文章编号 ：１００４－０３７４（２０１０）１１－１１５４－０７
细胞命运，生死攸关
吴 缅
(合肥微尺度物质科学国家实验室/中国科学技术大学生命科学学院肿瘤和细胞凋亡实验室，合肥 230027)
摘 要：细胞凋亡是细胞生命活动中一种预定的、并受到严格控制的程序性死亡，它是细胞内一系列
促凋亡因子和抗凋亡因子相互作用后获得平衡的结果。细胞凋亡的调控可以发生在表观遗传、转录、翻译、修饰、转运等不同水平，也可以发生在细胞不同的区域，如细胞核、胞质、线粒体、质膜等处。作者近年来发现的新的促/抗凋亡因子从多种不同的角度去诠释细胞凋亡网络的调控。例如，Caspase新的激活机制；凋亡蛋白磷酸化和泛素化修饰以及蛋白通过对中间纤维的影响来诱导线粒体介导的凋亡等等。另外，对凋亡信号如何从胞核流向胞质进而促发线粒体引起的凋亡途径也进行了描述。这些新的凋亡调控机理进一步证明了，细胞凋亡可以发生在细胞生长发育不同的时相和空间，并存在着一个极其复杂的信号传递网络，这一调控网络一旦失去平衡，细胞会引发肿瘤。
关键词：细胞凋亡；p53；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶；泛素连接酶；肿瘤发生；中间纤维中图分类号：Q255 文献标识码：A
Cell fate, a matter of life and death
WU Mian
(Hefei National Laboratory for Physical Sciences at Microscale and School of Life Sciences, University of Science and
Technology of China, Hefei 230027, China)
Abstract: Apoptosis, or programmed cell death, is a default and well-controlled process during the celldevelopment. It reflects the net balance of interactions among various pro-apoptotic and anti-apoptotic factors.Regulations of apoptosis can occur at the levels of epigenetical regulation, transcription, translation, posttrans-lational modifications or transport. Also it can take place within different cellular compartments, such as nucleus,cytosol, plasma member and mitochondria. This short review intends to exemplify some new apoptosismechanisms using newly-defined pro- or anti-apoptotic factors recently characterized in our laboratory. Forexample, we characterized a novel activating mechanism for caspase-8; we described a specific phosphorylationon E3 ligase Pirh2, which led to the change in its target p53 stability; we also demonstrated how a E3 ligase Pirh2can act as holder for intermediate filament, thus to stabilize mitochondria, avoiding triggering apoptosis. Inaddition, the signal transduction pathway that apoptotic signals flow from nucleus to cytosol and finally tomitochondria is also described. All these new findings, together with what had been reported, demonstrate thatit truly exists a complicated network for apoptotic signaling within the cell, once it breaks, tumorgenesis begins.Key words: apoptosis; p53; caspase; E3 ligase; tumorgenesis; intermediate filaments (IFs)
收稿日期：2010-07-22
基金项目：国家自然科学基金重点项目(31030046)；国家自然科学基金面上项目(30871290)；国家自然科学基金海外青年学者合作研究基金(30728003)通讯作者：E-mail: [email protected]
第１１期吴 缅：细胞命运，生死攸关1155
Apoptosis，意指细胞凋亡，是细胞生命终结的一种重要方式，该词源自希腊文，本义是“花瓣从花朵或叶子从树枝落下”，是生命凋零的意思。然而，这一生命现象中所蕴含的自然规律非常复杂：树叶从树枝落下并不是树木生命的结束，而是为了渡过风雪严寒，并为延续其生命作出的一种“丢卒保车”式的自我牺牲。同样，细胞凋亡对于生命体本身来说也是其组织更新和个体发育所必需的。正因为细胞凋亡的存在，生命个体才能正常地生长直至生命的终点，这正如中国古代哲学中所描述的“方生方死”一样，细胞的凋亡与个体的生存休戚相关，如影随形，不能分离。一旦本该凋亡的细胞不能正常进行细胞死亡，将会导致疾病的发生，从而威胁生命，肿瘤细胞的无节制增殖就是一个例证。
细胞凋亡是一个高度程序化的过程，每一级信号的传递和效应分子的激活都如同预先设定好的一样，在亚细胞的空间和细胞活动的时段上精准地进行，从而保证了细胞凋亡的有效性和可控性。尽管从细胞凋亡发现至今已有五十多年，细胞凋亡的调控机制研究也已有了较多的积累。然而，参与这一调控的分子机制还远远没有被彻底认清，从2006年开始，我们实验室围绕着这些重要的凋亡调控分子的功能展开了一系列的研究。
如同中国古代的“阴阳”学说，自然事件总是受到正反两方面的控制。细胞凋亡也不例外，它受着促调亡(pro-apoptosis)和抑调亡(anti-apoptosis)两类调控分子的操控，而这两类分子间作用的平衡决定着细胞存亡的命运。细胞中有一类家族蛋白在抑凋亡机制中起重要作用，那就是Bcl-2蛋白家族。这一蛋白家族种类和功能非常复杂，它并不全是抑凋亡蛋白，同时还包括很多促凋亡蛋白，而扮演何种角色，则取决于它们所含BH (Bcl-2 homology)结构域的组成，通常含有BH1~4结构域的Bcl-2家族成员，如Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1等具有抑凋亡的功能，而含有不完整BH1~4结构域和仅含有BH3结构域(BH3 only)的蛋白如Bak、Bax、Bik、Bid、Puma和Bad等，则具有促凋亡的功能。有趣的是：这一蛋白家族中的成员的调控功能往往相辅相成又相互拮抗，比如，Bak和Bax可以通过形成异源聚合体，打开线粒体上的分子通道，释放促细胞凋亡因子进而促进细胞凋亡，而Bcl-2和Bcl-xl则能通过抑制这种聚合体的生成而抑制细胞凋亡。我们的研究
也表明了这一特殊关系的广泛存在。Puma和Mcl-1也同样是对细胞凋亡起相反作用的一对蛋白，在2005年我们发现它们两者之间也可以发生直接的相互作用，Mcl-1可以抑制Puma的活性；而Puma却起着稳定Mcl-1的作用[1]。这一机制表明，作用相反的双方可能在凋亡调控中同时发挥作用，而相互牵制依存，无形中呼应了一种“相生相克”的自然规律。我们还发现细胞经抗肿瘤药物喜树碱Camptothecin(CPT)处理后，抗凋亡因子Mcl-1上调，而促凋亡因子Noxa也上调，但其他BCL-2家族成员蛋白，例如Puma、Bcl-2以及Bcl-xl等并不上调，这说明CPT诱导的Mcl-1和Noxa上凋是具有选择性的[2]。
细胞中有一类蛋白能直接引发细胞凋亡，最典型的代表就是caspase，这些蛋白往往具有蛋白酶的特性，能够特异地在天冬氨酸位点将底物蛋白切割，但这种活性则往往依赖于自身的剪切激活，而依据这种剪切激活机制的不同，caspases又可以分为上游的起始caspase (initiate caspase)和下游直接作用于底物的效应caspase (effector caspase)。caspase-8作为重要的起始caspase, 它对下游caspase的激活和细胞凋亡的进程都起着关键的作用。对于caspase-8自身剪切激活机制的探索始终是caspase研究的焦点。尽管其死亡效应结构域(death effec-tor domain, DED)参与死亡触发复合物形成的功能已被广泛报道，但作为独立的功能单元，DED在细胞凋亡调控中的作用还有很多不清楚的地方。我们的研究发现，在抗癌药物TRAIL的刺激下，caspase-8/Mch5前体的N端部分在caspase-8激活后，能进一步在129位的天冬氨酸被剪切而生成两个独立的DED结构基元，其中氨基端的DED，即DEDa能够在核质穿梭蛋白ERK(extracellular signal-regulated kinase)的协同下转运至细胞核中，并富集于细胞核仁，通过与已知的一个p53结合蛋白TOPORS相互作用而使p53游离，从而激活其转录活性，增强对caspase-8酶原的转录。该工作揭示的DEDa所参与的正反馈调节机制补充了细胞凋亡响应过程中caspase-8酶原的重要作用作了清楚的解释。该研究成果有力地支持了在死亡受体介导的细胞凋亡过程中存在一个重要的调控机制，即caspase-8的自身放大正反馈途径，这一发现为研究细胞凋亡过程中信号网络调控提供了新的机制(图1)。另一方面，通过基因序列的比对，我们也发现该活
1156生命科学第２２
卷
图１ ＤＥＤａ参与的ｃａｓｐａｓｅ－８信号放大模型
细胞收到凋亡信号后，caspase-8在D129位被自身切割，DEDa由此被释放并与蛋白激酶ERK结合，经后者运输被带进核。DEDa在核中与TOPORS结合并置换出p53，后者再参与转录上调caspase-8基因。这样，虽然caspase-8在凋亡过程中不断地被切割消耗，但通过ERK-DEDa-TOPORS-p53，又可以源源不断对caspase-8
进行补充
图２ Ｃａｓｐａｓｅ－８中Ｄ１２９位自身切割位点在进化上的意义［３］
斑马鱼的caspase-8仅有半个DEDa和一个完整的DEDb，它们之间没有D129切割位点；鸡、鼠和狗等动物的caspase-8中虽然有完整的DEDa和DEDb，但两者之间也没有D129切割位点；只有黑猩猩与人类的caspase-8中，DEDa和DEDb中有D129切割位置
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化位点仅特异地出现在灵长类生物中(例如猩猩)，这也暗示了这一调控机制在生物进化上是比较近代的事件，为进一步认识细胞凋亡复杂调控网络在真核生物进化过程中的发生及发展提供了线索(图2)[3]。Gough[4]以“Death effector domain as a transcrip-tional regulator”为题，在Sciene STKE上对该工作作了专门介绍。
细胞中也存在一些蛋白，它们本身并不直接执行细胞凋亡的任务，而是通过诱导线粒体释放促细胞凋亡因子，间接地激活caspases触发细胞凋亡，其中就包括上面提到的Bcl-2家族成员和Smac/DIABLO。p53是细胞中最为著名的肿瘤抑制因子，它的缺失或突变可以解释人类近60%的肿瘤发生。p53作为重要的转录因子，它的主要功能是：参与细胞周期调控、DNA修复及细胞凋亡。前面已经讲到，Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1)可以拮抗同一个家族中的促凋亡蛋白(如Bax和Bak)的寡聚化，从而抑制线粒体外膜通透性的改变(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)。在细胞不受刺激的情况下，大部分p53存在于细胞核中，也有少部分存在于细胞质中；在细胞受到刺激的情况下，部分p53能够迅速从细胞核内转移到线粒体。最新的研究表明，由于p53与Bcl-xl的结合能力是Bcl-xl与Bax结合能力的50倍，所以p53能够从Bcl-xl/Bax复合物中置换出Bax，从而引起MOMP。另外，细胞核中的p53在凋亡信号刺激下，转录上调促凋亡因子Puma，后者与Bcl-xl有极强的亲和力，又能从Bcl-xl/p53 及Bcl-xl/Bax复合物中置换出p53或Bax，被置换出的p53和Bax能
进一步促进MOMP诱导释放促凋亡因子(如Smac、Omi及CytC等)，导致细胞凋亡(图3)。值得一提的是Bcl-2家族中的Bad，尽管其促细胞凋亡的作用很早就被发现，但是这一作用所受到的调控机制一直不清楚。我们从其基因转录水平的调控入手，成功地鉴定了它的一个受p53调控的启动子，并揭示了Bad-p53之间存在一个转录激活/抑制的负反馈loop的调节机制。我们也第一次提出：Bad可以将p53转运到线粒体，开启bak-bax分子开关并诱导细胞凋亡的一条新的作用通路[5]。这一发现揭示了一个p53转录非依赖型的新的调节机制。而对于Smac/DIABLO，虽然之前通过对IAP家族蛋白的研究，一系列作用于Smac/DIABLO的调节通路被发现，但是这些调控都发生在蛋白质水平，而事实上，在细胞凋亡起始过程中，对于Smac/DIABLO的调控早在基因转录时就已经开始，而其中起转录作用的一个重要因子就是E2F1，通过生物信息学与分子生物学方法相结合，我们成功地鉴定了E2F1在smac/diablo基因启动子区的作用靶点，并证实E2F1对Smac/DIABLO起转录上调的作用，细胞水平的研究也表明，在E2F1诱导的细胞凋亡中Smac/DIABLO起关键作用[6]。除此以外，我们发现Smac的量是受到IAP(inhibitor of apoptosis)家族成员调控的。我们发现：在细胞存活时，Livin、IAP家族的E3连接酶可以降解多余的Smac使得细胞不至于过多死亡；而在细胞凋亡时，Livin增加自身降解，减少对Smac的攻击，这样，细胞中有更多的Smac积累，有利于细胞凋亡的进行[7]。
依据促进或者抑制细胞凋亡可以将参与细胞凋亡调控的蛋白区分成两类，但是在这一复杂的体系里也存在着一些其他的重要的调控分子，能同时扮演双重角色，这类分子中很多是转录因子，它们转录的下游靶蛋白既有促凋亡分子又有抑凋亡分子，这就使得对于它们的研究更加困难，但同时也使它们的调控机制更加的微妙和严格。其中最为重要的蛋白就是p53，统计表明有近60％的肿瘤发生都与该蛋白功能的异常有关，而这种异常除了是由基因突变和染色体异常导致的之外，还有一个重要原因是，其自身往往可以转录激活一些负反馈因子，如Mdm2和Pirh2等的表达，这些具有泛素连接酶活性的蛋白可以直接降解p53，从而对其功能产生抑制。而更为复杂的是这类负调控机制本身还存在着一系列微调控(fine turning)来决定这一负反馈的平衡
图３ 细胞核内ｐ５３与细胞质中ｐ５３协同诱导细胞
凋亡
［８］
1158生命科学第２２卷
点。基于这种考虑，我们深入地研究了Pirh2-p53负调控loop的微调控。虽然Pirh2作为p53的一个泛素连接酶，对p53负调节的功能已经被报道，但其中具体的调控机制仍不清楚。我们的工作表明，Pirh2是一个磷酸化蛋白，并且其在肿瘤组织中的磷酸化水平较正常组织要低得多，且被磷酸化修饰后的Pirh2更不稳定更易被自身泛素化降解。通过进
一步的研究，我们发现Pirh2的154位苏氨酸和155位丝氨酸能被钙调蛋白依赖的蛋白激酶II磷酸化修饰，这种修饰表现出强烈的细胞周期依赖性；同时，一旦这两个位点被磷酸化修饰，Pirh2便丧失了对p53的泛素连接酶活性而不能促进p53的降解。这些发现都表明：Pirh2的磷酸化修饰作为p53-Pirh2负反馈调节的微调，对该机制平衡的维持起着重要的作用，而这一机制严密地调控着p53的稳定性及其肿瘤抑制功能(图4)。
综合这些发现，并结合肿瘤组织样本与正常组织样本中Pirh2磷酸化水平的差异比较以及免疫缺陷型小鼠体内成瘤试验，我们首次证明了Pirh2的磷酸化调控对于其泛素化降解p53以及促进肿瘤生长起重要作用。该研究成果表明，Pirh2的磷酸化被抑制，可能导致肿瘤抑制蛋白p53的水平下降并促进肿瘤生长，这为肿瘤发病机制的研究找出了一个潜在的病因；同时也为特异性的肿瘤靶向治疗提供了新的作用靶点[9]。研究结果如图5所示。
如上所述，Pirh2是p53的一个重要的泛素连接酶，它的磷酸化状态决定了它的细胞定位以及对p53的作用，但是Pirh2
在细胞质中的功能究竟是什么，
图４ 磷酸化调控Ｐｉｒｈ２降解ｐ５３
的分子机理模式图
图５ 磷酸化Ｐｉｒｈ２在免疫缺陷型小鼠体内的成瘤试验
Pirh2的154位和155位去磷酸化后，会引起p53的降解，由此引发肿瘤的生成。若Pirh2的第154和155位模拟磷酸化，那么磷酸化的Pirh2 就不能降解p53，小鼠因为有了足够的肿瘤抑制因子p53，就不出现或出现很小的肿瘤
第１１期吴 缅：细胞命运，生死攸关1159
我们发现Pirh2在细胞质中与中间纤维(intermediatefilament)的组成蛋白K8/K18结合(更精确地讲，Pirh2与K18结合而不与K8结合)，并且在UV照射下，Pirh2与K8/K18分开。实验结果表明，UV使JNK(c-Jun NH2-terminal kinase)激活，使K8/K18磷酸化，磷酸化的K8/K18与Pirh2不结合；一旦K8/K18与Pirh2分开，中间纤维会聚集成团状，并且影响微管，使与微管结合的细胞器，例如线粒体、内质网，也成团状聚集，最终影响线粒体的膜结构，导致Cytc及Smac释放，引起细胞凋亡[10] (图6)。最近有研究指出，K8、K18的糖基化可以保护表皮细胞免受伤害，研究人员在小鼠中转进不能糖基化的Keratin后发现，在药物作用下，小鼠的肝脏、
细胞凋亡外部通路(extrinsic apoptotic pathway)发挥作用。尽管其导致细胞凋亡的完整途径还不清楚，但其中的一些作用机制也同样显示出分子调控网络的协调性和复杂性。一个典型的代表就是核质穿梭蛋白RIP3，虽然它可以通过多种途径导致细胞凋亡的发生，但我们在2004年就发现它在亚细胞的定位决定它的功能，即RIP3 只有在细胞核中才能发挥凋亡功能[13]。通过进一步的深入研究我们发现：在细胞凋亡过程中RIP3在第328位被切割，虽然仍然不清楚被什么酶切割，但这一切割肯定是Caspase依赖性的。第328位的切割发生后，C端部分可以诱导不依赖于Caspase的凋亡(Caspase-independentapoptosis)，并且可以降低NF-κB的活性[14]。Feng等[15]利用FADD的Dominant Negative突变体，发现了RIP3在TNF-α的信号传导通路上其作用位置在FADD的上游，这一成果更加细化了RIP3在细胞凋亡途径中的信号传导通路。
目前认为细胞凋亡类型有两种：Type I包括死亡受体途径和线粒体途径；TypeⅡ即细胞自噬性死亡。因此，细胞膜/细胞质及线粒体成为细胞凋亡通路的关键部位。由于细胞核是细胞中最大的细胞器，它对于细胞凋亡的作用近年来受到越来越多的关注，因此我们猜测细胞核也有可能成为细胞中另一个重要的“Killing field”。当初我们申请基金委重点项目(3053020)所要研究的内容是：在本实验室原有基础上，利用质谱及现代分子细胞生物学手段，鉴定出更多的凋亡相关蛋白，阐明原来定于细胞核或经刺激后移位于细胞核的蛋白质是如何启始细胞凋亡的，并阐明这些凋亡/抗凋亡分子之间的作用网络的分子机制及生物学功能。
B23/NPM(核仁蛋白)是Oncoprotein，在细胞中尤其肿瘤细胞中高量表达。我们发现在核仁降解压力(例如ActD)刺激后B23会从核仁转到胞质，并使hnRNPU和hnRNPA一起转到胞质中，形成三聚体B23/hnRANPU/hnRNPA。该三聚体能抵抗ActD诱发的细胞凋亡[16]。这一机理的阐明对肿瘤防治有新的意义。有趣的是，我们还发现了B23在细胞核以外的功能。B23能在胞质中与Eg5结合，后者是一种专门利用自身ATP酶活去解聚微管的蛋白质。B23与Eg5结合后，使Eg5失去本身ATP酶的活性，从而不再能解聚微管[17]。
此外，我们还揭示了Siva1这一p53靶基因的新的功能。我们发现Siva1可以和p53、Mdm2
同
图６ Ｐｉｒｈ２对维持中间纤维及线粒体的完整是必需
的［６］
Pirh2 敲低以后，中间纤维和线粒体都从丝状变成团状。绿色：中间纤维组成蛋白Keratin18；红色：以MitoTracker标记的线粒体；蓝色：细胞核
胰腺等部分特别容易受伤害，表明K8、K18的糖基化对细胞存活具有重要作用[11]。
目前我们也正尝试依据这一重要信息开发针对Pirh2磷酸化水平相关的肿瘤诊断和治疗的新方法。这项研究也表明：泛素连接酶的活性很大程度上受到其他翻译后修饰的调控，例如磷酸化等修饰。很多研究都显示：一些与细胞凋亡相关的重要E3泛素连接酶的活性调控对于细胞响应调亡信号有重要意义，这种调控有时甚至发生在RNA的加工水平，例如Siah-1，作为细胞凋亡调控分子，其促调亡功能很大程度取决于其E3的活性。Mei等[12]研究发现，E3的活性可以由于拼接时选择另一种异构体Siah-S(Siah-1 short)而被抑制，这一发现对于了解该分子在肿瘤发生中活性的下降有重要意义。
还有一些能够引发细胞凋亡的分子，它们通过
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[6]
第２２卷
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时结合，促使Mdm2降解p53。在此过程中，Siva1起了接头蛋白(adaptor)的功能，而且Siva1必须处于二聚体或多聚体状态。如果没有DDHR(二聚所必需的结构域)，那么Siva1就不能促进Mdm2去降解p53[18]。ARF-Mdm2-p53是一条经典信号传导通路，我们发现Miz-1可以与p53结合，也可以与ARF结合，并且p53与ARF竞争结合Miz-1。若ARF/Miz-1结合，则p53转录不受Miz-1抑制，反过来Miz-1与p53在DNA结合区域结合，则p53转录活性受抑制[19]。
如上所述，细胞凋亡看似像落叶飘零那样简单，但事实上却受到如此复杂和严格的调控，而一旦这种调控机制发生异常，疾病将随之而来，如癌症、免疫功能异常、神经退行性疾病等都与细胞凋亡的失调紧密相关，这也正是我们投身于该研究的重要原因之一。如果将细胞凋亡看成是一曲死亡交响乐的话，站在台上参与表演的就是前面所提到的各种参与细胞凋亡调控的分子；而我们研究者就像是台下倾心聆听的观众，我们所做的每一项研究不过是在留意每个美妙的音符之语，并为这些精湛的表演所叹服。
［参 考 文 献］
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摘 要：细胞凋亡是细胞生命活动中一种预定的、并受到严格控制的程序性死亡，它是细胞内一系列
促凋亡因子和抗凋亡因子相互作用后获得平衡的结果。细胞凋亡的调控可以发生在表观遗传、转录、翻译、修饰、转运等不同水平，也可以发生在细胞不同的区域，如细胞核、胞质、线粒体、质膜等处。作者近年来发现的新的促/抗凋亡因子从多种不同的角度去诠释细胞凋亡网络的调控。例如，Caspase新的激活机制；凋亡蛋白磷酸化和泛素化修饰以及蛋白通过对中间纤维的影响来诱导线粒体介导的凋亡等等。另外，对凋亡信号如何从胞核流向胞质进而促发线粒体引起的凋亡途径也进行了描述。这些新的凋亡调控机理进一步证明了，细胞凋亡可以发生在细胞生长发育不同的时相和空间，并存在着一个极其复杂的信号传递网络，这一调控网络一旦失去平衡，细胞会引发肿瘤。
关键词：细胞凋亡；p53；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶；泛素连接酶；肿瘤发生；中间纤维中图分类号：Q255 文献标识码：A
Cell fate, a matter of life and death
WU Mian
(Hefei National Laboratory for Physical Sciences at Microscale and School of Life Sciences, University of Science and
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Abstract: Apoptosis, or programmed cell death, is a default and well-controlled process during the celldevelopment. It reflects the net balance of interactions among various pro-apoptotic and anti-apoptotic factors.Regulations of apoptosis can occur at the levels of epigenetical regulation, transcription, translation, posttrans-lational modifications or transport. Also it can take place within different cellular compartments, such as nucleus,cytosol, plasma member and mitochondria. This short review intends to exemplify some new apoptosismechanisms using newly-defined pro- or anti-apoptotic factors recently characterized in our laboratory. Forexample, we characterized a novel activating mechanism for caspase-8; we described a specific phosphorylationon E3 ligase Pirh2, which led to the change in its target p53 stability; we also demonstrated how a E3 ligase Pirh2can act as holder for intermediate filament, thus to stabilize mitochondria, avoiding triggering apoptosis. Inaddition, the signal transduction pathway that apoptotic signals flow from nucleus to cytosol and finally tomitochondria is also described. All these new findings, together with what had been reported, demonstrate thatit truly exists a complicated network for apoptotic signaling within the cell, once it breaks, tumorgenesis begins.Key words: apoptosis; p53; caspase; E3 ligase; tumorgenesis; intermediate filaments (IFs)
收稿日期：2010-07-22
基金项目：国家自然科学基金重点项目(31030046)；国家自然科学基金面上项目(30871290)；国家自然科学基金海外青年学者合作研究基金(30728003)通讯作者：E-mail: [email protected]
第１１期吴 缅：细胞命运，生死攸关1155
Apoptosis，意指细胞凋亡，是细胞生命终结的一种重要方式，该词源自希腊文，本义是“花瓣从花朵或叶子从树枝落下”，是生命凋零的意思。然而，这一生命现象中所蕴含的自然规律非常复杂：树叶从树枝落下并不是树木生命的结束，而是为了渡过风雪严寒，并为延续其生命作出的一种“丢卒保车”式的自我牺牲。同样，细胞凋亡对于生命体本身来说也是其组织更新和个体发育所必需的。正因为细胞凋亡的存在，生命个体才能正常地生长直至生命的终点，这正如中国古代哲学中所描述的“方生方死”一样，细胞的凋亡与个体的生存休戚相关，如影随形，不能分离。一旦本该凋亡的细胞不能正常进行细胞死亡，将会导致疾病的发生，从而威胁生命，肿瘤细胞的无节制增殖就是一个例证。
细胞凋亡是一个高度程序化的过程，每一级信号的传递和效应分子的激活都如同预先设定好的一样，在亚细胞的空间和细胞活动的时段上精准地进行，从而保证了细胞凋亡的有效性和可控性。尽管从细胞凋亡发现至今已有五十多年，细胞凋亡的调控机制研究也已有了较多的积累。然而，参与这一调控的分子机制还远远没有被彻底认清，从2006年开始，我们实验室围绕着这些重要的凋亡调控分子的功能展开了一系列的研究。
如同中国古代的“阴阳”学说，自然事件总是受到正反两方面的控制。细胞凋亡也不例外，它受着促调亡(pro-apoptosis)和抑调亡(anti-apoptosis)两类调控分子的操控，而这两类分子间作用的平衡决定着细胞存亡的命运。细胞中有一类家族蛋白在抑凋亡机制中起重要作用，那就是Bcl-2蛋白家族。这一蛋白家族种类和功能非常复杂，它并不全是抑凋亡蛋白，同时还包括很多促凋亡蛋白，而扮演何种角色，则取决于它们所含BH (Bcl-2 homology)结构域的组成，通常含有BH1~4结构域的Bcl-2家族成员，如Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1等具有抑凋亡的功能，而含有不完整BH1~4结构域和仅含有BH3结构域(BH3 only)的蛋白如Bak、Bax、Bik、Bid、Puma和Bad等，则具有促凋亡的功能。有趣的是：这一蛋白家族中的成员的调控功能往往相辅相成又相互拮抗，比如，Bak和Bax可以通过形成异源聚合体，打开线粒体上的分子通道，释放促细胞凋亡因子进而促进细胞凋亡，而Bcl-2和Bcl-xl则能通过抑制这种聚合体的生成而抑制细胞凋亡。我们的研究
也表明了这一特殊关系的广泛存在。Puma和Mcl-1也同样是对细胞凋亡起相反作用的一对蛋白，在2005年我们发现它们两者之间也可以发生直接的相互作用，Mcl-1可以抑制Puma的活性；而Puma却起着稳定Mcl-1的作用[1]。这一机制表明，作用相反的双方可能在凋亡调控中同时发挥作用，而相互牵制依存，无形中呼应了一种“相生相克”的自然规律。我们还发现细胞经抗肿瘤药物喜树碱Camptothecin(CPT)处理后，抗凋亡因子Mcl-1上调，而促凋亡因子Noxa也上调，但其他BCL-2家族成员蛋白，例如Puma、Bcl-2以及Bcl-xl等并不上调，这说明CPT诱导的Mcl-1和Noxa上凋是具有选择性的[2]。
细胞中有一类蛋白能直接引发细胞凋亡，最典型的代表就是caspase，这些蛋白往往具有蛋白酶的特性，能够特异地在天冬氨酸位点将底物蛋白切割，但这种活性则往往依赖于自身的剪切激活，而依据这种剪切激活机制的不同，caspases又可以分为上游的起始caspase (initiate caspase)和下游直接作用于底物的效应caspase (effector caspase)。caspase-8作为重要的起始caspase, 它对下游caspase的激活和细胞凋亡的进程都起着关键的作用。对于caspase-8自身剪切激活机制的探索始终是caspase研究的焦点。尽管其死亡效应结构域(death effec-tor domain, DED)参与死亡触发复合物形成的功能已被广泛报道，但作为独立的功能单元，DED在细胞凋亡调控中的作用还有很多不清楚的地方。我们的研究发现，在抗癌药物TRAIL的刺激下，caspase-8/Mch5前体的N端部分在caspase-8激活后，能进一步在129位的天冬氨酸被剪切而生成两个独立的DED结构基元，其中氨基端的DED，即DEDa能够在核质穿梭蛋白ERK(extracellular signal-regulated kinase)的协同下转运至细胞核中，并富集于细胞核仁，通过与已知的一个p53结合蛋白TOPORS相互作用而使p53游离，从而激活其转录活性，增强对caspase-8酶原的转录。该工作揭示的DEDa所参与的正反馈调节机制补充了细胞凋亡响应过程中caspase-8酶原的重要作用作了清楚的解释。该研究成果有力地支持了在死亡受体介导的细胞凋亡过程中存在一个重要的调控机制，即caspase-8的自身放大正反馈途径，这一发现为研究细胞凋亡过程中信号网络调控提供了新的机制(图1)。另一方面，通过基因序列的比对，我们也发现该活
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卷
图１ ＤＥＤａ参与的ｃａｓｐａｓｅ－８信号放大模型
细胞收到凋亡信号后，caspase-8在D129位被自身切割，DEDa由此被释放并与蛋白激酶ERK结合，经后者运输被带进核。DEDa在核中与TOPORS结合并置换出p53，后者再参与转录上调caspase-8基因。这样，虽然caspase-8在凋亡过程中不断地被切割消耗，但通过ERK-DEDa-TOPORS-p53，又可以源源不断对caspase-8
进行补充
图２ Ｃａｓｐａｓｅ－８中Ｄ１２９位自身切割位点在进化上的意义［３］
斑马鱼的caspase-8仅有半个DEDa和一个完整的DEDb，它们之间没有D129切割位点；鸡、鼠和狗等动物的caspase-8中虽然有完整的DEDa和DEDb，但两者之间也没有D129切割位点；只有黑猩猩与人类的caspase-8中，DEDa和DEDb中有D129切割位置
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化位点仅特异地出现在灵长类生物中(例如猩猩)，这也暗示了这一调控机制在生物进化上是比较近代的事件，为进一步认识细胞凋亡复杂调控网络在真核生物进化过程中的发生及发展提供了线索(图2)[3]。Gough[4]以“Death effector domain as a transcrip-tional regulator”为题，在Sciene STKE上对该工作作了专门介绍。
细胞中也存在一些蛋白，它们本身并不直接执行细胞凋亡的任务，而是通过诱导线粒体释放促细胞凋亡因子，间接地激活caspases触发细胞凋亡，其中就包括上面提到的Bcl-2家族成员和Smac/DIABLO。p53是细胞中最为著名的肿瘤抑制因子，它的缺失或突变可以解释人类近60%的肿瘤发生。p53作为重要的转录因子，它的主要功能是：参与细胞周期调控、DNA修复及细胞凋亡。前面已经讲到，Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1)可以拮抗同一个家族中的促凋亡蛋白(如Bax和Bak)的寡聚化，从而抑制线粒体外膜通透性的改变(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)。在细胞不受刺激的情况下，大部分p53存在于细胞核中，也有少部分存在于细胞质中；在细胞受到刺激的情况下，部分p53能够迅速从细胞核内转移到线粒体。最新的研究表明，由于p53与Bcl-xl的结合能力是Bcl-xl与Bax结合能力的50倍，所以p53能够从Bcl-xl/Bax复合物中置换出Bax，从而引起MOMP。另外，细胞核中的p53在凋亡信号刺激下，转录上调促凋亡因子Puma，后者与Bcl-xl有极强的亲和力，又能从Bcl-xl/p53 及Bcl-xl/Bax复合物中置换出p53或Bax，被置换出的p53和Bax能
进一步促进MOMP诱导释放促凋亡因子(如Smac、Omi及CytC等)，导致细胞凋亡(图3)。值得一提的是Bcl-2家族中的Bad，尽管其促细胞凋亡的作用很早就被发现，但是这一作用所受到的调控机制一直不清楚。我们从其基因转录水平的调控入手，成功地鉴定了它的一个受p53调控的启动子，并揭示了Bad-p53之间存在一个转录激活/抑制的负反馈loop的调节机制。我们也第一次提出：Bad可以将p53转运到线粒体，开启bak-bax分子开关并诱导细胞凋亡的一条新的作用通路[5]。这一发现揭示了一个p53转录非依赖型的新的调节机制。而对于Smac/DIABLO，虽然之前通过对IAP家族蛋白的研究，一系列作用于Smac/DIABLO的调节通路被发现，但是这些调控都发生在蛋白质水平，而事实上，在细胞凋亡起始过程中，对于Smac/DIABLO的调控早在基因转录时就已经开始，而其中起转录作用的一个重要因子就是E2F1，通过生物信息学与分子生物学方法相结合，我们成功地鉴定了E2F1在smac/diablo基因启动子区的作用靶点，并证实E2F1对Smac/DIABLO起转录上调的作用，细胞水平的研究也表明，在E2F1诱导的细胞凋亡中Smac/DIABLO起关键作用[6]。除此以外，我们发现Smac的量是受到IAP(inhibitor of apoptosis)家族成员调控的。我们发现：在细胞存活时，Livin、IAP家族的E3连接酶可以降解多余的Smac使得细胞不至于过多死亡；而在细胞凋亡时，Livin增加自身降解，减少对Smac的攻击，这样，细胞中有更多的Smac积累，有利于细胞凋亡的进行[7]。
依据促进或者抑制细胞凋亡可以将参与细胞凋亡调控的蛋白区分成两类，但是在这一复杂的体系里也存在着一些其他的重要的调控分子，能同时扮演双重角色，这类分子中很多是转录因子，它们转录的下游靶蛋白既有促凋亡分子又有抑凋亡分子，这就使得对于它们的研究更加困难，但同时也使它们的调控机制更加的微妙和严格。其中最为重要的蛋白就是p53，统计表明有近60％的肿瘤发生都与该蛋白功能的异常有关，而这种异常除了是由基因突变和染色体异常导致的之外，还有一个重要原因是，其自身往往可以转录激活一些负反馈因子，如Mdm2和Pirh2等的表达，这些具有泛素连接酶活性的蛋白可以直接降解p53，从而对其功能产生抑制。而更为复杂的是这类负调控机制本身还存在着一系列微调控(fine turning)来决定这一负反馈的平衡
图３ 细胞核内ｐ５３与细胞质中ｐ５３协同诱导细胞
凋亡
［８］
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点。基于这种考虑，我们深入地研究了Pirh2-p53负调控loop的微调控。虽然Pirh2作为p53的一个泛素连接酶，对p53负调节的功能已经被报道，但其中具体的调控机制仍不清楚。我们的工作表明，Pirh2是一个磷酸化蛋白，并且其在肿瘤组织中的磷酸化水平较正常组织要低得多，且被磷酸化修饰后的Pirh2更不稳定更易被自身泛素化降解。通过进
一步的研究，我们发现Pirh2的154位苏氨酸和155位丝氨酸能被钙调蛋白依赖的蛋白激酶II磷酸化修饰，这种修饰表现出强烈的细胞周期依赖性；同时，一旦这两个位点被磷酸化修饰，Pirh2便丧失了对p53的泛素连接酶活性而不能促进p53的降解。这些发现都表明：Pirh2的磷酸化修饰作为p53-Pirh2负反馈调节的微调，对该机制平衡的维持起着重要的作用，而这一机制严密地调控着p53的稳定性及其肿瘤抑制功能(图4)。
综合这些发现，并结合肿瘤组织样本与正常组织样本中Pirh2磷酸化水平的差异比较以及免疫缺陷型小鼠体内成瘤试验，我们首次证明了Pirh2的磷酸化调控对于其泛素化降解p53以及促进肿瘤生长起重要作用。该研究成果表明，Pirh2的磷酸化被抑制，可能导致肿瘤抑制蛋白p53的水平下降并促进肿瘤生长，这为肿瘤发病机制的研究找出了一个潜在的病因；同时也为特异性的肿瘤靶向治疗提供了新的作用靶点[9]。研究结果如图5所示。
如上所述，Pirh2是p53的一个重要的泛素连接酶，它的磷酸化状态决定了它的细胞定位以及对p53的作用，但是Pirh2
在细胞质中的功能究竟是什么，
图４ 磷酸化调控Ｐｉｒｈ２降解ｐ５３
的分子机理模式图
图５ 磷酸化Ｐｉｒｈ２在免疫缺陷型小鼠体内的成瘤试验
Pirh2的154位和155位去磷酸化后，会引起p53的降解，由此引发肿瘤的生成。若Pirh2的第154和155位模拟磷酸化，那么磷酸化的Pirh2 就不能降解p53，小鼠因为有了足够的肿瘤抑制因子p53，就不出现或出现很小的肿瘤
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我们发现Pirh2在细胞质中与中间纤维(intermediatefilament)的组成蛋白K8/K18结合(更精确地讲，Pirh2与K18结合而不与K8结合)，并且在UV照射下，Pirh2与K8/K18分开。实验结果表明，UV使JNK(c-Jun NH2-terminal kinase)激活，使K8/K18磷酸化，磷酸化的K8/K18与Pirh2不结合；一旦K8/K18与Pirh2分开，中间纤维会聚集成团状，并且影响微管，使与微管结合的细胞器，例如线粒体、内质网，也成团状聚集，最终影响线粒体的膜结构，导致Cytc及Smac释放，引起细胞凋亡[10] (图6)。最近有研究指出，K8、K18的糖基化可以保护表皮细胞免受伤害，研究人员在小鼠中转进不能糖基化的Keratin后发现，在药物作用下，小鼠的肝脏、
细胞凋亡外部通路(extrinsic apoptotic pathway)发挥作用。尽管其导致细胞凋亡的完整途径还不清楚，但其中的一些作用机制也同样显示出分子调控网络的协调性和复杂性。一个典型的代表就是核质穿梭蛋白RIP3，虽然它可以通过多种途径导致细胞凋亡的发生，但我们在2004年就发现它在亚细胞的定位决定它的功能，即RIP3 只有在细胞核中才能发挥凋亡功能[13]。通过进一步的深入研究我们发现：在细胞凋亡过程中RIP3在第328位被切割，虽然仍然不清楚被什么酶切割，但这一切割肯定是Caspase依赖性的。第328位的切割发生后，C端部分可以诱导不依赖于Caspase的凋亡(Caspase-independentapoptosis)，并且可以降低NF-κB的活性[14]。Feng等[15]利用FADD的Dominant Negative突变体，发现了RIP3在TNF-α的信号传导通路上其作用位置在FADD的上游，这一成果更加细化了RIP3在细胞凋亡途径中的信号传导通路。
目前认为细胞凋亡类型有两种：Type I包括死亡受体途径和线粒体途径；TypeⅡ即细胞自噬性死亡。因此，细胞膜/细胞质及线粒体成为细胞凋亡通路的关键部位。由于细胞核是细胞中最大的细胞器，它对于细胞凋亡的作用近年来受到越来越多的关注，因此我们猜测细胞核也有可能成为细胞中另一个重要的“Killing field”。当初我们申请基金委重点项目(3053020)所要研究的内容是：在本实验室原有基础上，利用质谱及现代分子细胞生物学手段，鉴定出更多的凋亡相关蛋白，阐明原来定于细胞核或经刺激后移位于细胞核的蛋白质是如何启始细胞凋亡的，并阐明这些凋亡/抗凋亡分子之间的作用网络的分子机制及生物学功能。
B23/NPM(核仁蛋白)是Oncoprotein，在细胞中尤其肿瘤细胞中高量表达。我们发现在核仁降解压力(例如ActD)刺激后B23会从核仁转到胞质，并使hnRNPU和hnRNPA一起转到胞质中，形成三聚体B23/hnRANPU/hnRNPA。该三聚体能抵抗ActD诱发的细胞凋亡[16]。这一机理的阐明对肿瘤防治有新的意义。有趣的是，我们还发现了B23在细胞核以外的功能。B23能在胞质中与Eg5结合，后者是一种专门利用自身ATP酶活去解聚微管的蛋白质。B23与Eg5结合后，使Eg5失去本身ATP酶的活性，从而不再能解聚微管[17]。
此外，我们还揭示了Siva1这一p53靶基因的新的功能。我们发现Siva1可以和p53、Mdm2
同
图６ Ｐｉｒｈ２对维持中间纤维及线粒体的完整是必需
的［６］
Pirh2 敲低以后，中间纤维和线粒体都从丝状变成团状。绿色：中间纤维组成蛋白Keratin18；红色：以MitoTracker标记的线粒体；蓝色：细胞核
胰腺等部分特别容易受伤害，表明K8、K18的糖基化对细胞存活具有重要作用[11]。
目前我们也正尝试依据这一重要信息开发针对Pirh2磷酸化水平相关的肿瘤诊断和治疗的新方法。这项研究也表明：泛素连接酶的活性很大程度上受到其他翻译后修饰的调控，例如磷酸化等修饰。很多研究都显示：一些与细胞凋亡相关的重要E3泛素连接酶的活性调控对于细胞响应调亡信号有重要意义，这种调控有时甚至发生在RNA的加工水平，例如Siah-1，作为细胞凋亡调控分子，其促调亡功能很大程度取决于其E3的活性。Mei等[12]研究发现，E3的活性可以由于拼接时选择另一种异构体Siah-S(Siah-1 short)而被抑制，这一发现对于了解该分子在肿瘤发生中活性的下降有重要意义。
还有一些能够引发细胞凋亡的分子，它们通过
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时结合，促使Mdm2降解p53。在此过程中，Siva1起了接头蛋白(adaptor)的功能，而且Siva1必须处于二聚体或多聚体状态。如果没有DDHR(二聚所必需的结构域)，那么Siva1就不能促进Mdm2去降解p53[18]。ARF-Mdm2-p53是一条经典信号传导通路，我们发现Miz-1可以与p53结合，也可以与ARF结合，并且p53与ARF竞争结合Miz-1。若ARF/Miz-1结合，则p53转录不受Miz-1抑制，反过来Miz-1与p53在DNA结合区域结合，则p53转录活性受抑制[19]。
如上所述，细胞凋亡看似像落叶飘零那样简单，但事实上却受到如此复杂和严格的调控，而一旦这种调控机制发生异常，疾病将随之而来，如癌症、免疫功能异常、神经退行性疾病等都与细胞凋亡的失调紧密相关，这也正是我们投身于该研究的重要原因之一。如果将细胞凋亡看成是一曲死亡交响乐的话，站在台上参与表演的就是前面所提到的各种参与细胞凋亡调控的分子；而我们研究者就像是台下倾心聆听的观众，我们所做的每一项研究不过是在留意每个美妙的音符之语，并为这些精湛的表演所叹服。
［参 考 文 献］
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