摘 要：色谱分析已成为当今分析化学领域应用最广泛的一种分析测试手段。在色谱分析中，消除基体干扰，提高分析灵敏度，延长仪器寿命是一个普遍问题，因此，对样品进行前处理非常重要。对检测器响应弱的样品，如没有紫外或荧光吸收（或自身有弱吸收）的待分析物，通过衍生技术改变其物理和化学性质，使之成为可被检测的化合物，从而实现灵敏分析；与此同时，也达到改善分离选择性的目的。 关键词：高效液相色谱；紫外衍生；荧光衍生； 一、衍生技术 随着液相色谱技术的发展，要求使用通用型的高灵敏检测器，但迄今为止，高效液相色谱还没有一个足以同气相色谱相比拟的通用型检测器。为了扩大高效液相色谱的适用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果，采用化学衍生法是一个行之有效的途径。化学衍生法是借助化学反应给样品化合物接上某个特定基团，从而改善样品混合物的检测性能和分离效果。 高效液相色谱的化学衍生法主要有以下几个目的： （1）提高对样品的检测灵敏度 （2）改善样品混合物的分离度 （3）适合于进一步作结构鉴定，如质谱，红外或核磁共振等。 衍生主要分为紫外和荧光衍生，下面我们将介绍这两种衍生方法。 1.紫外衍生技术 紫外衍生即加入发色团使正常形式下不能被检测的物质能够检测。发色团应具有较大的摩尔吸收系数，使其吸收光谱能尽量提高检测灵敏度，使背景噪音变小。一般情况下用于紫外衍生的试剂要有两个重要的官能团。第一个用于控制试剂与被测物反应，第二个用于紫外检测，即发色团。 常用的紫外衍生试剂有4-溴甲基-7甲氧基香豆醛（Br.MMC）、对-（9-葸酰氧基）苯甲酰甲基溴化物（PBr）、对-硝基苄基-N，N，-二异丙基异脲（FNBDI）、3，5-二硝基苄基-N，N’-二异丙基异脲（DNBDI）、溴化对-溴苯甲酰甲基（PBPB）、卜氨基萘（1.NA）、3，5-二硝基氯苄（DNBC），4-二甲基胺偶氮苯-4-亚磺酰基（Dabsyl.C1）等。 随着样品前处理技术的发展，化学衍生法也有了新的发展。例如在固相顶空微萃取时，将衍生试剂置于纤维上，这样就可以萃取和衍生同时进行，以避免溶剂损坏纤维上的吸附层。这种方法已经被用于血清中类固醇，多环芳烃化合物及其代谢物的分析。 2.荧光衍生技术 高效液相色谱的荧光检测器比紫外检测器灵敏度更高。具有强紫外吸收的化合物检测灵敏度可达ng级水平，而荧光衍生物的检测水平一般为1 0-12.1044 mol/L灵敏度比紫外检测器提高10-100倍。HPLC结合荧光检测方法所具有的高选择性、高灵敏度以及试样用量少的特性，使得其对各种复杂生物样品中的分析物测定变得更加灵敏、准确、快速。但荧光检测器要求被检测样品能被激发产生荧光。对于荧光较弱或不产生荧光的样品灵敏度则很低，甚至不能被检测。为了扩大检品范围，提高检测灵敏度，常采用荧光衍生法。 衍生化反应的关键是衍生试剂的选择，从实际分离和检测经验方面考虑，用于荧光衍生化反应的衍生化试剂应具备下列条件：（1）试剂应具有较大的摩尔吸光系数。（2）试剂应具有良好的发光发色性能，与分析物结合后不减弱。（3）衍生试剂对某一官能团的衍生反应具有高度选择性。（4）过量衍生试剂易从反应产物中分离，衍生物应具有好的色谱分离稳定性。（5）在温和条件下能够很快定量地生成衍生物。（6）形成的衍生物的荧光信号应远高于溶剂的背景吸收，对比明显且检测灵敏度高。（7）试剂合成方法简单，原料易得、毒性小。（8）生成的衍生物在甲醇或乙睛溶液中有足够的溶解度。（9）衍生物对光有足够稳定性。 目前常用的荧光衍生化试剂有：荧光胺（nuoresc锄ine，又名胺荧）、邻苯二甲醛（O-phthaldehyde）、丹酰氯（dansylchloride，DNS-C1）、4-氯-7-硝基-2，1，3-苯骈恶二唑（NBD.C1）等。胺类化合物的衍生试剂还有荧光素异硫氰酸酯（FITC）、芴代甲氧基酰氯（FMOC.C1）、4-氯-7-硝基.2，1，3.苯骈恶二唑（NBD.C1）、6-氨基喹啉琥珀酰亚胺碳酸酯（AQC）等。目前已开发出一些醇和酸的衍生化试剂。醇、酚的衍生试剂有：羰基氯类，芴代甲氧基酰氯；磺酰氯类，卤代三嗪类，1-乙氧基-4-（二氯.三嗪）萘（EDTN）；羧酸类化合物的衍生试剂有：4-溴甲基.7-甲氧基香豆素（BrMMC），7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯骈呋喃重氮（DBD.Pz）等。羰基化合物的衍生试剂还有肼类，如DNs.H、CEOC.H；氨基类，如氨基甲基芘等。 衍生化反应从是否形成共价键来说，可分为两种：标记和非标记反应，标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试剂之间形成共价键。而所有其它类型的反应都是非标记反应。另一种区分衍生化反应是根据衍生反应的场所，分为柱前衍生化（pfe.column derivatization），柱上衍生化（on.column derivatization）和柱后衍生化（post.column derivatization）三种。从是否与仪器联机的角度来分有在线（on.1ine）和离线（o仟-line）两种。 高效液相色谱荧光衍生化技术已经被广泛应用于醇、酸、糖，雌激素，生物碱的检测，其中在氨基酸样品的分析方面应用最为广泛，并且获得了长足的发展，无论是检测手段，还是衍生方法都趋于完善。此外高效液相色谱衍生化技术在其它化合物如胺类、抗生素类、甾族化合物、儿茶酚胺等的分析检测中，也有一定的应用。随着专一性强、灵敏度高的新型衍生化试剂的不断开发，高效液相色谱荧光衍生化技术在生物样品分析和手性对映体分离分析方面蓬勃发展。 参考文献 【1】徐瑾，张庆合，张维冰，色谱，2003，21：115. 【2】劳文剑，游静，尤进茂，分析测试技术与仪器，2001，7：28. 【3】毓庆.现代色谱法及其在医药中的应用.北京；人民卫生出版社，1998：I～3，166。
摘 要：色谱分析已成为当今分析化学领域应用最广泛的一种分析测试手段。在色谱分析中，消除基体干扰，提高分析灵敏度，延长仪器寿命是一个普遍问题，因此，对样品进行前处理非常重要。对检测器响应弱的样品，如没有紫外或荧光吸收（或自身有弱吸收）的待分析物，通过衍生技术改变其物理和化学性质，使之成为可被检测的化合物，从而实现灵敏分析；与此同时，也达到改善分离选择性的目的。 关键词：高效液相色谱；紫外衍生；荧光衍生； 一、衍生技术 随着液相色谱技术的发展，要求使用通用型的高灵敏检测器，但迄今为止，高效液相色谱还没有一个足以同气相色谱相比拟的通用型检测器。为了扩大高效液相色谱的适用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果，采用化学衍生法是一个行之有效的途径。化学衍生法是借助化学反应给样品化合物接上某个特定基团，从而改善样品混合物的检测性能和分离效果。 高效液相色谱的化学衍生法主要有以下几个目的： （1）提高对样品的检测灵敏度 （2）改善样品混合物的分离度 （3）适合于进一步作结构鉴定，如质谱，红外或核磁共振等。 衍生主要分为紫外和荧光衍生，下面我们将介绍这两种衍生方法。 1.紫外衍生技术 紫外衍生即加入发色团使正常形式下不能被检测的物质能够检测。发色团应具有较大的摩尔吸收系数，使其吸收光谱能尽量提高检测灵敏度，使背景噪音变小。一般情况下用于紫外衍生的试剂要有两个重要的官能团。第一个用于控制试剂与被测物反应，第二个用于紫外检测，即发色团。 常用的紫外衍生试剂有4-溴甲基-7甲氧基香豆醛（Br.MMC）、对-（9-葸酰氧基）苯甲酰甲基溴化物（PBr）、对-硝基苄基-N，N，-二异丙基异脲（FNBDI）、3，5-二硝基苄基-N，N’-二异丙基异脲（DNBDI）、溴化对-溴苯甲酰甲基（PBPB）、卜氨基萘（1.NA）、3，5-二硝基氯苄（DNBC），4-二甲基胺偶氮苯-4-亚磺酰基（Dabsyl.C1）等。 随着样品前处理技术的发展，化学衍生法也有了新的发展。例如在固相顶空微萃取时，将衍生试剂置于纤维上，这样就可以萃取和衍生同时进行，以避免溶剂损坏纤维上的吸附层。这种方法已经被用于血清中类固醇，多环芳烃化合物及其代谢物的分析。 2.荧光衍生技术 高效液相色谱的荧光检测器比紫外检测器灵敏度更高。具有强紫外吸收的化合物检测灵敏度可达ng级水平，而荧光衍生物的检测水平一般为1 0-12.1044 mol/L灵敏度比紫外检测器提高10-100倍。HPLC结合荧光检测方法所具有的高选择性、高灵敏度以及试样用量少的特性，使得其对各种复杂生物样品中的分析物测定变得更加灵敏、准确、快速。但荧光检测器要求被检测样品能被激发产生荧光。对于荧光较弱或不产生荧光的样品灵敏度则很低，甚至不能被检测。为了扩大检品范围，提高检测灵敏度，常采用荧光衍生法。 衍生化反应的关键是衍生试剂的选择，从实际分离和检测经验方面考虑，用于荧光衍生化反应的衍生化试剂应具备下列条件：（1）试剂应具有较大的摩尔吸光系数。（2）试剂应具有良好的发光发色性能，与分析物结合后不减弱。（3）衍生试剂对某一官能团的衍生反应具有高度选择性。（4）过量衍生试剂易从反应产物中分离，衍生物应具有好的色谱分离稳定性。（5）在温和条件下能够很快定量地生成衍生物。（6）形成的衍生物的荧光信号应远高于溶剂的背景吸收，对比明显且检测灵敏度高。（7）试剂合成方法简单，原料易得、毒性小。（8）生成的衍生物在甲醇或乙睛溶液中有足够的溶解度。（9）衍生物对光有足够稳定性。 目前常用的荧光衍生化试剂有：荧光胺（nuoresc锄ine，又名胺荧）、邻苯二甲醛（O-phthaldehyde）、丹酰氯（dansylchloride，DNS-C1）、4-氯-7-硝基-2，1，3-苯骈恶二唑（NBD.C1）等。胺类化合物的衍生试剂还有荧光素异硫氰酸酯（FITC）、芴代甲氧基酰氯（FMOC.C1）、4-氯-7-硝基.2，1，3.苯骈恶二唑（NBD.C1）、6-氨基喹啉琥珀酰亚胺碳酸酯（AQC）等。目前已开发出一些醇和酸的衍生化试剂。醇、酚的衍生试剂有：羰基氯类，芴代甲氧基酰氯；磺酰氯类，卤代三嗪类，1-乙氧基-4-（二氯.三嗪）萘（EDTN）；羧酸类化合物的衍生试剂有：4-溴甲基.7-甲氧基香豆素（BrMMC），7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯骈呋喃重氮（DBD.Pz）等。羰基化合物的衍生试剂还有肼类，如DNs.H、CEOC.H；氨基类，如氨基甲基芘等。 衍生化反应从是否形成共价键来说，可分为两种：标记和非标记反应，标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试剂之间形成共价键。而所有其它类型的反应都是非标记反应。另一种区分衍生化反应是根据衍生反应的场所，分为柱前衍生化（pfe.column derivatization），柱上衍生化（on.column derivatization）和柱后衍生化（post.column derivatization）三种。从是否与仪器联机的角度来分有在线（on.1ine）和离线（o仟-line）两种。 高效液相色谱荧光衍生化技术已经被广泛应用于醇、酸、糖，雌激素，生物碱的检测，其中在氨基酸样品的分析方面应用最为广泛，并且获得了长足的发展，无论是检测手段，还是衍生方法都趋于完善。此外高效液相色谱衍生化技术在其它化合物如胺类、抗生素类、甾族化合物、儿茶酚胺等的分析检测中，也有一定的应用。随着专一性强、灵敏度高的新型衍生化试剂的不断开发，高效液相色谱荧光衍生化技术在生物样品分析和手性对映体分离分析方面蓬勃发展。 参考文献 【1】徐瑾，张庆合，张维冰，色谱，2003，21：115. 【2】劳文剑，游静，尤进茂，分析测试技术与仪器，2001，7：28. 【3】毓庆.现代色谱法及其在医药中的应用.北京；人民卫生出版社，1998：I～3，166。