实验目的 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。
二、 实验原理 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中,蛋白质为正离子,在电场中向阴极移动;在pH值大于其等电点的溶液中,蛋白质为负离子,在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质,它们所具有的可解离基团不同,在同一pH的溶液中,所带净电荷不同,故可利用电泳法将它们分离。 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等,各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同,在电场中迁移速度不同。由表可知,血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0,所以在pH8.6的缓冲液中,它们都电离成负离子,在电场中向阳极移动。
蛋白质名称 等电点 相对分子质量
白蛋白 4.88 69000
α1-球蛋白 5.06 200000
α2-球蛋白 5.06 300000
β-球蛋白 5.12 90000~150000
γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000
在一定范围内,蛋白质的含量与结合的染料量成正比,故可将蛋白质区带剪下,分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来,进行比色,测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描,测定其相对含量。
肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高,γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低,而α1、γ-球蛋白升高。
三、 实验器材
1、醋酸纤维薄膜(2cm*8cm,厚度120μm)
2、人血清; 3、烧杯及培养皿 数只; 4、点样器; 5、竹镊子; 6、玻璃棒;
7、电吹风; 8、试管 六只; 9、恒温水浴锅;10、电泳槽; 11、直流稳压电泳仪; 12、剪刀
四、 实验试剂
1. 电极缓冲液 : 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(可重复使用,隔一星期过滤一次):,分别称取巴比妥钠12.76g和巴比妥1.66g溶解于1000ml蒸馏水中。
2. 染色液(可重复使用,使用后回收) :取氨基黑10B 0.5g溶于100ml SDS-PAGE电泳脱色液中。
3. 漂洗液(100ml):95%乙醇45ml,冰醋酸5ml,水50ml。
4 透明液(20ml):无水乙醇:冰醋酸=7:3。
五、 实验步骤
⒈ 薄膜浸泡: 提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上;
⒉ 电泳仪检查: 水平检查,电源检查;
⒊ 电泳槽的准备: 在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液。将滤纸条对折,翻过来,用电极缓冲液完全浸湿,架在电泳槽的四个膜支架上,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内。用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,故称为滤纸桥。
⒋ 点样: 取新鲜血清于载玻片上,将盖玻片掰呈适宜大小,使一边小于
薄膜宽度(1.5cm)。把浸泡好的可用的醋酸纤维素薄膜取出,用滤纸吸去表面多余的液体,然后平铺在滤纸上,将盖玻片在血清中轻轻划一下,再在膜条一端
1.5~2cm处轻轻地水平落下并迅速提起,即在膜条上点上了细条状的样品。
⒌ 电泳: 用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上,用镊子将其中气泡赶出。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。盖上电泳槽盖。接好电路,调节电压到90V,预电泳10min,再调电压至110V,电泳时间50min~
生化实验报告
⒍ 染色: 将染液倒入大培养皿中,电泳完毕立即用镊子取出薄膜,直接浸入染色液中,染色9min,然后取出。
⒎ 漂洗: 配制好漂洗液,将染色完毕的薄膜自染液中取出,直接放入漂洗液中,连续更换几次漂洗液,直到薄膜背景几乎无色为止。
⒏ 透明: 配制好透明液,用镊子将薄膜取出,贴在容器壁上(烧杯壁或培养皿上等),注意不可有气泡,用吹风机稍吹干薄膜,用胶头滴管淋洗薄膜,将每组20ml透明液淋洗玩即可,再用吹风机将薄膜彻底吹干,此时薄膜透明,小心将薄膜自容器壁上取下。
六、注意事项
1. 点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多,点样位置要合适。
2. 两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面,否则会因虹吸影响电泳效果。
3. 醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大, 以防止薄膜干燥,电泳图谱出现条痕。
实验目的 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。
二、 实验原理 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中,蛋白质为正离子,在电场中向阴极移动;在pH值大于其等电点的溶液中,蛋白质为负离子,在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质,它们所具有的可解离基团不同,在同一pH的溶液中,所带净电荷不同,故可利用电泳法将它们分离。 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等,各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同,在电场中迁移速度不同。由表可知,血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0,所以在pH8.6的缓冲液中,它们都电离成负离子,在电场中向阳极移动。
蛋白质名称 等电点 相对分子质量
白蛋白 4.88 69000
α1-球蛋白 5.06 200000
α2-球蛋白 5.06 300000
β-球蛋白 5.12 90000~150000
γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000
在一定范围内,蛋白质的含量与结合的染料量成正比,故可将蛋白质区带剪下,分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来,进行比色,测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描,测定其相对含量。
肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高,γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低,而α1、γ-球蛋白升高。
三、 实验器材
1、醋酸纤维薄膜(2cm*8cm,厚度120μm)
2、人血清; 3、烧杯及培养皿 数只; 4、点样器; 5、竹镊子; 6、玻璃棒;
7、电吹风; 8、试管 六只; 9、恒温水浴锅;10、电泳槽; 11、直流稳压电泳仪; 12、剪刀
四、 实验试剂
1. 电极缓冲液 : 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(可重复使用,隔一星期过滤一次):,分别称取巴比妥钠12.76g和巴比妥1.66g溶解于1000ml蒸馏水中。
2. 染色液(可重复使用,使用后回收) :取氨基黑10B 0.5g溶于100ml SDS-PAGE电泳脱色液中。
3. 漂洗液(100ml):95%乙醇45ml,冰醋酸5ml,水50ml。
4 透明液(20ml):无水乙醇:冰醋酸=7:3。
五、 实验步骤
⒈ 薄膜浸泡: 提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上;
⒉ 电泳仪检查: 水平检查,电源检查;
⒊ 电泳槽的准备: 在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液。将滤纸条对折,翻过来,用电极缓冲液完全浸湿,架在电泳槽的四个膜支架上,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内。用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,故称为滤纸桥。
⒋ 点样: 取新鲜血清于载玻片上,将盖玻片掰呈适宜大小,使一边小于
薄膜宽度(1.5cm)。把浸泡好的可用的醋酸纤维素薄膜取出,用滤纸吸去表面多余的液体,然后平铺在滤纸上,将盖玻片在血清中轻轻划一下,再在膜条一端
1.5~2cm处轻轻地水平落下并迅速提起,即在膜条上点上了细条状的样品。
⒌ 电泳: 用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上,用镊子将其中气泡赶出。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。盖上电泳槽盖。接好电路,调节电压到90V,预电泳10min,再调电压至110V,电泳时间50min~
生化实验报告
⒍ 染色: 将染液倒入大培养皿中,电泳完毕立即用镊子取出薄膜,直接浸入染色液中,染色9min,然后取出。
⒎ 漂洗: 配制好漂洗液,将染色完毕的薄膜自染液中取出,直接放入漂洗液中,连续更换几次漂洗液,直到薄膜背景几乎无色为止。
⒏ 透明: 配制好透明液,用镊子将薄膜取出,贴在容器壁上(烧杯壁或培养皿上等),注意不可有气泡,用吹风机稍吹干薄膜,用胶头滴管淋洗薄膜,将每组20ml透明液淋洗玩即可,再用吹风机将薄膜彻底吹干,此时薄膜透明,小心将薄膜自容器壁上取下。
六、注意事项
1. 点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多,点样位置要合适。
2. 两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面,否则会因虹吸影响电泳效果。
3. 醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大, 以防止薄膜干燥,电泳图谱出现条痕。