，应准确的达到热激所需要的温度的时间。
3、如果加入太多的菌落裂解液，会改变了反应混合液的离子平衡，导致实
验失败。
4、PCR 扩增对DNA 模板的要求量很低，因而在利用菌落裂解液作为模板时，
应避免加入过量的模板DNA 样品。
5、偶尔带入琼脂碎片于反应混合液中，会抑制的热稳定性DNA 聚合酶的扩
增。
实验五 菌落PCR 筛选阳性重组子及重组质粒的酶切鉴定
菌落PCR 鉴定
1）反应体系： 10Х扩增缓冲液 2.5μl
Mg2+ 2.5μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
DDW 14.5μl
dNTP 2.5μl
taq 酶 0.3μl
模板为菌落
用灭菌的200μl 的枪头挑选一个个细菌菌落，迅速的使挑取物溶于25μl
的主混合液中，30个克隆另加一个阳性对照 。
2）完全混合后，将反应管放于PCR 仪上，按照变性、复性、延伸三种程序
设定温度、时间、循环次数。进行反应。程序设定同实验一。
3）抽取每种扩增产物5-10μl ，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA
marker 来判断扩增片段的大小。
实验六、质粒酶切及电转化毕赤酵母
一、实验原理及目的
核酸不能自动进入细胞，需要协助才能穿过细胞壁的物理屏障进入能够进行
表达或复制的胞内位点。电流可逆性的击穿细胞膜形成瞬时水通路或膜上小孔，
促使DNA 分子进入胞内。电场强度为kV/ cm 、持续时间为μs —ms 级的电脉冲刺
激会使细胞膜发生电穿孔现象, 即:细胞膜结构重组, 出现微孔, 电导率改变, 暂时
丧失屏障功能等, 从而引起离子的流出, 代谢物的排泄, 细胞对药剂及DNA 等大
分子的吸收量增加。线性DNA 分子与环状DNA 分子均可用于转染，但线性DNA 无论
是瞬时表达还是稳定转染的水平高于环状分子。所以对于闭合环状的质粒DNA 来
说，要首先利用限制性内切酶切割使其变成线性分子，然后进行转染。
同时转染的效率还会以下因素影响：外加电场的强度、电脉冲的长度、温度、
培养基的离子成分。
掌握电穿孔转染DNA 技术。
二、材料和试剂（两组共配一次）
RDB培养基 1、取Sorbitol 18.6g 及 琼脂 2 g 溶于70ml 水中。 2、10ХD 10ml （8g 葡萄糖，40mlDDW ）
10 YNB 10ml （13.4gYNB 100mlDDW 过滤除菌）
500Х B 0.2ml ( 2mg 生物素，10ml 水，过滤除菌)
100ХAA 1.0ml （过滤除菌）
DDW 8.8ml
将1、2 两种溶液混合，加热后倒平板，每个平板10ml. 共10个平板。
MD培养基（100）：Yeast extract 1g
Peptone 2 g
10×D 10ml 加水至100ml ，高压灭菌
三、实验步骤
I 、线性化质粒的制备
SacI 酶切质粒3小时
酶切体系（根据质粒浓度而定，保定质粒浓度DNA 大于1μg/μl ）
DDW 16.5μl
BufferI 2.5μl
质粒 5μl
SacI 1μl
和电泳检测酶切结果，回收质粒
II 、酵母感受态细胞的制备：
1、按1：100将300μl 保种菌接种于3mlYPD 培养基中30℃揺菌过夜（约15h ）
2、取活化的菌液50μl 接入50mlYPD 液体培养基30℃揺菌过夜，至OD 600
=1.3-1.5（12-15h ），收集菌体制备感受态细胞。
3、4℃ 3000g离心5分钟，弃上清，向沉淀加5ml 无菌DDW 重悬，补加冰预冷
的无菌水至100ml
4、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于15ml 冰预冷的无菌水中
5、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于3ml 冰预冷的山梨醇中
6、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于0.1ml 冰预冷的山梨醇中
7、按照80μl 每管分装于1.5mlEP 管中，立即使用或于-20℃存放
III 、电转化
1、将感受态细胞80μl 加入10μl （5-20μg ）线性化质粒，混匀，加入到冰
预冷的电转杯 中，冰上放置5分钟。
2、设置电转仪于真核细胞程序， 电转条件：1.5KV 25μF 200Ω
IV 、阳性克隆筛选
1、电转成功后，将菌液涂于RDB 板上，30℃恒温培养箱培养2-3天，观察
克隆生长状况。
2、长出克隆后挑选单菌落作PCR ，鉴定其是否为阳性克隆。若获得阳性克
隆 则揺菌保种，划线鉴定，小量表达，电泳检测目的基因。
实验七 重组蛋白的表达及western blot 鉴定
表达试剂：10×D 10×YNB 500×B （实验六中已配）
10×GY ： 10ml甘油，90ml 水，高压灭菌。
10×M ：5ml 甲醇加水至100ml ，过滤除菌。
1M 磷酸钾缓冲液（ph6.0）:13.2 ml1M K2HPO4,86.8ml 1M KH2PO4,调至PH6.0。 （1M K2HPO4：22.822g ，80ml 水溶，定容至100ml ；1M KH2PO4：
6.8g ，40ml 水溶，定容至50ml ）
BMGY 培养基：4gYE ，8gTryptone ，280mlDDW ，高压灭菌后，超净台中加10×GY ，10×YNB ，1M 磷酸钾缓冲液（ph6.0）各40ml ，0.8ml 500×B
BMMY 培养基：1gYE ，2gTryptone ，70mlDDW ，高压灭菌后，超净台中加10×M ，10×YNB ，1M 磷酸钾缓冲液（ph6.0）各10ml ，0.2ml 500×B
挑酵母重组子接种于3ml YPD，摇菌过夜（16h ），转接于400ml BMGY培养基摇培24h ，静置4h 左右，倒掉上清，加入100mlBMMY ，摇培30h 左右，添加1ml 甲醇，24h 后再添加1ml 甲醇，24h 后收菌，12000rpm 离心15min ，留上清。 western blot 鉴定
样品准备
不同发酵时间的发酵液（900ul ），TCA-丙酮沉淀法沉淀蛋白。
1加脱氧胆酸钠至0.02％终浓度，混匀室温放置至少15min
2加100％TCA 至10％终浓度，混匀，室温至少放置1h
3 4度14000转离心10分钟，弃上清，倒置干燥
3 加冰预冷的丙酮，混合，低温放置至少20分钟
5 4度最高转速离心10分钟，倒上清，倒置干燥丙酮
30ul 一乘上样缓冲液溶解沉淀，沸水煮5分钟
总体时间3小时
所用试剂：
转膜缓冲液：（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris （MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，此溶液可重复使用3～5次（此溶液最好保存在4度冰箱，最多
使用5次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和SDS ，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和SDS 等比较困难）（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）
TBS 缓冲液：（10mM Tris-Hcl pH7.5, 150mmol/L NaCl）
1 mol/L Tris·HCl （pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
（可以配制成10×TBS 缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
10×TBS: Tris 12.11g ，NaCl 88g
蒸馏水至 900ml，调节pH 至7.5，定容1000ml
Tris 4.844g ，NaCl 35.2g 。蒸馏水至 350ml，调节pH 至7.5，定容400ml
TBST 缓冲液：（含0.05％Tween20的TBS 缓冲液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液： 脱脂奶粉 5g
TBST 100ml
最好现用现配。
或者用含5%BSA的TBST
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
一． 制备凝胶
样品制备过程中，制备凝胶
5％浓缩胶12％分离胶
配制凝固时间：分离胶30分钟，浓缩胶50分钟
电泳时间：80V 二十分钟，100V 100分钟左右。
可以降低电压，60V 80V
滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作) 。
A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中，约1-10分钟。再转入transfer buffer中。
D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
转膜
1. 准备6张和凝胶大小相近的滤纸和1张PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
2. 甲醇活性化PVDF 膜：一般活化5-10min ，用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的培养皿里浸泡。
3. 转膜液浸泡：将电泳好的凝胶剥下，去掉浓缩胶，切割成合适大小，注意目的条带的位置。在加有转移液的培养皿中放入切好的凝胶、平头镊子、一支玻璃棒、滤纸、浸过的膜。
4. 半干法转膜：在转膜液中对齐三层滤纸，用平头镊子赶出滤纸层中的气泡，夹出放在转膜仪上；膜盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒轻轻擀去气泡（由中间向两边赶）。将分离胶盖于膜上，并除气泡。在分离胶上盖3张滤纸并除去气泡。擀几下就可合起夹子。整个操作要不断的擀去气泡。
5. 盖上转膜仪上盖，设置好电压和时间。一般用半干转膜仪15V 45-60min
6转完后将膜用1×丽春红染液染1-2min （平头蘖枝夹住边缘，轻轻浸入染液）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白（超纯水多洗两遍，）。 将膜晾干备用。
封闭：将膜用TBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的培养皿中，室温下脱色摇
床上摇动封闭2h 。用TBS 将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可) 。
孵育一抗：一抗用封闭液（或者用含有5%BSA的TBST ）稀释至适当浓度（在1.5ml
离心管中）；将PVDF 膜放入PE 手套中，用封口机将膜封闭，将抗体溶液加到膜的蛋白面（转膜时做好标记）赶出残留气泡；室温下孵育2h 后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次（多洗几次，多加TBST ），每次10min ；
再用TBS 洗一次， 5min。
孵育二抗：同上方法准备稀释二抗，摇床，室温下孵育1h 后，用TBST 在室温 下脱色摇床上洗3次，每次10min ；再用TBS 洗一次，5min 。
一抗推荐稀释比例：1:200-1:2000
二抗推荐稀释比例：1:5000-1:100,0000
先前做过两次实验：一抗1:500，二抗1:2000，背景较重，出现非特异条带。 这次做可以先把二抗浓度改为1:20000，一抗：1:500 1:1000
DAB 显色
DAB （3,3二氨基联苯胺）和HRP 反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP 标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP ）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
ECL 灵敏度比DAB 高不少
实验八 重组蛋白的纯化
上步所得上清，进行65%硫酸铵沉淀，每100ml 上清加39.8硫酸铵（冰上操作，手动搅拌，不要剧烈），4°放置2h （可过夜）。12000rpm 离心15min ，2ml Tris 缓冲液溶解，将溶解的液体放入透析袋，透析约16h ，每隔6h 换一次透析液，透析完毕后过离子交换层析柱（Q 柱）。
5×Tris 缓冲液： Tris 12.114g/L PH调至8.0
1×Tris 缓冲液：5×Tris 缓冲液稀释4倍
300mM NaCl洗脱液： 3.5064g NaCl，200ml 1×Tris 缓冲液
500mM NaCl洗脱液：5.844g NaCl，200ml 1×Tris 缓冲液
1M NaCl洗脱液：11.688g NaCl，200ml 1×Tris 缓冲液
实验一、碱裂解法提取质粒DNA 及检测
一、 实验目的与原理简介
质粒DNA 的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下
列四个特点：①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借
助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。②在非必要的DNA 克隆区有多
种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有天与一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反
应等）。④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA 分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA 的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解
细菌；分离和纯化质粒DNA 。
碱裂解法质粒DNA 是基于染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到
分离目的的。在强碱性pH 时，染色体线性DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而
变性。质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会
完全分离，调节pH 值至中性时，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型，而染色
体DNA 不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子
RNA 、蛋白质-SDS 复合物等一直沉淀下来而被除去。
提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA 的方法。
二．实验试剂
1，Sol Ⅰ100ml ： 1M Tris-HCL （pH8.0）2.5ml ，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%
葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加进Sol I)，高压灭菌，4°保存。
2，Sol Ⅱ100ml ：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml。使用
前将两种溶液混合。
3，Sol Ⅲ 500ml：KAc 147g， HAc57.5ml，加300mlDDW 搅拌，定容至500ml 。
高压灭菌，4°保存。
4，TE 100ml ：1M Tris-HCl （pH8.0）1ml ， 0.5 M EDTA 0.2 ml, 加DDW 至100ml 。
高压灭菌！
5，70%乙醇
6，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机
相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀
性，操作时应戴手套。
7，无菌水DDW
三、实验步骤
按1/100的比例接种保存的pPIC9K 大肠杆菌克隆菌种到3 mL 的含有适当抗
生素LB 培养基，37℃、180rpm 培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数
生长期) 。将活化的菌种按1/100接种至200 ml 的LB 培养基，37℃、250rpm 剧
烈震荡培养过夜。
1、离心管（10mL ）分装菌10ml ，离心去上清（10000rpm ，5min ，4℃）；弃上
清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。
2、重悬于800µl 冰冷的Sol Ⅰ中；剧烈震荡重悬菌体。
3、加入1.6mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA 形成碎片），
彻底混匀，室温放置10min （SolⅡ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
4、加入1.2mL 冰冷的 SolⅢ立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min 。
5、4℃，12000rpm 离心10min 。Sol Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA 复性，染色体
和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K +使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀, 沉淀核酸，
室温放置大于10min 。12000rpm 离心5min ，小心移出上清于一新离心管中。
7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min ，离心
12000rmp×10min。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗
沉淀一次，12000rmp 离心5 min 。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。
10、将沉淀溶于50μl DDW中，储于-20℃冰箱中。
实验二 基因的PCR 扩增技术
一、实验目的与原理简介
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方
法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获
得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有
用的研究手段。
常规PCR 反用于已知DNA 序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA 双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA 分子，温度为94℃，
时间1min 。二、复性。降低温度使DNA 单链分子同引物结合。温度为55℃，时
间1min 。三、延深。升高温度，在DNA 聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加
入dNTP ，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min 。同时第一步变性前要在94℃
下预变性5分钟，使DNA 双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继
续延伸10分钟。
PCR 反应包含的七种基本成分：
1）热稳定性DNA 聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA
酶的特异性活性约为80000单位/mg.
2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR 扩增反应的效率与特异性
的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP ）：标准的PCR 反应体系应包括4种等摩尔浓度的
脱氧核苷三磷酸，即dATP 、dTTP 、dCTP 和dGTP 。每种dNTP 的浓度一般在
200-250μl 之间，高浓度的dNTP 对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP
与Mg 2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg 2+来激活热稳定的DNA 聚合酶，由于dNTP 与寡聚
核酸结Mg 2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP 和引物来源
的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg 2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH 值的缓冲液：用Tris-Cl 在室温将PCR 缓冲液的PH 值调至8.3-8.8
之间，标准PCR 缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温
度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH 值接近7.2。
6）一价阳离子：标准PCR 缓冲液内含有50mmol/L的KCl ，它对扩增大于500bp
长度的DNA 是有益的。
7）模板DNA ：含有靶序列的模板DNA 可以以单链或双链形式加入到PCR 混合
液中，闭环DNA 的及增效率略低于线性DNA 。
学习PCR 反应的基本原理和基本技术。
了解引物设计的一般要求。
二 、材料和试剂
10Х扩增缓冲液
4种dNTP 贮存液（20mmol/L，PH 8.0）
Tap DNA 聚合酶
5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L）
模板DNA
琼脂糖凝胶
PCR 仪（Bio-Rad 公司） 移液枪（0.5-10μL 5-50μL ） 枪头 微量
移液管
二、 实验操作
1） 将各成分加到微量离子管内混合：
10Х扩增缓冲液 2. 5μl
M g 2+ 1. 5μl
5端引物 1μl
3端引物 1μl
D D W 16. 2μl
d N T P 2. 5μl
T a q 酶 0. 3μl
模板 1 μl
2） 按照以下方法进行PCR 扩增：
预变性： 95ºC 5min
35个循环： 94 ºC 1min,63 ºC 1min, 72 ºC 1min；
延伸： 72 ºC 10min
注：聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp 的速率来计算出来
的。
3） 抽取每种扩增样品5-10μl ，用琼脂糖电泳来分析扩增结果， 用DNA marker
来判断扩增片段的大小 。凝胶一般用Goldview 染色后观察扩增的量与片段大
小。
从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR 扩增的
效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。
三、
问
题 可能原因
模板浓度偏低或偏高
模板降解
模板中含有抑制反应的杂质
引物浓度不足
引物存在二级结构
引物降解
Mg 2+浓度偏低
dNTP 降解
无酶纯度低，扩增效率差 产
物酶量不足
或
产用酶不当
量
低 缓冲液失效
模板变性不充分
退火温度偏高
延伸时间不足
循环数目不够
PCR 管污染
PCR 仪故障
其他
体系污染
引物浓度过高
引物序列特异性差
Mg 2+浓度过高
非
特dNTP 浓度过高
异酶量过多
产退火温度过低 物
过延伸时间过短
多 循环次数过多
模板结构过于复杂或目标片
段过长
其他
引物3’末端存在互补序列
引引物浓度过高
物
二模板浓度过低
聚退火温度不合适
体 循环次数过多
其他
引物浓度过高
引物序列特异性差或模板上
存在同源序列
模板降解
模板浓度过高
dNTP 浓度过高
拖Mg 2+浓度过高 解决方法 电泳检测模板浓度，调整模板用量 重新制备；基因组DNA 、cDNA 应小量分装后低温保存 纯化模板 调整引物浓度，特别是针对长片段PCR 重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度 引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融 适当提高Mg 2+浓度，从1 mM 到3 mM 以0.5 mM 间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg 2+浓度 -20℃保存，小量分装，避免反复冻融 选用高质量DNA 聚合酶 适当增加酶量 针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR 产品选择指南) 更换缓冲液或使用预混PCR 反应体系 适当延长变性时间；对高GC 或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃ 降低退火温度，应比引物Tm 低至少5℃ 增加延伸时间，特别是针对长片段PCR 增加循环数 质量可靠的PCR 管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR 管不可清洗后重复使用 检查程序和模块温度 使用PCR 增强剂 设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染 适当减少引物浓度 重新设计引物 降低Mg 2+浓度，从1 mM 到3 mM 以0.5 mM 间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg 2+浓度 降低dNTP 浓度 减少酶量，以0.5 U间隔递减 提高退火温度 增加延伸时间，以1 min间隔递增 减少循环次数 特选择适当的酶(详见PCR 产品选择指南) ；使用PCR 增强剂 HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR 重新设计引物 降低引物浓度 提高模板浓度 优化退火温度 减少循环次数 HotStart PCR 调整引物浓度 重新设计引物 重新制备模板 降低模板浓度 减少dNTP 用量 降低Mg 2+浓度，从1 mM 到3 mM 以0.5 mM 间隔递增，
针对不同模板和引物摸索最佳Mg 2+浓度
实验三、酶切与连接
一、实验目的与原理简介
限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和
进行基因克隆。制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带：而利用基因
克隆时选择酶应注意以下几个方面：1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的
情况3）载体上切点的情况；4）切割与连接方式；5）接头状态。
酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同一DNA 片段上有
些被切开而另一些 未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是
基于基因 内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的
时间 内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种
是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方
法因易于控制反应而被广泛应用。2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱
的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切
两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时 进
行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这
样可以避免片段混乱现象的出现。
二、材料和试剂
限制性内切栈酶XhoI 、EcoRI ；10×Buffer PCR产物、pPIC9K 质粒、10×T4连
接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试
剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪
三、实验步骤
1）PCR 产物双酶切（XhoI 、EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(XhoI部分酶切、EcoRI
完全酶切) ；PCR 体系如下：
产物PCR 体系
DDW
10×H Buffer
PCR 产物
XhoI
EcoRI 23μl 5μl 20μl 1μl 1μl(37℃恒温4小时) DDW 产物PCR 体系 23μl 5μl 20μl 1μl 1μl(37℃恒温4小时) 10×H Buffer PCR 产物 XhoI EcoRI
以上两步酶切都要制备两管, 酶产物置于-20℃, 电泳检测酶切结果并回收一
管做连接. 由于pPI9K 质粒有两个XhoI 酶切位点(1193\5730),故采用部分酶切法,
并电泳回收, 酶切后9K 大小的线性片段用于连接。PCR 产物双酶切可用乙醇沉淀
回收。
2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。
3）切胶回收（尽量更要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。
4）回收产物电泳检测后进行连接：
连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl
目的基因 6μl
质粒载体 2μl
T4 Ligase 1μl
混合后16℃，过夜连接。完成后放入4℃冰箱可，备用。
四、注意事项
1、加样次序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶。
2、限制性内切酶的量不要过多，最多不超过部体积的1/10，否则易发生酶的星
号反应。所谓酶的星号反应就是指改变酶切条件时酶的识别位点专一性下降，导
致酶切图谱混乱的现象。
3、内芭栈瓣选择和使用方案须根据具体的实验情况来精心设计。
4、限制性内切酶和连接酶都 极易失活，须在冰盒上操作，同时防止污染。
实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化
一 、实验原理与目的
感受态就是受体菌能接受外源DNA （周围环境中的DNA 分子）能力的一种生
理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发
展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。用CaCl 2处
理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。冷冻也能增
加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。
学习CaCl 2法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；
掌握外源DNA 重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。
二、材料与试剂
1.5ml EP管 灭菌枪头 移液枪 冰盒 低温离心机 涂布
棒 大肠杆菌Top10、重组质粒（实验三的连接产物）、LB 固体培养基、
氨苄青霉素储存液 0.1M CaCl2
三、实验方法
1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl 2法）
1 ）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌Top10菌液 30μl （过夜菌液约16
小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm ）培养过
夜；（OD=0.2—0.4）。
2 ）将过夜培养的菌液移入3ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm ），至
OD=0.4—0.6（约2小时）；冰浴30分钟，使培养物冷却至0度。
3 ）取1ml 菌液于1.5ml EP 管中，4度时4000rpm 离心10分钟，去上清。（倒
出培养液将管倒置1 分钟，以使前后残留的培养液流尽。）沉淀用1ml
冰上预泠的0.1M CaCl 2（抽滤灭菌）悬浮，混合均匀，置于冰浴上30min 。
4 ）4度4000rpm 离心10min ，去上清沉淀再加200μl 的0.1M CaCl 2重悬，冰
上放置2-7h 后可用于转化；或者每管加20-30%的灭菌甘油，-70℃保存。
2、转化大肠杆菌感受态胞
1）取上述方法制备的感受态细胞，或者从-70℃超低温冰箱取出一管感受态
细胞融化。
2）按每200μl 菌液加100ng 已纯化的质粒DNA （无菌操作）的标准，将5-10
μlDNA 的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30min 。（同时
作两个对照组即受体菌对照组（-）和质粒DNA 对照组（+），检测感受态
细胞的质量及有无污染情况）
3）42℃水浴中热激90sec ，迅速取出立即放于冰上2min 。注意：在水浴中
切勿乱晃动。
4）上述各管中分别加入800μl 37℃预热的LB 培养基至总体积为1ml ，混匀
后37℃ 180rpm培养1-2小时左右复苏。
5）4000rpm 离心10min ，去800μl 上清液，将剩余的200μl 菌液混匀。
6）用烧烤过的涂布将100μl 的菌液涂布于加相应抗生素（Amp+50ppm）的LB
固体培养基，涂匀，置于超净台上1小时左右至菌液完全被培养基吸收。
7）37℃倒置培养12-24小时。从平板上挑选抗性菌落进行鉴定。
四、主意事项
1、为了提高转化效率活细胞 数务必少于108个/ml，即OD 600值为0.4左右，
为了确保生长浓度不会太高，可每隔15-20min 进行一次OD 值监测。
2、热激是一个非常重要的步骤，应准确的达到热激所需要的温度的时间。
3、如果加入太多的菌落裂解液，会改变了反应混合液的离子平衡，导致实
验失败。
4、PCR 扩增对DNA 模板的要求量很低，因而在利用菌落裂解液作为模板时，
应避免加入过量的模板DNA 样品。
5、偶尔带入琼脂碎片于反应混合液中，会抑制的热稳定性DNA 聚合酶的扩
增。
实验五 菌落PCR 筛选阳性重组子及重组质粒的酶切鉴定
菌落PCR 鉴定
1）反应体系： 10Х扩增缓冲液 2.5μl
Mg2+ 2.5μl
正向引物 1μl
反向引物 1μl
DDW 14.5μl
dNTP 2.5μl
taq 酶 0.3μl
模板为菌落
用灭菌的200μl 的枪头挑选一个个细菌菌落，迅速的使挑取物溶于25μl
的主混合液中，30个克隆另加一个阳性对照 。
2）完全混合后，将反应管放于PCR 仪上，按照变性、复性、延伸三种程序
设定温度、时间、循环次数。进行反应。程序设定同实验一。
3）抽取每种扩增产物5-10μl ，用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果，用DNA
marker 来判断扩增片段的大小。
实验六、质粒酶切及电转化毕赤酵母
一、实验原理及目的
核酸不能自动进入细胞，需要协助才能穿过细胞壁的物理屏障进入能够进行
表达或复制的胞内位点。电流可逆性的击穿细胞膜形成瞬时水通路或膜上小孔，
促使DNA 分子进入胞内。电场强度为kV/ cm 、持续时间为μs —ms 级的电脉冲刺
激会使细胞膜发生电穿孔现象, 即:细胞膜结构重组, 出现微孔, 电导率改变, 暂时
丧失屏障功能等, 从而引起离子的流出, 代谢物的排泄, 细胞对药剂及DNA 等大
分子的吸收量增加。线性DNA 分子与环状DNA 分子均可用于转染，但线性DNA 无论
是瞬时表达还是稳定转染的水平高于环状分子。所以对于闭合环状的质粒DNA 来
说，要首先利用限制性内切酶切割使其变成线性分子，然后进行转染。
同时转染的效率还会以下因素影响：外加电场的强度、电脉冲的长度、温度、
培养基的离子成分。
掌握电穿孔转染DNA 技术。
二、材料和试剂（两组共配一次）
RDB培养基 1、取Sorbitol 18.6g 及 琼脂 2 g 溶于70ml 水中。 2、10ХD 10ml （8g 葡萄糖，40mlDDW ）
10 YNB 10ml （13.4gYNB 100mlDDW 过滤除菌）
500Х B 0.2ml ( 2mg 生物素，10ml 水，过滤除菌)
100ХAA 1.0ml （过滤除菌）
DDW 8.8ml
将1、2 两种溶液混合，加热后倒平板，每个平板10ml. 共10个平板。
MD培养基（100）：Yeast extract 1g
Peptone 2 g
10×D 10ml 加水至100ml ，高压灭菌
三、实验步骤
I 、线性化质粒的制备
SacI 酶切质粒3小时
酶切体系（根据质粒浓度而定，保定质粒浓度DNA 大于1μg/μl ）
DDW 16.5μl
BufferI 2.5μl
质粒 5μl
SacI 1μl
和电泳检测酶切结果，回收质粒
II 、酵母感受态细胞的制备：
1、按1：100将300μl 保种菌接种于3mlYPD 培养基中30℃揺菌过夜（约15h ）
2、取活化的菌液50μl 接入50mlYPD 液体培养基30℃揺菌过夜，至OD 600
=1.3-1.5（12-15h ），收集菌体制备感受态细胞。
3、4℃ 3000g离心5分钟，弃上清，向沉淀加5ml 无菌DDW 重悬，补加冰预冷
的无菌水至100ml
4、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于15ml 冰预冷的无菌水中
5、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于3ml 冰预冷的山梨醇中
6、4℃ 10000rpm离心5分钟，重悬于0.1ml 冰预冷的山梨醇中
7、按照80μl 每管分装于1.5mlEP 管中，立即使用或于-20℃存放
III 、电转化
1、将感受态细胞80μl 加入10μl （5-20μg ）线性化质粒，混匀，加入到冰
预冷的电转杯 中，冰上放置5分钟。
2、设置电转仪于真核细胞程序， 电转条件：1.5KV 25μF 200Ω
IV 、阳性克隆筛选
1、电转成功后，将菌液涂于RDB 板上，30℃恒温培养箱培养2-3天，观察
克隆生长状况。
2、长出克隆后挑选单菌落作PCR ，鉴定其是否为阳性克隆。若获得阳性克
隆 则揺菌保种，划线鉴定，小量表达，电泳检测目的基因。
实验七 重组蛋白的表达及western blot 鉴定
表达试剂：10×D 10×YNB 500×B （实验六中已配）
10×GY ： 10ml甘油，90ml 水，高压灭菌。
10×M ：5ml 甲醇加水至100ml ，过滤除菌。
1M 磷酸钾缓冲液（ph6.0）:13.2 ml1M K2HPO4,86.8ml 1M KH2PO4,调至PH6.0。 （1M K2HPO4：22.822g ，80ml 水溶，定容至100ml ；1M KH2PO4：
6.8g ，40ml 水溶，定容至50ml ）
BMGY 培养基：4gYE ，8gTryptone ，280mlDDW ，高压灭菌后，超净台中加10×GY ，10×YNB ，1M 磷酸钾缓冲液（ph6.0）各40ml ，0.8ml 500×B
BMMY 培养基：1gYE ，2gTryptone ，70mlDDW ，高压灭菌后，超净台中加10×M ，10×YNB ，1M 磷酸钾缓冲液（ph6.0）各10ml ，0.2ml 500×B
挑酵母重组子接种于3ml YPD，摇菌过夜（16h ），转接于400ml BMGY培养基摇培24h ，静置4h 左右，倒掉上清，加入100mlBMMY ，摇培30h 左右，添加1ml 甲醇，24h 后再添加1ml 甲醇，24h 后收菌，12000rpm 离心15min ，留上清。 western blot 鉴定
样品准备
不同发酵时间的发酵液（900ul ），TCA-丙酮沉淀法沉淀蛋白。
1加脱氧胆酸钠至0.02％终浓度，混匀室温放置至少15min
2加100％TCA 至10％终浓度，混匀，室温至少放置1h
3 4度14000转离心10分钟，弃上清，倒置干燥
3 加冰预冷的丙酮，混合，低温放置至少20分钟
5 4度最高转速离心10分钟，倒上清，倒置干燥丙酮
30ul 一乘上样缓冲液溶解沉淀，沸水煮5分钟
总体时间3小时
所用试剂：
转膜缓冲液：（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris （MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，此溶液可重复使用3～5次（此溶液最好保存在4度冰箱，最多
使用5次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和SDS ，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和SDS 等比较困难）（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）
TBS 缓冲液：（10mM Tris-Hcl pH7.5, 150mmol/L NaCl）
1 mol/L Tris·HCl （pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
（可以配制成10×TBS 缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
10×TBS: Tris 12.11g ，NaCl 88g
蒸馏水至 900ml，调节pH 至7.5，定容1000ml
Tris 4.844g ，NaCl 35.2g 。蒸馏水至 350ml，调节pH 至7.5，定容400ml
TBST 缓冲液：（含0.05％Tween20的TBS 缓冲液）
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液： 脱脂奶粉 5g
TBST 100ml
最好现用现配。
或者用含5%BSA的TBST
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
一． 制备凝胶
样品制备过程中，制备凝胶
5％浓缩胶12％分离胶
配制凝固时间：分离胶30分钟，浓缩胶50分钟
电泳时间：80V 二十分钟，100V 100分钟左右。
可以降低电压，60V 80V
滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作) 。
A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中，约1-10分钟。再转入transfer buffer中。
D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
转膜
1. 准备6张和凝胶大小相近的滤纸和1张PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
2. 甲醇活性化PVDF 膜：一般活化5-10min ，用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的培养皿里浸泡。
3. 转膜液浸泡：将电泳好的凝胶剥下，去掉浓缩胶，切割成合适大小，注意目的条带的位置。在加有转移液的培养皿中放入切好的凝胶、平头镊子、一支玻璃棒、滤纸、浸过的膜。
4. 半干法转膜：在转膜液中对齐三层滤纸，用平头镊子赶出滤纸层中的气泡，夹出放在转膜仪上；膜盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒轻轻擀去气泡（由中间向两边赶）。将分离胶盖于膜上，并除气泡。在分离胶上盖3张滤纸并除去气泡。擀几下就可合起夹子。整个操作要不断的擀去气泡。
5. 盖上转膜仪上盖，设置好电压和时间。一般用半干转膜仪15V 45-60min
6转完后将膜用1×丽春红染液染1-2min （平头蘖枝夹住边缘，轻轻浸入染液）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白（超纯水多洗两遍，）。 将膜晾干备用。
封闭：将膜用TBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的培养皿中，室温下脱色摇
床上摇动封闭2h 。用TBS 将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可) 。
孵育一抗：一抗用封闭液（或者用含有5%BSA的TBST ）稀释至适当浓度（在1.5ml
离心管中）；将PVDF 膜放入PE 手套中，用封口机将膜封闭，将抗体溶液加到膜的蛋白面（转膜时做好标记）赶出残留气泡；室温下孵育2h 后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次（多洗几次，多加TBST ），每次10min ；
再用TBS 洗一次， 5min。
孵育二抗：同上方法准备稀释二抗，摇床，室温下孵育1h 后，用TBST 在室温 下脱色摇床上洗3次，每次10min ；再用TBS 洗一次，5min 。
一抗推荐稀释比例：1:200-1:2000
二抗推荐稀释比例：1:5000-1:100,0000
先前做过两次实验：一抗1:500，二抗1:2000，背景较重，出现非特异条带。 这次做可以先把二抗浓度改为1:20000，一抗：1:500 1:1000
DAB 显色
DAB （3,3二氨基联苯胺）和HRP 反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP 标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP ）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
ECL 灵敏度比DAB 高不少
实验八 重组蛋白的纯化
上步所得上清，进行65%硫酸铵沉淀，每100ml 上清加39.8硫酸铵（冰上操作，手动搅拌，不要剧烈），4°放置2h （可过夜）。12000rpm 离心15min ，2ml Tris 缓冲液溶解，将溶解的液体放入透析袋，透析约16h ，每隔6h 换一次透析液，透析完毕后过离子交换层析柱（Q 柱）。
5×Tris 缓冲液： Tris 12.114g/L PH调至8.0
1×Tris 缓冲液：5×Tris 缓冲液稀释4倍
300mM NaCl洗脱液： 3.5064g NaCl，200ml 1×Tris 缓冲液
500mM NaCl洗脱液：5.844g NaCl，200ml 1×Tris 缓冲液
1M NaCl洗脱液：11.688g NaCl，200ml 1×Tris 缓冲液