一、 利用紫外光谱测定黄酮类化合物的结构
大多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。出现在300～400nm之间的吸收带称为带Ⅰ，出现在240～280nm之间的吸收带称为带Ⅱ。不同类型的黄酮化合物的带Ⅰ或带Ⅱ的峰位、峰形和吸收强度不同，因此从紫外光谱可以推测黄酮类化合物的结构类型。
当向黄酮类化合物的甲醇（或乙醇）溶液中分别加入甲醇钠（NaOMe）、乙酸钠（NaOAc）、乙酸钠-硼酸（NaOAc-H3BO3）、三氯化铝或三氯化铝-盐酸（AlCl3/HCl）试剂能使黄酮的酚羟基离解或形成络合物等，导致光谱发生变化。据此变化可以判断各类化合物的结构，这些试剂对结构具有诊断意义，称为诊断试剂。
黄酮和黄酮醇类
（一）黄酮、黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征
黄酮或黄酮醇的带Ⅰ是由B环桂皮酰基系统的电子跃迁所引起的吸收，带Ⅱ是由A环的苯甲酰基系统的电子跃迁所引起的吸收。
黄酮和黄酮醇的UV光谱图形相似，仅带Ⅰ位置不同，黄酮带Ⅰ位于304～350nm，黄酮醇带Ⅰ位于358～385nm。利用带Ⅰ的峰位不同，可以区别这两类化合物。
黄酮、黄酮醇的B环或A环上取代基的性质和位置不同将影响带Ⅰ或带Ⅱ的峰位和形状。例如，7和4′位引入羟基、甲氧基等含氧取代基，可引起相应吸收带向红位移。又如3-或5-位引入羟基，因能与C4＝O形成氢键缔合，前者使带Ⅰ向红位移，后者使带Ⅰ、带Ⅱ均向红位移。B环上的含氧取代基逐渐增加时，带Ⅰ向红位移值（nm）也逐渐增加，但不能使带Ⅱ产生位移。有时（例如3′，4′-位有2个羟基或2个甲氧基或亚甲二氧基）仅可能影响带Ⅱ的形状，使带Ⅱ歧分为双峰或1个主峰（Ⅱb位于短波处）和1个肩峰（sh）或弯曲（Ⅱa位于长波处）。
A环上的含氧取代基增加时，使带Ⅱ向红位移，而对带Ⅰ无影响，或影响甚微（但5-羟基例外）。
黄酮或黄酮醇的3-，5-或4′-羟基被甲基化或苷化后，可使带Ⅰ向紫位移，3-OH甲基化或苷化使带Ⅰ（328～357nm）与黄酮的带Ⅰ的波长范围重叠（且光谱曲线的形状也相似），5-OH甲基化使带Ⅰ和带Ⅱ都向紫位移5～15nm，4′-OH甲基化或苷化，使带Ⅰ向紫位移3～10nm。其他位置上的羟基取代对甲醇中的紫外光谱几乎没有影响。
（二）利用诊断试剂对黄酮、黄酮醇类化合物UV光谱的影响检出羟基位置
1．甲醇钠（NaOMe），主要是判断是否有4′-OH，3、4′－二OH或3、3′、4′－三OH。
2．乙酸钠，较为突出的是判断是否有7-OH。［举例说明］
3．乙酸钠/硼酸 主要判断A环或B环是否有邻二酚羟基（5，6-二OH除外）。［举例说明］
4．三氯化铝及三氯化铝/盐酸，为判断有无邻二酚羟基，3-OH、5-OH提供信息。
（三）异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征
这三类化合物都有苯甲酰系统，而无桂皮酰结构，所以它们的紫外光谱都有强的带Ⅱ吸收，异黄酮带Ⅱ吸收在245～270nm，而二氢黄酮和二氢黄酮醇的带Ⅱ在270～295nm，一般只受A环的含氧取代基的影响，A环含氧取代基数
增加，吸收峰向红位移。
（四）利用诊断试剂对异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类化合物的UV光谱的影响判断羟基位置
1．甲醇钠
①带Ⅱ向红位移，示A环上有羟基。
②如有5，6，7-或5，7，8-三羟基或3′，4′-二羟基，则吸收带将随放置的延长而逐渐衰退。
③二氢黄酮、二氢黄酮醇带Ⅱ向红位移的大小取决于是否有游离的5-OH。
2．乙醇钠
①乙醇钠使7-羟基异黄酮的带Ⅱ向红位移6～20nm，但6-位有含氧取代基时，乙醇钠几乎不能使带Ⅱ产生移动。4′，5，6，7-四羟基异黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。
②乙醇钠使5，7-二羟基二氢黄酮和5，7-二羟基二氢黄酮醇带Ⅱ向红位移34～37nm，而其相应的5-去氧化合物则移动51～58nm。5，6，7-三羟基二氢黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。
3．乙醇钠/硼酸
不能用NaOAc/H3BO3对异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类的紫外光谱的影响来检查B环邻位二羟基，因为它们的B环与主要发色团缺少有效的共轭。但它们中的A环有6，7-二羟基时，加入NaOAc/H3BO3后使带Ⅱ向红位移10～15nm。
4．三氯化铝和三氯化铝/盐酸
①异黄酮、二氢黄酮（可能也包括二氢黄酮醇）的A环如有邻二羟基（6，7-或7，8-，不包括5，6-），则带Ⅱ在AlCl3中比在AlCl3/HCl中向红位移11～30nm。
②有5-羟基的异黄酮，其带Ⅱ在AlCl3/HCl存在下与在甲醇中的光谱相比，向红位移10～14nm，而有5-羟基的二氢黄酮和有5-羟基的二氢黄酮醇类的带Ⅱ在同样情况下向红位移20～26nm。目标检测：
黄酮类化合物的鉴别与结构测定现在多依赖于谱学的综合解析，而化学方法和色谱方法已降至辅助地位。未知黄酮类化合物的鉴定，多在测定分子式的基础上，利用PPC或TLC得到的Rf值或hRf值与文献比较或分析对比样品在甲醇溶液中及加入各种诊断试剂后得到的紫外及可见光谱进行剖析。同时，对于化合物的颜色反应，以及在提取分离过程中所表现的行为（如溶解度、酸或碱中的溶解情况、铅盐沉淀等）也应注意分析。但这些方法均有一定局限性，并曾导致得出过一些错误结论。质子核磁共振（1H—NMR）因为可定量测定H的个数，以及根据质子的化学位移和芳香氢核之间的自旋偶合所提供的信息（裂分数目及偶合常数大小），可确定黄酮母核上的取代模式。近来由于仪器分辨率的不断改进，加以同核去偶、溶剂位移以及核磁共振技术的使用，1H－NMR谱的测定对分析天然黄酮类化合物的结构已经成为一种非常重要的手段。但是正如以后谈到的那样，在黄酮类化合物的1H-NMR谱上，有时要想确切指认每个信号并不是一件容易的事情。例如当黄酮类母核的A-环上只有一个芳香氢核时，要想与H-3信号区别，就是十分困难的问题。解决这种问题，13C核磁共振(13C－NMR)技术有很大的优势。加上各种取代基位移及苷化位移效应的发现，使得图谱的解析工作大大简化。因此，13C-NMR技术在黄酮类化合物的结构鉴定中发挥着越来越重要的作用。质谱（MS）技术，
尤其场解析质谱（FD－MS）与快速原子轰击质谱（FAB－MS）及串联质谱（MS－MS）的出现与应用，使其成为黄酮类化合物结构鉴定的重要手段之一（质谱技术的优势是只需要微量的样品就可获得有关整个分子结构及其主要碎片结构的重要信息）。
实际工作中常常根据需要，灵活、综合运用上述方法和手段，并辅以必要的化学方法，以求结构鉴定获得满意的结果。
二、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用
纸色谱（PPC）适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物。混合物的鉴定常采用双向色谱法。以黄酮苷类来说，一般第一向展开采用某种醇性溶剂，如n-BuOH－HOAc－H2O（4∶1∶5上层，BAW）、t-BuOH－HOAC－H2O （3∶1∶1，TBA）或水饱和的n-BuOH等，这些主要是根据分配作用原理进行分离。第二向展开溶剂则用水或下列水溶液，如：2％～6％HOAc、3％NaCl及HOAc-浓HCl－H2O（30∶3∶10）等。它们主要是根据吸附作用原理进行分离。 黄酮类化合物苷元一般宜用醇性溶剂或用C6H6－HOAc－H2O（125∶72∶3）、CHCl3－HOAC－H2O（13∶6∶l）、PhOH-H2O（4∶1）或 HOAC一浓HCl-H2O（30∶3∶3） 进行分离。而花色苷及花色苷苷元，则可用含HCl或HOAC的溶液作为展开剂。
多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外光灯检查时，可以看到有色斑点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。此外还可喷以2％ AlCl3（甲醇）溶液（在紫外光灯下检查）或1％FeC13－1％K3Fe(CN)6（1∶1）水溶液等显色剂。 黄酮类化合物苷元中，平面性分子如黄酮、黄酮醇、查耳酮等，用含水类溶剂如 3％～5％HOAC展开时，几乎停留在原点不动（Rf＜0.02＝；而非平面性分子如二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮等，因亲水性较强，故Rf值较大(0.10～0.30)。黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性即随之增大，故在醇性展开剂中Rf值相应降低，同一类型苷元，Rf值依次为：苷元＞单糖苷＞双糖苷。以在BAW中展开为例，多数类型苷元（花色苷元例外）Rf值在0.70以上，而苷则小于0.70。但在用水或2％～ 8％HOAC，3％ NaCl或1％ HCl展开时，则上列顺序将会颠倒，苷元几乎停留在原点不动，苷类的Rf值可在0.5以上，糖链越长，则Rf值越大。另外，糖的结合位置对Rf值也有重要的影响。不同类型黄酮类化合物在双向PPC展开时常常出现在特定的区域，因此可推测它们的结构类型以及判定是否成苷以及含糖数量。除PPC外，TLC用于黄酮类化合物的鉴定也日趋广泛。一般采用吸附薄层色谱，常用的吸附剂有硅胶与聚酸胺，其次是纤维素。
硅胶薄层色谱；用于分离与鉴定弱极性黄酮类化合物较好。分离黄酮苷元常用的展开剂是甲苯-甲酸甲酯-甲酸 （5∶4∶1），并可以根据待分离成分极性的大小适当地调整甲苯与甲酸的比例。另外尚有苯-甲醇(95：5)、苯-甲醇-醋酸（35∶5∶5）、氯仿一甲醇（8.5∶1.5∶7∶0.5）、甲苯-氯仿-丙酮(4O∶25∶35)、丁醇一吡啶-甲酸(40∶10：∶)等分离黄酮苷元的衍生物如甲醚或醋酸乙酯等中性成分，可用苯-丙酮（9∶1）、苯-醋酸乙酯(7.5∶2.5）等为展开剂。
聚酸胺薄层色谱：适用范围较广，特别适合于分离合游离酚羟基的黄酮及其苷类。由于聚酸胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因而需要可以破坏其氢键缔合的溶剂为展开剂。
在大多数展开剂中含有醇、酸或水。常用的展开剂有乙醇一水(3∶2)、水-
乙醇-乙酸丙酮(4∶2∶1)、水-乙醇-甲酸-乙酸丙酮(5∶1.5∶l：0.5)、水饱和的正丁醇一醋酸（100∶1∶100∶2）、丙酮-水（1∶1）、丙酮-95％乙醇-水（2∶1∶2）、95％乙醇-醋酸（100∶2）、苯-甲醇-丁酮（60∶20∶20）等。 Stahl总结前人的工作，介绍了一些黄酮苷元和黄酮苷用硅胶、聚酸胺与纤维素三种薄层色谱和四种混合溶剂作为展开剂所得到的hRf值。
三、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴别中的应用
紫外及可见分光光度法是鉴别黄酮类化合物结构的一种重要手段，一般程序如下：
（1）测定样品在甲醇溶液中的UV光谱；
（2） 测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。常用的诊断试剂有甲醇钠（NaOMe）．醋酸钠（NaOAc）、醋酸钠一硼酸（NaOAc－H3BO3）．三氯化铝（AICI3）及三氯化铝一盐酸（AICI3－HCI）等。 提取与分离
一、提取
黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。
黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。其中用得最多的是甲醇－水（1∶1）或甲醇。一些多糖苷类则可以用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸（如0.1％盐酸）。但提取一般黄酮苷类成分时，则应当慎用，以免发生水解反应。为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂，如氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，对多甲氧基黄酮的游离苷元，可用苯进行提取。 对得到的粗提取物可进行精制处理，常用的方法有：
（一）溶剂萃取法：利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。
有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常用的溶剂系统有：水一醋酸乙酯，正丁醇一石油醚等。
溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。
（二）碱提取酸沉淀法
黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷提取都应用了这个方法。现以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。
槐米（槐树 SOphora japonica L．花蕾）加约 6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至 pH 8～9，在此 pH条件下微沸 20～30 min，趁热抽滤，残渣再加 4倍量的水煎一次，趁热抽滤。合并滤液，在60～70t的条件下，用浓盐酸将合并滤液调至PH为5，搅匀后静置24 h，抽滤。用水将沉淀物洗至中性， 60℃干燥得芦丁粗品，用沸水重结晶， 70一80℃干燥后得芦丁纯品。
在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过离，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成样盐，致
使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药材中含有大量果胶、粘液等水溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不被溶出。这将有利于黄酮类化合物的纯化处理。
（三）炭粉吸附法
主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸附苷的炭末，依次用沸水、佛甲醇、7％酚一水、15％酚一醇溶液进行洗脱。对各部分洗脱液进行定性检查（或用 PPC鉴定）。通过对BaPtisia lecontei中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮耷类可用7％酚一水洗下。洗脱液经减压蒸发浓缩至小体积，再用乙酸振摇除去残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。
二、分离
现将较常用的分离方法介绍如下：
（一）柱色谱法
分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。
1．硅胶柱色谱此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及离度甲基化（或乙醇化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。供试硅胶中混存的微量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。
2．聚酰胺柱色谱 对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。以Baptisialecontei为例：黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下述规律：
（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：叁糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。
（2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减慢。当分子中羟基数目相同时，羟基位置对吸附也有影响，聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱顺序为：具有邻位羟基黄酮，具有对位（或间位）羟基黄酮。
（3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇。
（4）分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱上的行为。
3．葡聚糖凝胶（Sephadex gel）柱色谱对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex－G型及Sephadex－LH－厂－型。用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机制是：
分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。
表6-5中Ve为洗脱样品时需要的溶剂总量或洗脱体积； V0为柱子的空体积。Ve／V0数值越小说明化合物越容易被洗脱下来。上表所列数据清楚地表明：苷元的羟基数越多，Ve／V0越大，越难以洗脱，而苷的分子量越大，其上联结糖的数目越多，则Ve／V0越小，越容易洗脱。
葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有：
（1）碱性水溶液（如 0．1mol／L NH4OH），含盐水溶液（0．5 mol／L NaCI等）。
（2）醇及含水醇，如甲醇，甲醇－水（不同比例），叔丁醇－甲醇（3：1）、乙醇等。
（3）其他溶剂，如含水丙酮、甲醇－氯仿等。
（二）铅盐法
此法过去曾用于研究，目前已很少采用。一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入适量中性醋酸铅、碱式醋酸铅水液，分别使具有邻二酚羟基成分（包括黄酮）及含羟基成分，具有一般酚羟基的成分分离，再分别将铅盐沉淀悬浮于醇中，脱铅后得到成分。
（三）硼酸铬合法
有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与无邻二酚羟基的黄酮类化合物相互分离。
（四）pH梯度萃取法
pH梯度萃取法适合于酸性强弱不同的游离的黄酮类化合物的分离，将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用5％NaHCO3（萃取出7，4′－二羟基黄酮）、5％Na2CO3（萃取出7－或4′－羟基黄酮）、0.2％NaOH（萃取出具一般酚羟基黄酮）、4％NaOH（萃取出5－羟基黄酮）萃取而使之分离。
聚酰胺薄膜的分离机制主要是分子键氢键和吸附。当展开剂为不同比例的醇-水时，其分离机制与反相板类似，苷元较苷的Rf值低；当展开剂为有机溶剂时，分离机制与正相板类似，苷元较苷的Rf值高。
常用显色剂多了去了，看你是要用于鉴别什么了。
碘蒸气是通用显色剂，对很多化合物都显黄棕色。碘显色过程中由碘蒸气分子与化合物发生结合而显色。
香草醛浓硫酸显色原理是使羧基脱水，增加双键结构，再经双键位移，双分子缩合等反应生成共轭双键系统，又在酸作用下形成阳碳离子盐而显色。
比如：（1）矾酸铵一浓硫酸溶液（Mandelin试剂）为1％矾酸铵的浓硫酸溶液。如遇阿托品显红色，可待因显蓝色，士的宁显紫色到红色。
（2）钼酸铵一浓硫酸溶液（Frohde试剂）为1％钼酸钠或钼酸铵的浓硫酸溶液，如遇乌头碱显黄棕色，小檗碱显棕绿色，阿托品不显色。
（3）甲醛一浓硫酸试剂（Marquis试剂）为30％甲醛溶液0.2ml与10ml浓硫酸的混合溶液。如遇吗啡显橙色至紫色，可待因显红色至黄棕色。
（4）浓硫酸 如遇乌头碱显紫色、小檗碱显绿色，阿托品不显色。
（5）浓硝酸 如遇小檗碱显棕红色，秋水仙碱显蓝色，咖啡碱不显色。
(1) 重络酸钾-硫酸:检查一般有机物.
喷洒剂:5克重络酸钾溶于100毫升40%硫酸中.
薄层检查:喷洒后加热到150℃至班点出现
(2) 荧光素-溴:检查不饱和化合物
喷洒剂:0.1克荧光素溶于100毫升乙醇中
溴试剂:5%的溴的四氯化碳溶液
喷洒后处理:喷洒荧光素溶液后,放置存有溴溶液的缸内,可于紫外线分析灯下检
查荧光,荧光素与溴化和成曙红(Eosin)(无萤光),而不饱和化合物则成溴加成物,保留了原有荧光;若点样较多,则呈黄色斑点,底板呈红色.
(3) 碘:检查一般有机物.
方法:a 层析谱放密闭缸内或瓷盘内，缸内预先放有碘结晶少许，大部分有机化合物呈棕色斑点。
B 层析谱放碘蒸气中5分钟（或喷5％碘的氯仿溶液）取出置空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷1％淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。
（4）硫酸：通用
喷洒剂：5％的浓硫酸乙醇溶液，或15％浓硫酸正丁醇溶液，或浓硫酸－醋酸（1：
1）喷洒后处理：空气中干燥15分钟，再热至110℃直至出现颜色或荧光。
（5）硝酸银－氢氧化铵（Tollen-Zaffaroni）试剂：检查还原性物质。 溶液I : 0.1%N硝酸银; 溶液II: 5N氢氧化铵
喷洒剂: I和II以1:5混合(临用前混合)
喷洒后处理: 105℃加热5~10分钟,至深黑色斑点出现.
(6)磷钼酸或磷钨酸,硅钨酸:检查还原性物质,类脂体,生物碱,甾体
喷洒剂: 5~10%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液
喷洒后处理: 120℃加热至斑点出现.
沉淀试剂: 1克硅钨酸溶于20毫升水中,加10%盐酸至强碱性.
生物碱
(7)硫酸??=硫酸:检查生物碱及含碘化合物
喷洒剂: 0.1克硫酸?混悬于4毫升水中,加入1克三氯醋酸,加热至沸,逐滴加入浓硫酸至澄清.
喷洒后处理: 110℃加热数分钟至斑点出现.
(8)碘化铋钾(Dragendorff)试剂:检查生物碱及其他含氟化合物.
溶液I: 0.85克次硝酸铋溶于10毫升冰醋酸40毫升水中
溶剂II: 8克碘化钾溶于20毫升水中.
制备液I+II,等体积混合.可用于棕色瓶中保存较长时间,一般制备液可作沉淀试剂用.
喷洒液: 制备液1毫升与2毫升醋酸,10毫升水混合即得
(9).碘化汞钾(Mayer)试剂: 检查生物碱.
制备液: 13.55克氯化汞和49.8克碘化钾各溶于20毫升水中,等体积混合并用水稀释至1000毫升.
喷洒液: 制备液加1/10体积的17%盐酸.
喷洒后处理: 观察斑点,并于紫外线荧光分析灯下检出.
(10) ?酸纳-浓硫酸(Mandelin)试剂:检查生物碱.
1%>酸纳的浓硫酸溶液.与多种生物碱呈不同颜色.
(11)碘－碘化钾(Wagner)试剂:检查生物碱.
1克碘及10克碘化钾,溶于50毫升水中,加热,加2毫升醋酸,再用水稀释至100毫升.
可作纸层板显色剂,液可作沉淀试剂.
酚类,鞣质
(12)三氯化铁:检查酚类及??酸.
喷洒剂:1~5%三氯化铁的水溶液或乙醇溶液.并加盐酸少许.??酸呈红色斑点,酚类称蓝色或绿色斑点.
(13)铁氰化钾-三氯化钾:检查酚类,芳香胺类及还原性物质.
喷洒剂: 1%铁氰化钾水溶液,2%三氯化铁水溶液.临用前等体积混合.
喷洒后处理: 喷洒后酚性物质呈蓝色斑点.再喷2N盐酸,能使颜色加深,纸谱可用烯盐酸洗去喷洒液.
(14) 4-胺基安替比林-铁氰化钾(Emerson反应): 检查酚类.
喷洒剂: I . 2%4-氨基安替比林乙醇溶液;
II. 8%铁氰化钾水溶液.
或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液
方法: 先喷洒I,再喷洒II,即显色,或再放入密闭缸中,缸内放25%氢氧化铵,即产生橙色至深红色.
(15) 对氨基苯磺酸,重氮盐(Pauly试剂): 检查酚类,芳香胺类及能偶合的杂环化合物.
喷洒剂: 4.5克对氨基苯磺酸,加热溶于45毫升12N盐酸中,用水稀释至500毫升,取10毫升稀释液用冰冷却,加10毫升冷4.5%亚硝酸钠水溶液,0℃放15分钟(此试剂于0℃可保存3天),用前加等体积1%碳酸钠水溶液.
一般重氮化试剂,也可用联苯胺,对硝基苯胺等.
(16) 对甲苯磺酸: 检查甾体,黄酮,鞣质.
喷洒剂: 20%对甲苯磺酸氯仿溶液.
喷洒后处理: 100℃加热数分钟,紫外线分析灯下检查荧光斑点.
含氧杂环及蒽醌类*
(17) 三氯化铝: 检查黄酮体.
喷洒1%三氯化铝乙醇液于紫外线荧光分析灯下检示,呈黄色荧光
(18)碱式醋酸铅: 检查黄酮体.
喷洒剂: 饱和碱式醋酸铅(或饱和醋酸铅)水溶液.
于紫外线荧光分析灯下检查荧光斑点.
(19)醋酸镁: 检查蒽醌甙,甙元及黄酮体
喷洒剂: 0.5%醋酸镁甲醇溶液
方法: 90℃加热5分钟,呈红色至紫色斑点.
(20)氢氧化钾: 检查香豆素,蒽醌甙及甙元
喷洒剂: 5~10%氢氧化钾的甲醇溶液.
于日光及紫外线荧光分析灯下检示斑点.
萜类,甾体
(21) 三氯化锑(Carr-Price试剂): 检查甾体,萜类,皂类.
喷洒剂: 25克三氯化锑溶于75克氯仿中(亦可以用氯仿或四氯化碳的饱和溶液). 喷洒后处理: 100℃加热5分钟,于紫外线荧光分析灯下检示荧光.
(22) 五氯化锑: 检查甾体,萜类,皂甙.
喷洒剂: 五氯化锑-氯仿或四氯化碳(1:4),用前新鲜配制.
喷洒后处理: 120℃加热至斑点出现,并于紫外线荧光分析灯下检示.
(23)香兰醛-硫酸: 检查高级醇类,酚类,甾体,萜类,芳香油.
喷洒剂: 1克香兰素溶于100毫升浓硫酸,或0.5克香兰醛溶于100毫升硫酸-乙醇(4:1)中.
喷洒后处理: 室温或120℃加热观察显色斑点.
(24) 4-二甲氨基苯甲醛,醋酸,磷酸(E.P.试剂): 检查? Azulene 及?前体 Proazulene.
喷洒剂: 0.25克4-二甲氨基苯甲醛,溶于50毫升醋酸5克85％磷酸和20毫升水的混合液中(棕色瓶中保存数月)
?:烃室温即成蓝紫色斑点,>前体于80℃加热10分钟出现蓝紫色斑点.
(25) 氯胺T－三氯醋酸: 检查强心甙.
喷洒剂: I. 3%氯仿T水溶液新鲜制备.
II. 25%三氯醋酸乙醇溶液(能保存数天).
10毫升I加40毫升II,用前混合.
喷洒后处理: 110℃加热7分钟,紫外线荧光分析灯下检示呈蓝色或黄色荧光.
(26) 亚硝酸基铁氰化钠-氢氧化钠(Legal试剂): 检查不饱和内酯;甲基酮或活性次甲基,常用于强心甙
喷洒剂: 1克亚硝基铁氰化钠溶于100毫升2N氢氧化钠-乙醇(1:1)的水溶液. 显红色或紫色斑点.
(27) 3,5-二硝基苯甲酸(Legal试剂): 检查强心甙,α,β-不饱和内酯.
喷洒剂: 1克3,5-二硝基苯甲酸溶于50毫升甲醇,加入1N氢氧化钾50毫升. 强心甙呈紫红色斑点.
糖类
(28) 邻苯二甲基苯胺: 检查还原糖.
喷洒剂: 0.93克苯氨,1.66克邻苯二甲酸溶于100毫升水饱和的正丁醇中. 喷洒后处理: 105℃加热10分钟.
(29) 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium chloride (T.T.C.)：检查还原糖及其他还原物质。
溶液I：4％（T.T.C.）甲醇溶液； 溶液II：1N氢氧化钠。
喷洒液：I，II，临用前等体积混合。
喷洒后处理：100℃加热5～10分钟，得红色斑点。
（30）Keller-Kiliani试剂：检查α－去氧糖，常用于强心甙。
试液：100毫升冰醋酸加三氯化铁试液0.5毫升混合均匀.
试样1毫克加试液2毫克溶解后,沿试官管壁滴入浓硫酸2毫升,接触面即显棕色,渐变浅绿,蓝色.最后冰醋酸层全部燃呈蓝色.
(31) 1,3-二羟基萘-磷酸: 检查糖类.
喷洒液: 0.2%1,3-二羟基萘(Naphthoresorcinol)乙醇溶液100毫升,与10毫升85%磷酸混合.
(32) 费林溶液(Fehling): 检查还原糖.
溶液I: 69.3克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中.
上述二溶液如不清可滤过.临用前等体积混合.
氨基酸
(33) 茚三酮: 检查氨基酸及氨基糖.
喷洒剂: 0.3克茚三酮溶于100毫升正丁醇,加入3毫升醋酸;或0.2克茚三酮溶于100毫升乙醇(或丙酮中).
喷洒后处理: 110℃加热至斑点出现.
(34) 吲哚醌: 检查氨基酸和一些肽.
喷洒剂: 0.2%吲哚醌(Isatin)丙酮溶液,含4%醋酸;或用100毫升1%吲哚醌丙酮溶液加10毫升醋酸.
喷洒后处理: 100~110℃加热10分钟.
(35) 1,2-萘醌-4-硫磺酸(Folin试剂): 检查氨基酸.
喷洒剂: 新鲜制备0.02克1,2-萘醌-4-磺酸钠,溶于100毫升5%碳酸钠中. 喷洒后处理: 室温放于,不同氨基酸出现不同颜色.
有机酸
(36) 酸碱指示剂: 检查有机酸.
喷洒剂: 0.05%溴酚蓝(或溴甲酚绿,或溴麝香草酚蓝)的乙醇溶液.
(37) 氧化还原显色剂: 检查有机酸.
喷洒剂: I. 0.075%溴甲酚绿及0.025%溴酚蓝的无水乙醇液.
II. 0.5%高锰酸钾及1%碳酸钠.10H2O的蒸馏水液.临用前,取I和II按1:1混合后喷酒.
喷酒后处理: 稳定时间为5~10分钟.对不同的有机酸在纸谱上呈现不同颜色.
(38) ??? (Acridine): 检查酸.
喷洒剂: 0.005%的??乙醇溶剂.
紫外线分析灯下呈黄色荧光.
(39) 芳香胺-还原糖: 检查酸.
喷洒剂: 芳香胺(如苯氨5克)和还原糖(如木质糖5克)溶于50%含水乙醇中. 喷洒后处理: 125~130℃加热出现棕色斑点
一、通用试剂
1、碘试剂
检查一般有机化合物。
（1）碘蒸气 预先将盛有碘结晶的小杯置于密闭的玻璃容器内，使容器空间被碘蒸气饱和，将薄层置于容器内数分钟即显棕色斑点。有时，于容器中加放一小杯水，增加容器内的湿度，可提高显色的灵敏度。
（2）0.5％碘的氯仿溶液 喷洒试剂，置空气中待过量的碘挥发后，喷1％淀粉溶液，斑点由棕色转为蓝色。
2、硫酸试剂
检查一般有机化合物。
5％硫酸乙醇溶液作为色谱显色剂用。喷洒后，置空气中干燥15min，100℃烤至斑点呈色（不同化合物呈不同颜色）。
3、重铬酸钾—硫酸试剂
检查一般有机化合物。
5g重铬酸钾溶于l00ml40％硫酸中。喷该试剂后，150℃加热至斑点出现(不同化合物呈不同颜色)。
4、磷钼酸试剂
检查还原性成分。
5％磷钼酸乙醇溶液。喷洒后，120℃加热至呈蓝色斑点。
5、磷钨酸试剂
检查还原性成分
20％磷钨酸乙醇溶液。喷洒后，120℃烘烤，还原性物质呈蓝色斑点。
6、硝酸银—氢氧化铵试剂
检查还原性成分。
溶液I：0.1mol／L硝酸银溶液。溶液Ⅱ：10％氢氧化铵溶液。临用前溶液I和Ⅱ以
1︰5混合。喷洒后105℃加热5~l0min，至深黑色斑点出现。
7、中性高锰酸钾试剂
检查易还原性成分。
0.05％高锰酸钾溶液。喷洒后粉红色背景上显黄色斑点。
8、碱性高锰酸钾试剂
检查还原性成分。
溶液I：1％高锰酸钾溶液。溶液Ⅱ：5％碳酸钠溶液。溶液I和Ⅱ等量混合使用，喷洒后，粉红背景上显黄色斑点。
9、四唑蓝试剂
检查还原性成分。
溶液I：0．5％四唑蓝甲醇溶液。溶液Ⅱ：25％氢氧化钠溶液。临用前两液等量混合。喷洒后，微热或室温放置显紫色斑点。
10、荧光素—溴试剂
检查不饱和化合物。
溶液I：0.1g荧光素溶于l00ml乙醇中。溶液Ⅱ：5g溴溶于l00ml四氯化碳中。先喷洒溶液I，然后将薄层板放入盛有溶液Ⅱ的缸内，黄色斑点出现后，于紫外光灯下检视，红色底板上显黄色荧光斑点。
11．荧光显色试剂
检查一般有机化合物。
（1）0.2％2，7--'氯荧光素乙醇溶液。
（2）0.01％荧光素乙醇溶液。
（3）0.1％桑色素乙醇溶液。
（4）0.05％罗丹明B乙醇溶液。
喷洒任一溶液，不同的化合物在荧光背景上可显黑色或其它荧光斑点。
二、苷类鉴定试剂
1、糖鉴定试剂
（1） －萘酚－硫酸试剂
检查还原糖。
①溶液I：10％ —萘酚乙醇溶液。溶液Ⅱ：硫酸。取lml样品的稀乙醇溶液或水溶液，加入溶液I 2～3滴，混匀，沿试管壁缓缓加入少量溶液Ⅱ，二液面交
界处产生紫红色环为阳性反应。
②15％ —萘酚乙醇溶液21m1、硫酸13ml、乙醇87ml及水8ml混匀后使用。喷洒于薄层板上，100℃烤3～6min，多数糖显蓝色，鼠李糖显橙色，所显颜色于室温可稳定2天～3天。
（2）斐林试剂
检查还原糖。 ‘
溶液I：6.93g结晶硫酸铜溶于l00ml水中。溶液Ⅱ：34.6g酒石酸钾钠、10g氢氧化钠溶于l00ml水中。取lml样品热水提取液，加入4～5滴用时配制的溶液Ⅰ、Ⅱ等量混合液，在沸水浴中加热数分钟，产生砖红色沉淀为阳性反应。如检查多糖和甙，取lml样品水提液，加入lmll0％盐酸溶液，在沸水浴上加热l0min，过滤，再用10％氢氧化钠溶液调至中性，按上述方法检查还原糖。
（3）氨性硝酸银试剂
检查还原糖。
硝酸银1g，加水20ml溶解，小心滴加适量氨水，边加边搅拌，至开始产生的沉淀将近全部溶解为止，过滤。取lml样品的水溶液，加入lml试剂，混匀后，40℃微热数分钟，管壁析出银镜或产生黑色沉淀为阳性反应。本试剂也可作为色谱显色剂，喷洒后于110℃加热数分钟，显棕黑色斑点为阳性反应。还原性物质如醛类、邻二酚类等有干扰。
（4）茴香醛－硫酸试剂
检查糖类化合物。
硫酸lml加到含茴香醛0.5ml的乙酸溶液50ml中，需临用前配制。喷洒于薄层板上，105℃加热至显示色斑，不同糖显不同颜色。
（5）苯胺－邻苯二甲酸试剂
检查糖类化合物。
苯胺0.93g和邻苯二甲酸1.66g溶于100ml水饱和的正丁醇中。作色谱显色剂用。喷后105℃烤5min，显红棕色斑点。
（6）l,3－二'羟基萘酚－磷酸试剂
检查酮糖、醛糖。
0.2％1，3--'二羟基萘酚乙醇溶液50ml与85％磷酸50ml混合均匀后使用。喷后105℃烤5min～10min，酮糖呈红色，醛糖显淡蓝色。
（7）苯胺－二苯胺－磷酸试剂
检查糖类化合物。
苯胺4ml、二苯胺4g及85％磷酸20ml溶于丙酮200ml中。喷洒于薄层板上，85℃加热10min，不同糖显不同颜色。
（8）2，3，5－三苯基氯化四氮唑(T．T．C)试剂
检查还原糖。
溶液Ⅰ：4％T．T．C甲醇溶液。溶液Ⅱ：4％氢氧化钠溶液。临用时将溶液Ⅰ和Ⅱ等体积混合。喷洒后，100℃加热5～10min，显红色斑点为阳性反应(醛类无干扰)。
（9）三氯化铁－冰醋酸(K．K)试剂
检查 －去氧糖，常用于强心甙。
溶液I：1％三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至l00ml。溶液Ⅱ：硫酸。取样品乙醇提取液lml，置试管中，水浴上蒸去乙醇，残渣用0.5ml溶液I溶解，沿试管壁缓缓加入溶液Ⅱlml，静置分层，上层渐显蓝色，下层显红色或棕色为阳性反应(其颜色随苷元羟基和双键的位置和个数不同而不同)。
（10）占吨氢醇试剂
检查 －去氧糖(常用于强心甙)。
10mg占吨氢醇溶于100ml冰醋酸中，再加入lml硫酸混合。取lml样品，加入试剂lml，置水浴上加热30min，显红色为阳性反应。
（11）Gregg-Gisvold试剂
检查2．6－去氧糖。
溶液I：10％三氯化铁溶液。溶液Ⅱ：1％盐酸甲醇溶液(97.2ml甲醇中含2．8ml盐酸)。0.5ml溶液I与100ml溶液Ⅱ混合。将样品的乙醇溶液点于滤纸片上，晾干后，喷洒上述混合试剂，110℃加热5min，显蓝色为阳性反应。
（12）3，5－二氨基苯甲酸－磷酸试剂
检查2－去氧糖。
3，5－二氨基苯甲酸二盐酸盐1g溶于80％磷酸25ml，加水稀释至60ml。喷洒后，100℃加热15min，2－去氧糖在日光下显棕色，在紫外光下显黄绿色荧光。
（13）对硝基苯胺－过碘酸试剂
检查去氧糖。
溶液I：饱和偏高碘酸溶液1份加水2份混匀。溶液Ⅱ：1％对硝基苯胺乙醇溶液4份与盐酸1份混合。先喷溶液I，放置10min，再喷溶液Ⅱ，去氧糖显黄色，紫外光下显强荧光，再喷5％氢氧化钠甲醇溶液，颜色转绿，乙二醇同样显色。
2、酚类鉴定试剂
（1）三氯化铁试剂
检查酚类化合物、鞣质。
1～5％三氯化铁水溶液或乙醇溶液，加盐酸酸化。取1m1样品的乙醇溶液，加入试剂1～2滴，显绿、蓝绿或暗紫色为阳性反应。作色谱显色剂用，喷洒后，显绿或蓝色斑点为阳性反应。 ·
（2）4－氨基安替匹林－铁氰化钾(Emerson)试剂
检查酚羟基对位无取代基的化合物。
溶液I：2％4－氨基安替匹林乙醇溶液。溶液Ⅱ：8％铁氰化钾溶液。作色谱显色剂用，先喷洒溶液I，再喷洒溶液Ⅱ，用氨气熏，显橙红或深红色斑点为阳性反应。
（3）Gibbs试剂
检查酚羟基对位无取代基的化合物。
溶液I：0.5％2，6－溴(氯)苯醌氯亚胺的乙醇溶液。溶液Ⅱ：1％氢氧化钾乙醇溶液。取lml样品的乙醇溶液，滴加溶液Ⅱ，使pH9～10，再加入1滴～2滴溶液I，显深蓝色为阳性反应。
（4）铁氰化钾－三氯化铁试剂
检查酚类、芳香胺类及还原性物质。
溶液I：1％铁氰化钾溶液。溶液Ⅱ：2％三氯化铁溶液。临用前等体积混合。喷
洒后酚性成分呈蓝色斑点，再喷20％盐酸，能使颜色加深。纸色谱可用稀盐酸洗去喷洒液。
（5）重氮化(Pauly)试剂
检查酚羟基对位无取代基化合物。
溶液I：0.35g对硝基苯胺溶于5ml盐酸中，加水稀释至50ml。溶液Ⅱ：5g亚硝酸钠溶于70ml水中。取1m1样品的乙醇溶液，加入1m13％碳酸钠溶液，在沸水浴中加热3min，再在冰水浴中冷却后，加入1～2滴溶液Ⅰ与Ⅱ的混合液(临用时，在冰水浴中等量混合)，显红色为阳性反应。作色谱显色剂用，将溶液I与Ⅱ各l0ml混合，再加20ml 1％碳酸钠溶液(均临用时在冰水浴中混合)，喷洒后，显黄、红、紫等色斑点为阳性反应。
（6）牢固蓝B盐试剂
检查酚类化合物。
溶液I：新配的0.5％牢固蓝B盐的溶液。溶液Ⅱ：0.5％氢氧化钠溶液。先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ，呈棕、紫、或绿色者为阳性反应。能偶合的芳香胺类有干扰。
3．黄酮类鉴定试剂
（1）盐酸－镁粉试剂
检查黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）类化合物。
取lml样品的乙醇溶液，加入数毫克镁粉，滴加数滴盐酸，必要时水浴上微热，显红－紫色为阳性反应。
（2）Shinoda试剂
采用含2％锌粉（W／W）－硅胶薄层板，展层后喷20％盐酸溶液，黄酮（醇）类呈红紫色。
（3）三氯化铝试剂
检查具有邻二酚羟基或3－羟基、4－酮基或5－羟基、4－酮基的黄酮类化合物。
1％三氯化铝乙醇溶液或5％三氯化铝乙醇溶液。喷洒前、后将薄层板置日光下和紫外光灯下观察，呈黄色或黄绿色荧光为阳性反应。也可在滤纸上和试管中进行。
（4）中性醋酸铅或碱式醋酸铅试剂
检查具邻二酚羟基或酚羟基的黄酮化合物。
饱和中性醋酸铅或碱式醋酸铅溶液。取1ml样品的乙醇溶液，加1～2滴试剂，产生黄色沉淀。
（5）锆－柠檬酸试剂
检查具3－羟基或5－羟基的黄酮类化合物。
溶液I：2％二氯氧锆甲醇溶液。溶液Ⅱ：2％柠檬酸甲醇溶液。取1mg样品，用甲醇溶解，加入溶液I lml，呈鲜黄色示有3－羟基或5－羟基；再加入溶液Ⅱ1m1，黄色不褪，示有3－羟基；黄色褪去，加水稀释后变为无色，示无3－羟基，但有5－羟基。也可在滤纸上进行，得到的锆盐络合物多呈黄绿色，并具荧光。
（6）氨性氯化锶试剂
检查具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物。
溶液I：1％氯化锶甲醇溶液。溶液Ⅱ：氨蒸气饱和的甲醇溶液。取1mg样品的甲醇溶液，加入3滴溶液I，再加3滴溶液Ⅱ，产生绿－棕－黑色沉淀为阳性反应。
（7）醋酸镁试剂
检查黄酮类、二氢黄酮类化合物，及羟基蒽醌类衍生物。
1％醋酸镁甲醇溶液。在滤纸或薄层板上，点1滴样品醇溶液，挥去醇后，点l滴试剂于样品斑点边缘，加热干燥，于紫外灯下观察，黄酮类显黄色荧光，二氢黄酮类呈天蓝色荧光。显橙红色为大黄素型蒽醌，显紫色为茜草型蒽醌。
（8）硼氢化钾试剂
检查二氢黄酮类化合物。
2％四氢硼钾的甲醇溶液。取样品1～2mg溶于甲醇中，加等量试剂lml后，加数滴盐酸，呈红-紫红色为阳性反应。薄层色谱上喷试剂，5min后放人盐酸蒸气槽内呈色。
4．醌类化合物鉴定试剂
（1）Borntrager试剂
检查羟基蒽醌衍生物。
2％氢氧化钠或2％碳酸钠溶液(或甲醇溶液)。取lml样品的乙醇溶液，加lml试剂，呈红色为阳性反应。在薄层色谱上喷洒试剂，显橙黄或红色斑点。黄酮类化合物遇碱也能反应生成黄、橙、红色等。
（2）菲格尔(Feigl)试剂
检查醌类衍生物。
溶液I：25％碳酸钠溶液。溶液Ⅱ：4％甲醛的苯溶液。溶液Ⅲ：5％邻二硝基苯的苯溶液，取1滴样品的苯溶液，加入上述3种试液各1滴，混匀，置水浴上加热l～4min，呈显著的紫色为阳性反应。
（3）硼氢化钠－二甲基甲酰胺试剂
检查蒽醌及其衍生物。
20g硼氢化钠溶于100ml二甲基甲酰胺中。作色谱显色剂用。喷洒试剂后，于紫外光灯下观察，显强的黄、绿或蓝色荧光为阳性反应。
（4）硼酸试剂
检查羟基蒽醌类化合物。
1％硼酸溶液。作色谱显色剂用，喷洒后，置紫外光灯下观察，呈黄、橙、红色荧光为阳性反应。
（5）对亚硝基二甲基苯胺试剂
检查蒽酮类衍生物。
0.1％对亚硝基二甲基苯胺的吡啶溶液。取1m1样品的乙醇溶液，置水浴上蒸干，残渣用吡啶溶解，再滴试剂数滴，显紫色或绿色为阳性反应。
（6）活性次甲基试剂
检查苯醌及萘醌类衍生物。
lg活性次甲基试剂(例如丙二酸酯、乙酰乙酸酯等)溶于30ml氨与乙醇的等体积混合溶液中。取5ml样品的乙醇溶液，加入3ml试剂，显蓝、紫或红色为阳性反应，萘醌分子中具羟基，可使反应减慢或不起反应。
5．内酯、香豆素类鉴定试剂
（1）开环－闭环试剂
检查内酯环。
溶液I：1％氢氧化钠溶液。溶液Ⅱ：2％盐酸溶液。取lml样品的乙醇溶液，加2ml溶液I，置沸水浴上加热3～4min，溶液比未加热时澄清。再加溶液Ⅱ酸化(pH2)，放置，溶液又变为混浊。酚性化合物和有机酸有干扰，但可用下法予以区别，取样品乙醇溶液数毫升，置水浴上蒸干溶剂，用乙酸乙酯溶解后置分液漏斗内，用5％氢氧化钠溶液萃取酚性及有机酸成分，乙酸乙酯溶液用水洗至中性后按上法检测。
（2）异羟肟酸铁试剂
检查内酯环。
溶液I：7％盐酸羟胺甲醇溶液(新鲜配制)。溶液Ⅱ：10％氢氧化钾甲醇溶液。溶液Ⅲ：1％三氯化铁甲醇溶液。取1m1样品的甲醇溶液，加入溶液I、Ⅱ各5滴，置沸水浴上加热3min～4min，冷却后，用稀盐酸调至pH3～4，再加入溶液Ⅲ1滴～2滴，显橙红或紫红色为阳性反应。作色谱显色用，将溶液I，Ⅱ等量混合，喷洒后空气中干燥10min，再喷溶于1％盐酸中的三氯化铁溶液，显橙红或紫红色斑点。
（3）稀氢氧化钠溶液 将检样点于滤纸片或薄层上，试样边缘点上碱液，晾干，置紫外灯光下观察，多数羟基香豆素有强的荧光。
配合酚类鉴定试剂的检查，以确定游离酚羟基的存在及取代位置。
6，强心甙鉴定试剂
（1）碱性3，5－二硝基苯甲酸(Kedde)试剂
检查强心甙的 、 －不饱和内酯环。
2％3，5－二硝基苯甲酸甲醇溶液与5％氢氧化钾溶液，用前按1︰l混合。取1m1样品的甲醇溶液，加入3～4滴试剂，显紫红色为阳性反应，几分钟后褪色。也适用于薄层色谱。
（2）碱性苦味酸(Baljet)试剂
检查强心甙的 、 －不饱和内酯环。
9ml 1％苦味酸乙醇溶液与1ml l0％氢氧化钠溶液用前配制混合。用1m1样品的乙醇溶液，加入1滴试剂，放置15min左右，显橙红色或红色为阳性反应。
（3）碱性亚硝酰铁氰化钠（Legal）试剂
检查不饱和内酯、甲基酮或活性亚甲基（常用于强心甙）。
溶液I：0.5％亚硝酰铁氰化钠乙醇溶液。溶液Ⅱ：10％氢氧化钠溶液。取1 m1样品的甲醇溶液，置水浴上蒸干，冷却后加lml吡啶溶解残渣，加入4～5滴溶液I和1～2滴溶液Ⅱ，溶液显红色并逐渐消失为阳性反应。用于薄层色谱检查，将1g亚硝酰铁氰化钠溶于10％氢氧化钠－乙醇（1︰1）的溶液中，喷洒后，显红色或紫色斑点。
（4）磷酸－溴试剂
检查强心甙。
溶液I：10％磷酸乙醇溶液。溶液Ⅱ：溴化钾饱和溶液－溴酸钾饱和溶液－25％盐酸溶液(1﹕l﹕1)。用于薄层色谱检查，取溶液I喷洒后，125℃加热12min，紫外光灯下观察。再将薄层板烤热，趁热喷溶液Ⅱ，不同的强心苷显示不同的颜色斑点。
（5）醋苷－硫酸（Liebermann-Burchard）试剂
检查甾体、甾体皂苷、三萜类及强心苷。
取0.1～0.2mg样品，置于白瓷反应板上，加入0.3ml醋酐，使样品溶解，沿边缘滴入硫酸，出现红－紫－蓝－绿色，最后褪色为甾体皂甙，三萜皂甙只能呈黄－红－紫等。
（6）三氯醋酸—氯胺T试剂
检查洋地黄毒甙元衍生物和2，6－去氧糖苷。
25％三氯醋酸乙醇（氯仿）溶液4ml与3％氯胺T溶液1ml混匀。喷洒后，100℃加热数分钟，于紫外光灯下观察。洋地黄毒甙元的苷类显黄色荧光，羟基洋地黄毒苷元的甙类显亮蓝色荧光，异羟基洋地黄毒苷元的苷类呈灰蓝色荧光。洋地黄毒糖的苷（2，6－去氧糖苷）在可见光下呈暗蓝色。
强心苷的鉴定应由苷元（甾体母核和不饱和五元内酯）和2－去氧糖两部分共同证实。
7、甾体、三萜及其苷的鉴定试剂
（1）三氯化锑试剂
检查甾体、萜类、皂苷。
25g三氯化锑溶于75ml氯仿中。喷后100℃加热5min，不同的皂苷元在可见光或紫外光灯下显不同颜色。
（2）三氯醋酸试剂
检查皂甙。
3.3g三氯醋酸溶于10ml氯仿，再加入1～2滴30％过氧化氢溶液。将样品的氯仿溶液滴在滤纸上，加试剂l滴，加热至60℃，生成红色－紫色为甾体皂甙；加热到100℃始见显色为三萜皂甙o
（3）硫酸：甲醇（1︰1）试剂 喷后加热，不同皂苷元可显红褐色、紫色、黄色或黑色。所显颜色与温度无关。
（4）氯磺酸：乙酸（1︰1）试剂 喷后130℃加热5min，各种皂苷元可显天蓝色、
紫色、粉红色、淡棕色等，在紫外光灯下也显不同的荧光。
（5）香草醛－硫酸试剂
检查高级醇类、酚类、甾体、萜类、芳香油。
1g香草醛溶于100ml硫酸中，或0.5g香草醛溶于100ml硫酸－乙醇(4﹕1)中。喷洒后，室温、120℃加热观察，显示红、蓝、紫等各种颜色斑点。
8．氰苷鉴定试剂
（1）苦味酸试纸 取适当大小的滤纸，浸入苦味酸饱和溶液中，浸透后取出，晾干。再浸入10％碳酸钠溶液内，迅速取出，晾干即得。取样品粉末0.5g置试管中，加水混合均匀，加入稀硫酸数滴。在试管口夹放一条苦味酸试纸（试纸不能接触到药液），塞紧。将试管在沸水浴中加热数分钟，试纸变成红色，表明含氰苷。
（2）普鲁士蓝试验
溶液I：10％硫酸亚铁溶液（用前配制）。溶液Ⅱ：5％三氯化铁溶液。取样品粉末0.5g置试管中，加水湿润，立即用经10％氢氧化钾溶液湿润的滤纸将试管口包紧，于热水浴上加热10min后，在滤纸上加溶液I、稀盐酸和溶液Ⅱ各1滴，滤纸显蓝色为阳性。
三、挥发油鉴定试剂
1、茴香醛－硫酸试剂
硫酸1m1加至50ml冰醋酸中，冷却后加入茴香醛0．5ml(必须临用时配制)。喷洒后,105℃加热，挥发油中各成分显不同颜色。
2、碘化钾－冰醋酸－淀粉试剂
检查过氧化物。
溶液I：4％碘化钾溶液10ml与冰醋酸40ml混和，再加锌粉一小勺过滤。溶液Ⅱ：新制的1%淀粉溶液。先喷溶液I，5min后大量喷溶液Ⅱ，直至薄层透明为止。显蓝色斑点为过氧化物。
3、2，4-二硝基苯肼试剂
lg 2，4-二硝基苯肼、36％盐酸l0ml溶于1000ml乙醇中。喷洒后，显黄红色斑点为阳性反应。
4、硝酸铈试剂
检查醇类化合物。
硝酸铈6g溶于2.5％100 ml硝酸溶液中，喷洒后，黄色背景上显棕色斑点为阳性反应。
5、钒酸铵（钠）－8－羟基喹啉试剂
检查醇类化合物
1％钒酸铵（钠）溶液1ml和8－羟基喹啉的6％乙醇溶液1ml混和，用30ml苯萃取，分取灰蓝色的苯溶液为试剂。喷洒后，微加热，灰蓝色背景上显淡红色斑点为阳性反应。
挥发油组成复杂，需依据结构特征如醇、醛、酮、酚、醚、酯、内酯等选择鉴定试剂。
四、生物碱鉴定试剂
1、改良碘化铋钾试剂
为生物碱通用显色剂。
溶液I：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。溶液Ⅱ：8g碘化钾溶于20ml水中。溶液I和溶液Ⅱ等量混和，于棕色瓶中可以保存较长时间。目前市场上有碘化铋钾试剂可供直接配置：7.3g碘化铋钾、10ml冰醋酸加水60ml。取
lml样品的稀酸溶液，加1滴～2滴试剂，产生桔红色浑浊或沉淀为阳性反应。作为薄层色谱显色剂，取混和液1ml、醋酸2ml、水10ml混和即得。喷洒后呈桔红色斑点为阳性反应。
2、碘化汞钾
为生物碱通用沉淀试剂。
1.36g氯化汞和5g碘化钾各溶于20 ml水中，将氯化汞溶液慢慢加入碘化钾溶液，混合后，加水至100ml。取lml样品的稀酸溶液，加1～2滴试剂，产生类白色沉淀为阳性反应。
3、硅钨酸试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
1g硅钨酸溶于20 ml水中，加10％盐酸使成pH2左右。取1 ml样品的稀酸溶液，加入1～2滴试剂，产生白色至褐色沉淀为阳性反应。
4、碘化铂钾（碘铂酸）试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
10％六氯铂酸3ml和97ml水混合，加6％碘化钾溶液100ml，混合均匀（临用前配制）。取1 ml样品稀酸溶液，加l～2滴试剂，不同生物碱显不同颜色沉淀。
5、碘—碘化钾试剂
为生物碱沉淀剂。
1g碘及10g碘化钾溶于50ml水中，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml。取1 ml样品稀酸溶液，加入试剂1～2滴，产生棕色或褐色沉淀为正反应。
6、苦味酸试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
苦味酸1g溶于100ml水中。取1 ml样品中性溶液，加入试剂1～2滴，产生黄色晶形沉淀。
7、鞣酸试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
鞣酸1g用1ml乙醇溶解后，加水至10 ml 。取lml样品稀酸溶液，加入试剂1～2滴产生白色至棕黄色沉淀。
8、硫酸铈—硫酸试剂
检查生物碱及含碘化合物。
0.1g硫酸铈悬浮于4ml水中，加三氯醋酸1g，加热至沸，放冷，逐滴加入硫酸直到浑浊消失为止。喷洒试剂后，110℃加热数分钟，呈色（不同生物碱显不同的颜色）。
9、钒酸钠—硫酸试剂
检查生物碱。
1g钒酸钠溶于100ml硫酸中。喷洒试剂后，不同生物碱产生不同颜色，如莨菪碱显红色，马钱子碱显血红色，士的宁显蓝紫色，奎宁显淡橙色，吗啡显棕色等。
10、雷氏铵盐试剂
检查水溶性生物碱。
2％硫氰化铬铵溶液（临用时配制）。取1ml样品的弱酸性水溶液（pH5～6），加入1～2滴试剂，产生暗红色沉淀为阳性反应。
11、Ehrlich试剂
检查吡咯、吲哚类生物碱。
1g对二甲氨基苯甲醛溶于25ml 36％盐酸和75ml甲醇混合溶液中。取1ml样品的稀酸溶液，加人数滴试剂，加热，显紫红或青紫色为阳性反应。
五、鞣质类鉴定试剂
1、氯化钠—明胶试剂
检查鞣质。
1g明胶溶于50ml水中（60℃水浴中加热），加入10g氯化钠，使完全溶解后，用水稀释到100ml。取1m1样品的60℃水浸液，加入1～2滴试剂，产生白色浑浊或沉淀
2、对甲苯磺酸试剂。
检查鞣质、甾体、黄酮类。
20％对甲苯磺酸氯仿溶液。薄层色谱上喷洒试剂后，100℃加热5min显出不同颜色的斑点。
3、新鲜石灰水试剂
检查鞣质。
取1ml样品的热水提取溶液，加新鲜石灰水上清溶液数滴，产生青灰色沉淀为可水解鞣质，产生棕或棕红色沉淀为缩合鞣质。
六、氨基酸、多肽、蛋白质鉴定试剂
1、茚三酮试剂
检查2－氨基酸及含有2-氨基酸的肽类、氨基糖和蛋白质。
0.2g茚三酮溶于l00ml正丁醇中，加冰醋酸3ml。或者，0.2g茚三酮溶于l00ml乙醇或丙酮中。取1ml样品的冷水浸液，加入2～3滴试剂，沸水浴上加热5min放冷，显蓝色或蓝紫色。
2、吲哚醌试剂
检查氨基酸、多肽。
吲哚醌1g溶于100ml丙酮中，加入10ml醋酸。作薄层色谱显色剂，喷洒试剂后，100～110℃加热l0min，显蓝、红、桃红或棕色斑点。
3、1，2-萘醌－4－磺酸钠试剂
检查氨基酸。
0.02g l，2－萘醌－4－磺酸钠溶于l00ml5％碳酸钠溶液中，新鲜配制。喷洒试剂后，室温晾干，不同氨基酸出现不同的颜色。
4、双缩脲试剂
检查多肽、蛋白质。
七、有机酸鉴定试剂
1、溴酚蓝试剂
检查有机酸。
0.1％溴酚蓝的乙醇溶液。作薄层色谱显色剂，喷洒后，蓝色背景上呈黄色斑点。如不明显，可再喷氨水，然后暴露在盐酸气体中，则为黄色背景上呈蓝色斑点。
2、芳香胺—还原糖试剂
检查有机酸。
5g苯胺和5g木糖溶于100ml 50％乙醇中。作薄层色谱显色剂，喷洒试剂后，
125～130℃加热至出现棕色斑点。
3、吖啶试剂
检查有机酸。
0.005％的吖啶乙醇溶液。喷洒试剂后，于紫外光灯下观察，显黄色荧光。
一、 利用紫外光谱测定黄酮类化合物的结构
大多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。出现在300～400nm之间的吸收带称为带Ⅰ，出现在240～280nm之间的吸收带称为带Ⅱ。不同类型的黄酮化合物的带Ⅰ或带Ⅱ的峰位、峰形和吸收强度不同，因此从紫外光谱可以推测黄酮类化合物的结构类型。
当向黄酮类化合物的甲醇（或乙醇）溶液中分别加入甲醇钠（NaOMe）、乙酸钠（NaOAc）、乙酸钠-硼酸（NaOAc-H3BO3）、三氯化铝或三氯化铝-盐酸（AlCl3/HCl）试剂能使黄酮的酚羟基离解或形成络合物等，导致光谱发生变化。据此变化可以判断各类化合物的结构，这些试剂对结构具有诊断意义，称为诊断试剂。
黄酮和黄酮醇类
（一）黄酮、黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征
黄酮或黄酮醇的带Ⅰ是由B环桂皮酰基系统的电子跃迁所引起的吸收，带Ⅱ是由A环的苯甲酰基系统的电子跃迁所引起的吸收。
黄酮和黄酮醇的UV光谱图形相似，仅带Ⅰ位置不同，黄酮带Ⅰ位于304～350nm，黄酮醇带Ⅰ位于358～385nm。利用带Ⅰ的峰位不同，可以区别这两类化合物。
黄酮、黄酮醇的B环或A环上取代基的性质和位置不同将影响带Ⅰ或带Ⅱ的峰位和形状。例如，7和4′位引入羟基、甲氧基等含氧取代基，可引起相应吸收带向红位移。又如3-或5-位引入羟基，因能与C4＝O形成氢键缔合，前者使带Ⅰ向红位移，后者使带Ⅰ、带Ⅱ均向红位移。B环上的含氧取代基逐渐增加时，带Ⅰ向红位移值（nm）也逐渐增加，但不能使带Ⅱ产生位移。有时（例如3′，4′-位有2个羟基或2个甲氧基或亚甲二氧基）仅可能影响带Ⅱ的形状，使带Ⅱ歧分为双峰或1个主峰（Ⅱb位于短波处）和1个肩峰（sh）或弯曲（Ⅱa位于长波处）。
A环上的含氧取代基增加时，使带Ⅱ向红位移，而对带Ⅰ无影响，或影响甚微（但5-羟基例外）。
黄酮或黄酮醇的3-，5-或4′-羟基被甲基化或苷化后，可使带Ⅰ向紫位移，3-OH甲基化或苷化使带Ⅰ（328～357nm）与黄酮的带Ⅰ的波长范围重叠（且光谱曲线的形状也相似），5-OH甲基化使带Ⅰ和带Ⅱ都向紫位移5～15nm，4′-OH甲基化或苷化，使带Ⅰ向紫位移3～10nm。其他位置上的羟基取代对甲醇中的紫外光谱几乎没有影响。
（二）利用诊断试剂对黄酮、黄酮醇类化合物UV光谱的影响检出羟基位置
1．甲醇钠（NaOMe），主要是判断是否有4′-OH，3、4′－二OH或3、3′、4′－三OH。
2．乙酸钠，较为突出的是判断是否有7-OH。［举例说明］
3．乙酸钠/硼酸 主要判断A环或B环是否有邻二酚羟基（5，6-二OH除外）。［举例说明］
4．三氯化铝及三氯化铝/盐酸，为判断有无邻二酚羟基，3-OH、5-OH提供信息。
（三）异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征
这三类化合物都有苯甲酰系统，而无桂皮酰结构，所以它们的紫外光谱都有强的带Ⅱ吸收，异黄酮带Ⅱ吸收在245～270nm，而二氢黄酮和二氢黄酮醇的带Ⅱ在270～295nm，一般只受A环的含氧取代基的影响，A环含氧取代基数
增加，吸收峰向红位移。
（四）利用诊断试剂对异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类化合物的UV光谱的影响判断羟基位置
1．甲醇钠
①带Ⅱ向红位移，示A环上有羟基。
②如有5，6，7-或5，7，8-三羟基或3′，4′-二羟基，则吸收带将随放置的延长而逐渐衰退。
③二氢黄酮、二氢黄酮醇带Ⅱ向红位移的大小取决于是否有游离的5-OH。
2．乙醇钠
①乙醇钠使7-羟基异黄酮的带Ⅱ向红位移6～20nm，但6-位有含氧取代基时，乙醇钠几乎不能使带Ⅱ产生移动。4′，5，6，7-四羟基异黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。
②乙醇钠使5，7-二羟基二氢黄酮和5，7-二羟基二氢黄酮醇带Ⅱ向红位移34～37nm，而其相应的5-去氧化合物则移动51～58nm。5，6，7-三羟基二氢黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。
3．乙醇钠/硼酸
不能用NaOAc/H3BO3对异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类的紫外光谱的影响来检查B环邻位二羟基，因为它们的B环与主要发色团缺少有效的共轭。但它们中的A环有6，7-二羟基时，加入NaOAc/H3BO3后使带Ⅱ向红位移10～15nm。
4．三氯化铝和三氯化铝/盐酸
①异黄酮、二氢黄酮（可能也包括二氢黄酮醇）的A环如有邻二羟基（6，7-或7，8-，不包括5，6-），则带Ⅱ在AlCl3中比在AlCl3/HCl中向红位移11～30nm。
②有5-羟基的异黄酮，其带Ⅱ在AlCl3/HCl存在下与在甲醇中的光谱相比，向红位移10～14nm，而有5-羟基的二氢黄酮和有5-羟基的二氢黄酮醇类的带Ⅱ在同样情况下向红位移20～26nm。目标检测：
黄酮类化合物的鉴别与结构测定现在多依赖于谱学的综合解析，而化学方法和色谱方法已降至辅助地位。未知黄酮类化合物的鉴定，多在测定分子式的基础上，利用PPC或TLC得到的Rf值或hRf值与文献比较或分析对比样品在甲醇溶液中及加入各种诊断试剂后得到的紫外及可见光谱进行剖析。同时，对于化合物的颜色反应，以及在提取分离过程中所表现的行为（如溶解度、酸或碱中的溶解情况、铅盐沉淀等）也应注意分析。但这些方法均有一定局限性，并曾导致得出过一些错误结论。质子核磁共振（1H—NMR）因为可定量测定H的个数，以及根据质子的化学位移和芳香氢核之间的自旋偶合所提供的信息（裂分数目及偶合常数大小），可确定黄酮母核上的取代模式。近来由于仪器分辨率的不断改进，加以同核去偶、溶剂位移以及核磁共振技术的使用，1H－NMR谱的测定对分析天然黄酮类化合物的结构已经成为一种非常重要的手段。但是正如以后谈到的那样，在黄酮类化合物的1H-NMR谱上，有时要想确切指认每个信号并不是一件容易的事情。例如当黄酮类母核的A-环上只有一个芳香氢核时，要想与H-3信号区别，就是十分困难的问题。解决这种问题，13C核磁共振(13C－NMR)技术有很大的优势。加上各种取代基位移及苷化位移效应的发现，使得图谱的解析工作大大简化。因此，13C-NMR技术在黄酮类化合物的结构鉴定中发挥着越来越重要的作用。质谱（MS）技术，
尤其场解析质谱（FD－MS）与快速原子轰击质谱（FAB－MS）及串联质谱（MS－MS）的出现与应用，使其成为黄酮类化合物结构鉴定的重要手段之一（质谱技术的优势是只需要微量的样品就可获得有关整个分子结构及其主要碎片结构的重要信息）。
实际工作中常常根据需要，灵活、综合运用上述方法和手段，并辅以必要的化学方法，以求结构鉴定获得满意的结果。
二、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用
纸色谱（PPC）适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物。混合物的鉴定常采用双向色谱法。以黄酮苷类来说，一般第一向展开采用某种醇性溶剂，如n-BuOH－HOAc－H2O（4∶1∶5上层，BAW）、t-BuOH－HOAC－H2O （3∶1∶1，TBA）或水饱和的n-BuOH等，这些主要是根据分配作用原理进行分离。第二向展开溶剂则用水或下列水溶液，如：2％～6％HOAc、3％NaCl及HOAc-浓HCl－H2O（30∶3∶10）等。它们主要是根据吸附作用原理进行分离。 黄酮类化合物苷元一般宜用醇性溶剂或用C6H6－HOAc－H2O（125∶72∶3）、CHCl3－HOAC－H2O（13∶6∶l）、PhOH-H2O（4∶1）或 HOAC一浓HCl-H2O（30∶3∶3） 进行分离。而花色苷及花色苷苷元，则可用含HCl或HOAC的溶液作为展开剂。
多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外光灯检查时，可以看到有色斑点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。此外还可喷以2％ AlCl3（甲醇）溶液（在紫外光灯下检查）或1％FeC13－1％K3Fe(CN)6（1∶1）水溶液等显色剂。 黄酮类化合物苷元中，平面性分子如黄酮、黄酮醇、查耳酮等，用含水类溶剂如 3％～5％HOAC展开时，几乎停留在原点不动（Rf＜0.02＝；而非平面性分子如二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮等，因亲水性较强，故Rf值较大(0.10～0.30)。黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性即随之增大，故在醇性展开剂中Rf值相应降低，同一类型苷元，Rf值依次为：苷元＞单糖苷＞双糖苷。以在BAW中展开为例，多数类型苷元（花色苷元例外）Rf值在0.70以上，而苷则小于0.70。但在用水或2％～ 8％HOAC，3％ NaCl或1％ HCl展开时，则上列顺序将会颠倒，苷元几乎停留在原点不动，苷类的Rf值可在0.5以上，糖链越长，则Rf值越大。另外，糖的结合位置对Rf值也有重要的影响。不同类型黄酮类化合物在双向PPC展开时常常出现在特定的区域，因此可推测它们的结构类型以及判定是否成苷以及含糖数量。除PPC外，TLC用于黄酮类化合物的鉴定也日趋广泛。一般采用吸附薄层色谱，常用的吸附剂有硅胶与聚酸胺，其次是纤维素。
硅胶薄层色谱；用于分离与鉴定弱极性黄酮类化合物较好。分离黄酮苷元常用的展开剂是甲苯-甲酸甲酯-甲酸 （5∶4∶1），并可以根据待分离成分极性的大小适当地调整甲苯与甲酸的比例。另外尚有苯-甲醇(95：5)、苯-甲醇-醋酸（35∶5∶5）、氯仿一甲醇（8.5∶1.5∶7∶0.5）、甲苯-氯仿-丙酮(4O∶25∶35)、丁醇一吡啶-甲酸(40∶10：∶)等分离黄酮苷元的衍生物如甲醚或醋酸乙酯等中性成分，可用苯-丙酮（9∶1）、苯-醋酸乙酯(7.5∶2.5）等为展开剂。
聚酸胺薄层色谱：适用范围较广，特别适合于分离合游离酚羟基的黄酮及其苷类。由于聚酸胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因而需要可以破坏其氢键缔合的溶剂为展开剂。
在大多数展开剂中含有醇、酸或水。常用的展开剂有乙醇一水(3∶2)、水-
乙醇-乙酸丙酮(4∶2∶1)、水-乙醇-甲酸-乙酸丙酮(5∶1.5∶l：0.5)、水饱和的正丁醇一醋酸（100∶1∶100∶2）、丙酮-水（1∶1）、丙酮-95％乙醇-水（2∶1∶2）、95％乙醇-醋酸（100∶2）、苯-甲醇-丁酮（60∶20∶20）等。 Stahl总结前人的工作，介绍了一些黄酮苷元和黄酮苷用硅胶、聚酸胺与纤维素三种薄层色谱和四种混合溶剂作为展开剂所得到的hRf值。
三、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴别中的应用
紫外及可见分光光度法是鉴别黄酮类化合物结构的一种重要手段，一般程序如下：
（1）测定样品在甲醇溶液中的UV光谱；
（2） 测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。常用的诊断试剂有甲醇钠（NaOMe）．醋酸钠（NaOAc）、醋酸钠一硼酸（NaOAc－H3BO3）．三氯化铝（AICI3）及三氯化铝一盐酸（AICI3－HCI）等。 提取与分离
一、提取
黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。
黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。其中用得最多的是甲醇－水（1∶1）或甲醇。一些多糖苷类则可以用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸（如0.1％盐酸）。但提取一般黄酮苷类成分时，则应当慎用，以免发生水解反应。为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂，如氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，对多甲氧基黄酮的游离苷元，可用苯进行提取。 对得到的粗提取物可进行精制处理，常用的方法有：
（一）溶剂萃取法：利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。
有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常用的溶剂系统有：水一醋酸乙酯，正丁醇一石油醚等。
溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。
（二）碱提取酸沉淀法
黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷提取都应用了这个方法。现以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。
槐米（槐树 SOphora japonica L．花蕾）加约 6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至 pH 8～9，在此 pH条件下微沸 20～30 min，趁热抽滤，残渣再加 4倍量的水煎一次，趁热抽滤。合并滤液，在60～70t的条件下，用浓盐酸将合并滤液调至PH为5，搅匀后静置24 h，抽滤。用水将沉淀物洗至中性， 60℃干燥得芦丁粗品，用沸水重结晶， 70一80℃干燥后得芦丁纯品。
在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过离，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成样盐，致
使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药材中含有大量果胶、粘液等水溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不被溶出。这将有利于黄酮类化合物的纯化处理。
（三）炭粉吸附法
主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸附苷的炭末，依次用沸水、佛甲醇、7％酚一水、15％酚一醇溶液进行洗脱。对各部分洗脱液进行定性检查（或用 PPC鉴定）。通过对BaPtisia lecontei中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮耷类可用7％酚一水洗下。洗脱液经减压蒸发浓缩至小体积，再用乙酸振摇除去残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。
二、分离
现将较常用的分离方法介绍如下：
（一）柱色谱法
分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。
1．硅胶柱色谱此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及离度甲基化（或乙醇化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。供试硅胶中混存的微量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。
2．聚酰胺柱色谱 对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。以Baptisialecontei为例：黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下述规律：
（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：叁糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。
（2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减慢。当分子中羟基数目相同时，羟基位置对吸附也有影响，聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱顺序为：具有邻位羟基黄酮，具有对位（或间位）羟基黄酮。
（3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇。
（4）分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱上的行为。
3．葡聚糖凝胶（Sephadex gel）柱色谱对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex－G型及Sephadex－LH－厂－型。用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机制是：
分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。
表6-5中Ve为洗脱样品时需要的溶剂总量或洗脱体积； V0为柱子的空体积。Ve／V0数值越小说明化合物越容易被洗脱下来。上表所列数据清楚地表明：苷元的羟基数越多，Ve／V0越大，越难以洗脱，而苷的分子量越大，其上联结糖的数目越多，则Ve／V0越小，越容易洗脱。
葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有：
（1）碱性水溶液（如 0．1mol／L NH4OH），含盐水溶液（0．5 mol／L NaCI等）。
（2）醇及含水醇，如甲醇，甲醇－水（不同比例），叔丁醇－甲醇（3：1）、乙醇等。
（3）其他溶剂，如含水丙酮、甲醇－氯仿等。
（二）铅盐法
此法过去曾用于研究，目前已很少采用。一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入适量中性醋酸铅、碱式醋酸铅水液，分别使具有邻二酚羟基成分（包括黄酮）及含羟基成分，具有一般酚羟基的成分分离，再分别将铅盐沉淀悬浮于醇中，脱铅后得到成分。
（三）硼酸铬合法
有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与无邻二酚羟基的黄酮类化合物相互分离。
（四）pH梯度萃取法
pH梯度萃取法适合于酸性强弱不同的游离的黄酮类化合物的分离，将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用5％NaHCO3（萃取出7，4′－二羟基黄酮）、5％Na2CO3（萃取出7－或4′－羟基黄酮）、0.2％NaOH（萃取出具一般酚羟基黄酮）、4％NaOH（萃取出5－羟基黄酮）萃取而使之分离。
聚酰胺薄膜的分离机制主要是分子键氢键和吸附。当展开剂为不同比例的醇-水时，其分离机制与反相板类似，苷元较苷的Rf值低；当展开剂为有机溶剂时，分离机制与正相板类似，苷元较苷的Rf值高。
常用显色剂多了去了，看你是要用于鉴别什么了。
碘蒸气是通用显色剂，对很多化合物都显黄棕色。碘显色过程中由碘蒸气分子与化合物发生结合而显色。
香草醛浓硫酸显色原理是使羧基脱水，增加双键结构，再经双键位移，双分子缩合等反应生成共轭双键系统，又在酸作用下形成阳碳离子盐而显色。
比如：（1）矾酸铵一浓硫酸溶液（Mandelin试剂）为1％矾酸铵的浓硫酸溶液。如遇阿托品显红色，可待因显蓝色，士的宁显紫色到红色。
（2）钼酸铵一浓硫酸溶液（Frohde试剂）为1％钼酸钠或钼酸铵的浓硫酸溶液，如遇乌头碱显黄棕色，小檗碱显棕绿色，阿托品不显色。
（3）甲醛一浓硫酸试剂（Marquis试剂）为30％甲醛溶液0.2ml与10ml浓硫酸的混合溶液。如遇吗啡显橙色至紫色，可待因显红色至黄棕色。
（4）浓硫酸 如遇乌头碱显紫色、小檗碱显绿色，阿托品不显色。
（5）浓硝酸 如遇小檗碱显棕红色，秋水仙碱显蓝色，咖啡碱不显色。
(1) 重络酸钾-硫酸:检查一般有机物.
喷洒剂:5克重络酸钾溶于100毫升40%硫酸中.
薄层检查:喷洒后加热到150℃至班点出现
(2) 荧光素-溴:检查不饱和化合物
喷洒剂:0.1克荧光素溶于100毫升乙醇中
溴试剂:5%的溴的四氯化碳溶液
喷洒后处理:喷洒荧光素溶液后,放置存有溴溶液的缸内,可于紫外线分析灯下检
查荧光,荧光素与溴化和成曙红(Eosin)(无萤光),而不饱和化合物则成溴加成物,保留了原有荧光;若点样较多,则呈黄色斑点,底板呈红色.
(3) 碘:检查一般有机物.
方法:a 层析谱放密闭缸内或瓷盘内，缸内预先放有碘结晶少许，大部分有机化合物呈棕色斑点。
B 层析谱放碘蒸气中5分钟（或喷5％碘的氯仿溶液）取出置空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷1％淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。
（4）硫酸：通用
喷洒剂：5％的浓硫酸乙醇溶液，或15％浓硫酸正丁醇溶液，或浓硫酸－醋酸（1：
1）喷洒后处理：空气中干燥15分钟，再热至110℃直至出现颜色或荧光。
（5）硝酸银－氢氧化铵（Tollen-Zaffaroni）试剂：检查还原性物质。 溶液I : 0.1%N硝酸银; 溶液II: 5N氢氧化铵
喷洒剂: I和II以1:5混合(临用前混合)
喷洒后处理: 105℃加热5~10分钟,至深黑色斑点出现.
(6)磷钼酸或磷钨酸,硅钨酸:检查还原性物质,类脂体,生物碱,甾体
喷洒剂: 5~10%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液
喷洒后处理: 120℃加热至斑点出现.
沉淀试剂: 1克硅钨酸溶于20毫升水中,加10%盐酸至强碱性.
生物碱
(7)硫酸??=硫酸:检查生物碱及含碘化合物
喷洒剂: 0.1克硫酸?混悬于4毫升水中,加入1克三氯醋酸,加热至沸,逐滴加入浓硫酸至澄清.
喷洒后处理: 110℃加热数分钟至斑点出现.
(8)碘化铋钾(Dragendorff)试剂:检查生物碱及其他含氟化合物.
溶液I: 0.85克次硝酸铋溶于10毫升冰醋酸40毫升水中
溶剂II: 8克碘化钾溶于20毫升水中.
制备液I+II,等体积混合.可用于棕色瓶中保存较长时间,一般制备液可作沉淀试剂用.
喷洒液: 制备液1毫升与2毫升醋酸,10毫升水混合即得
(9).碘化汞钾(Mayer)试剂: 检查生物碱.
制备液: 13.55克氯化汞和49.8克碘化钾各溶于20毫升水中,等体积混合并用水稀释至1000毫升.
喷洒液: 制备液加1/10体积的17%盐酸.
喷洒后处理: 观察斑点,并于紫外线荧光分析灯下检出.
(10) ?酸纳-浓硫酸(Mandelin)试剂:检查生物碱.
1%>酸纳的浓硫酸溶液.与多种生物碱呈不同颜色.
(11)碘－碘化钾(Wagner)试剂:检查生物碱.
1克碘及10克碘化钾,溶于50毫升水中,加热,加2毫升醋酸,再用水稀释至100毫升.
可作纸层板显色剂,液可作沉淀试剂.
酚类,鞣质
(12)三氯化铁:检查酚类及??酸.
喷洒剂:1~5%三氯化铁的水溶液或乙醇溶液.并加盐酸少许.??酸呈红色斑点,酚类称蓝色或绿色斑点.
(13)铁氰化钾-三氯化钾:检查酚类,芳香胺类及还原性物质.
喷洒剂: 1%铁氰化钾水溶液,2%三氯化铁水溶液.临用前等体积混合.
喷洒后处理: 喷洒后酚性物质呈蓝色斑点.再喷2N盐酸,能使颜色加深,纸谱可用烯盐酸洗去喷洒液.
(14) 4-胺基安替比林-铁氰化钾(Emerson反应): 检查酚类.
喷洒剂: I . 2%4-氨基安替比林乙醇溶液;
II. 8%铁氰化钾水溶液.
或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液
方法: 先喷洒I,再喷洒II,即显色,或再放入密闭缸中,缸内放25%氢氧化铵,即产生橙色至深红色.
(15) 对氨基苯磺酸,重氮盐(Pauly试剂): 检查酚类,芳香胺类及能偶合的杂环化合物.
喷洒剂: 4.5克对氨基苯磺酸,加热溶于45毫升12N盐酸中,用水稀释至500毫升,取10毫升稀释液用冰冷却,加10毫升冷4.5%亚硝酸钠水溶液,0℃放15分钟(此试剂于0℃可保存3天),用前加等体积1%碳酸钠水溶液.
一般重氮化试剂,也可用联苯胺,对硝基苯胺等.
(16) 对甲苯磺酸: 检查甾体,黄酮,鞣质.
喷洒剂: 20%对甲苯磺酸氯仿溶液.
喷洒后处理: 100℃加热数分钟,紫外线分析灯下检查荧光斑点.
含氧杂环及蒽醌类*
(17) 三氯化铝: 检查黄酮体.
喷洒1%三氯化铝乙醇液于紫外线荧光分析灯下检示,呈黄色荧光
(18)碱式醋酸铅: 检查黄酮体.
喷洒剂: 饱和碱式醋酸铅(或饱和醋酸铅)水溶液.
于紫外线荧光分析灯下检查荧光斑点.
(19)醋酸镁: 检查蒽醌甙,甙元及黄酮体
喷洒剂: 0.5%醋酸镁甲醇溶液
方法: 90℃加热5分钟,呈红色至紫色斑点.
(20)氢氧化钾: 检查香豆素,蒽醌甙及甙元
喷洒剂: 5~10%氢氧化钾的甲醇溶液.
于日光及紫外线荧光分析灯下检示斑点.
萜类,甾体
(21) 三氯化锑(Carr-Price试剂): 检查甾体,萜类,皂类.
喷洒剂: 25克三氯化锑溶于75克氯仿中(亦可以用氯仿或四氯化碳的饱和溶液). 喷洒后处理: 100℃加热5分钟,于紫外线荧光分析灯下检示荧光.
(22) 五氯化锑: 检查甾体,萜类,皂甙.
喷洒剂: 五氯化锑-氯仿或四氯化碳(1:4),用前新鲜配制.
喷洒后处理: 120℃加热至斑点出现,并于紫外线荧光分析灯下检示.
(23)香兰醛-硫酸: 检查高级醇类,酚类,甾体,萜类,芳香油.
喷洒剂: 1克香兰素溶于100毫升浓硫酸,或0.5克香兰醛溶于100毫升硫酸-乙醇(4:1)中.
喷洒后处理: 室温或120℃加热观察显色斑点.
(24) 4-二甲氨基苯甲醛,醋酸,磷酸(E.P.试剂): 检查? Azulene 及?前体 Proazulene.
喷洒剂: 0.25克4-二甲氨基苯甲醛,溶于50毫升醋酸5克85％磷酸和20毫升水的混合液中(棕色瓶中保存数月)
?:烃室温即成蓝紫色斑点,>前体于80℃加热10分钟出现蓝紫色斑点.
(25) 氯胺T－三氯醋酸: 检查强心甙.
喷洒剂: I. 3%氯仿T水溶液新鲜制备.
II. 25%三氯醋酸乙醇溶液(能保存数天).
10毫升I加40毫升II,用前混合.
喷洒后处理: 110℃加热7分钟,紫外线荧光分析灯下检示呈蓝色或黄色荧光.
(26) 亚硝酸基铁氰化钠-氢氧化钠(Legal试剂): 检查不饱和内酯;甲基酮或活性次甲基,常用于强心甙
喷洒剂: 1克亚硝基铁氰化钠溶于100毫升2N氢氧化钠-乙醇(1:1)的水溶液. 显红色或紫色斑点.
(27) 3,5-二硝基苯甲酸(Legal试剂): 检查强心甙,α,β-不饱和内酯.
喷洒剂: 1克3,5-二硝基苯甲酸溶于50毫升甲醇,加入1N氢氧化钾50毫升. 强心甙呈紫红色斑点.
糖类
(28) 邻苯二甲基苯胺: 检查还原糖.
喷洒剂: 0.93克苯氨,1.66克邻苯二甲酸溶于100毫升水饱和的正丁醇中. 喷洒后处理: 105℃加热10分钟.
(29) 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium chloride (T.T.C.)：检查还原糖及其他还原物质。
溶液I：4％（T.T.C.）甲醇溶液； 溶液II：1N氢氧化钠。
喷洒液：I，II，临用前等体积混合。
喷洒后处理：100℃加热5～10分钟，得红色斑点。
（30）Keller-Kiliani试剂：检查α－去氧糖，常用于强心甙。
试液：100毫升冰醋酸加三氯化铁试液0.5毫升混合均匀.
试样1毫克加试液2毫克溶解后,沿试官管壁滴入浓硫酸2毫升,接触面即显棕色,渐变浅绿,蓝色.最后冰醋酸层全部燃呈蓝色.
(31) 1,3-二羟基萘-磷酸: 检查糖类.
喷洒液: 0.2%1,3-二羟基萘(Naphthoresorcinol)乙醇溶液100毫升,与10毫升85%磷酸混合.
(32) 费林溶液(Fehling): 检查还原糖.
溶液I: 69.3克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中.
上述二溶液如不清可滤过.临用前等体积混合.
氨基酸
(33) 茚三酮: 检查氨基酸及氨基糖.
喷洒剂: 0.3克茚三酮溶于100毫升正丁醇,加入3毫升醋酸;或0.2克茚三酮溶于100毫升乙醇(或丙酮中).
喷洒后处理: 110℃加热至斑点出现.
(34) 吲哚醌: 检查氨基酸和一些肽.
喷洒剂: 0.2%吲哚醌(Isatin)丙酮溶液,含4%醋酸;或用100毫升1%吲哚醌丙酮溶液加10毫升醋酸.
喷洒后处理: 100~110℃加热10分钟.
(35) 1,2-萘醌-4-硫磺酸(Folin试剂): 检查氨基酸.
喷洒剂: 新鲜制备0.02克1,2-萘醌-4-磺酸钠,溶于100毫升5%碳酸钠中. 喷洒后处理: 室温放于,不同氨基酸出现不同颜色.
有机酸
(36) 酸碱指示剂: 检查有机酸.
喷洒剂: 0.05%溴酚蓝(或溴甲酚绿,或溴麝香草酚蓝)的乙醇溶液.
(37) 氧化还原显色剂: 检查有机酸.
喷洒剂: I. 0.075%溴甲酚绿及0.025%溴酚蓝的无水乙醇液.
II. 0.5%高锰酸钾及1%碳酸钠.10H2O的蒸馏水液.临用前,取I和II按1:1混合后喷酒.
喷酒后处理: 稳定时间为5~10分钟.对不同的有机酸在纸谱上呈现不同颜色.
(38) ??? (Acridine): 检查酸.
喷洒剂: 0.005%的??乙醇溶剂.
紫外线分析灯下呈黄色荧光.
(39) 芳香胺-还原糖: 检查酸.
喷洒剂: 芳香胺(如苯氨5克)和还原糖(如木质糖5克)溶于50%含水乙醇中. 喷洒后处理: 125~130℃加热出现棕色斑点
一、通用试剂
1、碘试剂
检查一般有机化合物。
（1）碘蒸气 预先将盛有碘结晶的小杯置于密闭的玻璃容器内，使容器空间被碘蒸气饱和，将薄层置于容器内数分钟即显棕色斑点。有时，于容器中加放一小杯水，增加容器内的湿度，可提高显色的灵敏度。
（2）0.5％碘的氯仿溶液 喷洒试剂，置空气中待过量的碘挥发后，喷1％淀粉溶液，斑点由棕色转为蓝色。
2、硫酸试剂
检查一般有机化合物。
5％硫酸乙醇溶液作为色谱显色剂用。喷洒后，置空气中干燥15min，100℃烤至斑点呈色（不同化合物呈不同颜色）。
3、重铬酸钾—硫酸试剂
检查一般有机化合物。
5g重铬酸钾溶于l00ml40％硫酸中。喷该试剂后，150℃加热至斑点出现(不同化合物呈不同颜色)。
4、磷钼酸试剂
检查还原性成分。
5％磷钼酸乙醇溶液。喷洒后，120℃加热至呈蓝色斑点。
5、磷钨酸试剂
检查还原性成分
20％磷钨酸乙醇溶液。喷洒后，120℃烘烤，还原性物质呈蓝色斑点。
6、硝酸银—氢氧化铵试剂
检查还原性成分。
溶液I：0.1mol／L硝酸银溶液。溶液Ⅱ：10％氢氧化铵溶液。临用前溶液I和Ⅱ以
1︰5混合。喷洒后105℃加热5~l0min，至深黑色斑点出现。
7、中性高锰酸钾试剂
检查易还原性成分。
0.05％高锰酸钾溶液。喷洒后粉红色背景上显黄色斑点。
8、碱性高锰酸钾试剂
检查还原性成分。
溶液I：1％高锰酸钾溶液。溶液Ⅱ：5％碳酸钠溶液。溶液I和Ⅱ等量混合使用，喷洒后，粉红背景上显黄色斑点。
9、四唑蓝试剂
检查还原性成分。
溶液I：0．5％四唑蓝甲醇溶液。溶液Ⅱ：25％氢氧化钠溶液。临用前两液等量混合。喷洒后，微热或室温放置显紫色斑点。
10、荧光素—溴试剂
检查不饱和化合物。
溶液I：0.1g荧光素溶于l00ml乙醇中。溶液Ⅱ：5g溴溶于l00ml四氯化碳中。先喷洒溶液I，然后将薄层板放入盛有溶液Ⅱ的缸内，黄色斑点出现后，于紫外光灯下检视，红色底板上显黄色荧光斑点。
11．荧光显色试剂
检查一般有机化合物。
（1）0.2％2，7--'氯荧光素乙醇溶液。
（2）0.01％荧光素乙醇溶液。
（3）0.1％桑色素乙醇溶液。
（4）0.05％罗丹明B乙醇溶液。
喷洒任一溶液，不同的化合物在荧光背景上可显黑色或其它荧光斑点。
二、苷类鉴定试剂
1、糖鉴定试剂
（1） －萘酚－硫酸试剂
检查还原糖。
①溶液I：10％ —萘酚乙醇溶液。溶液Ⅱ：硫酸。取lml样品的稀乙醇溶液或水溶液，加入溶液I 2～3滴，混匀，沿试管壁缓缓加入少量溶液Ⅱ，二液面交
界处产生紫红色环为阳性反应。
②15％ —萘酚乙醇溶液21m1、硫酸13ml、乙醇87ml及水8ml混匀后使用。喷洒于薄层板上，100℃烤3～6min，多数糖显蓝色，鼠李糖显橙色，所显颜色于室温可稳定2天～3天。
（2）斐林试剂
检查还原糖。 ‘
溶液I：6.93g结晶硫酸铜溶于l00ml水中。溶液Ⅱ：34.6g酒石酸钾钠、10g氢氧化钠溶于l00ml水中。取lml样品热水提取液，加入4～5滴用时配制的溶液Ⅰ、Ⅱ等量混合液，在沸水浴中加热数分钟，产生砖红色沉淀为阳性反应。如检查多糖和甙，取lml样品水提液，加入lmll0％盐酸溶液，在沸水浴上加热l0min，过滤，再用10％氢氧化钠溶液调至中性，按上述方法检查还原糖。
（3）氨性硝酸银试剂
检查还原糖。
硝酸银1g，加水20ml溶解，小心滴加适量氨水，边加边搅拌，至开始产生的沉淀将近全部溶解为止，过滤。取lml样品的水溶液，加入lml试剂，混匀后，40℃微热数分钟，管壁析出银镜或产生黑色沉淀为阳性反应。本试剂也可作为色谱显色剂，喷洒后于110℃加热数分钟，显棕黑色斑点为阳性反应。还原性物质如醛类、邻二酚类等有干扰。
（4）茴香醛－硫酸试剂
检查糖类化合物。
硫酸lml加到含茴香醛0.5ml的乙酸溶液50ml中，需临用前配制。喷洒于薄层板上，105℃加热至显示色斑，不同糖显不同颜色。
（5）苯胺－邻苯二甲酸试剂
检查糖类化合物。
苯胺0.93g和邻苯二甲酸1.66g溶于100ml水饱和的正丁醇中。作色谱显色剂用。喷后105℃烤5min，显红棕色斑点。
（6）l,3－二'羟基萘酚－磷酸试剂
检查酮糖、醛糖。
0.2％1，3--'二羟基萘酚乙醇溶液50ml与85％磷酸50ml混合均匀后使用。喷后105℃烤5min～10min，酮糖呈红色，醛糖显淡蓝色。
（7）苯胺－二苯胺－磷酸试剂
检查糖类化合物。
苯胺4ml、二苯胺4g及85％磷酸20ml溶于丙酮200ml中。喷洒于薄层板上，85℃加热10min，不同糖显不同颜色。
（8）2，3，5－三苯基氯化四氮唑(T．T．C)试剂
检查还原糖。
溶液Ⅰ：4％T．T．C甲醇溶液。溶液Ⅱ：4％氢氧化钠溶液。临用时将溶液Ⅰ和Ⅱ等体积混合。喷洒后，100℃加热5～10min，显红色斑点为阳性反应(醛类无干扰)。
（9）三氯化铁－冰醋酸(K．K)试剂
检查 －去氧糖，常用于强心甙。
溶液I：1％三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至l00ml。溶液Ⅱ：硫酸。取样品乙醇提取液lml，置试管中，水浴上蒸去乙醇，残渣用0.5ml溶液I溶解，沿试管壁缓缓加入溶液Ⅱlml，静置分层，上层渐显蓝色，下层显红色或棕色为阳性反应(其颜色随苷元羟基和双键的位置和个数不同而不同)。
（10）占吨氢醇试剂
检查 －去氧糖(常用于强心甙)。
10mg占吨氢醇溶于100ml冰醋酸中，再加入lml硫酸混合。取lml样品，加入试剂lml，置水浴上加热30min，显红色为阳性反应。
（11）Gregg-Gisvold试剂
检查2．6－去氧糖。
溶液I：10％三氯化铁溶液。溶液Ⅱ：1％盐酸甲醇溶液(97.2ml甲醇中含2．8ml盐酸)。0.5ml溶液I与100ml溶液Ⅱ混合。将样品的乙醇溶液点于滤纸片上，晾干后，喷洒上述混合试剂，110℃加热5min，显蓝色为阳性反应。
（12）3，5－二氨基苯甲酸－磷酸试剂
检查2－去氧糖。
3，5－二氨基苯甲酸二盐酸盐1g溶于80％磷酸25ml，加水稀释至60ml。喷洒后，100℃加热15min，2－去氧糖在日光下显棕色，在紫外光下显黄绿色荧光。
（13）对硝基苯胺－过碘酸试剂
检查去氧糖。
溶液I：饱和偏高碘酸溶液1份加水2份混匀。溶液Ⅱ：1％对硝基苯胺乙醇溶液4份与盐酸1份混合。先喷溶液I，放置10min，再喷溶液Ⅱ，去氧糖显黄色，紫外光下显强荧光，再喷5％氢氧化钠甲醇溶液，颜色转绿，乙二醇同样显色。
2、酚类鉴定试剂
（1）三氯化铁试剂
检查酚类化合物、鞣质。
1～5％三氯化铁水溶液或乙醇溶液，加盐酸酸化。取1m1样品的乙醇溶液，加入试剂1～2滴，显绿、蓝绿或暗紫色为阳性反应。作色谱显色剂用，喷洒后，显绿或蓝色斑点为阳性反应。 ·
（2）4－氨基安替匹林－铁氰化钾(Emerson)试剂
检查酚羟基对位无取代基的化合物。
溶液I：2％4－氨基安替匹林乙醇溶液。溶液Ⅱ：8％铁氰化钾溶液。作色谱显色剂用，先喷洒溶液I，再喷洒溶液Ⅱ，用氨气熏，显橙红或深红色斑点为阳性反应。
（3）Gibbs试剂
检查酚羟基对位无取代基的化合物。
溶液I：0.5％2，6－溴(氯)苯醌氯亚胺的乙醇溶液。溶液Ⅱ：1％氢氧化钾乙醇溶液。取lml样品的乙醇溶液，滴加溶液Ⅱ，使pH9～10，再加入1滴～2滴溶液I，显深蓝色为阳性反应。
（4）铁氰化钾－三氯化铁试剂
检查酚类、芳香胺类及还原性物质。
溶液I：1％铁氰化钾溶液。溶液Ⅱ：2％三氯化铁溶液。临用前等体积混合。喷
洒后酚性成分呈蓝色斑点，再喷20％盐酸，能使颜色加深。纸色谱可用稀盐酸洗去喷洒液。
（5）重氮化(Pauly)试剂
检查酚羟基对位无取代基化合物。
溶液I：0.35g对硝基苯胺溶于5ml盐酸中，加水稀释至50ml。溶液Ⅱ：5g亚硝酸钠溶于70ml水中。取1m1样品的乙醇溶液，加入1m13％碳酸钠溶液，在沸水浴中加热3min，再在冰水浴中冷却后，加入1～2滴溶液Ⅰ与Ⅱ的混合液(临用时，在冰水浴中等量混合)，显红色为阳性反应。作色谱显色剂用，将溶液I与Ⅱ各l0ml混合，再加20ml 1％碳酸钠溶液(均临用时在冰水浴中混合)，喷洒后，显黄、红、紫等色斑点为阳性反应。
（6）牢固蓝B盐试剂
检查酚类化合物。
溶液I：新配的0.5％牢固蓝B盐的溶液。溶液Ⅱ：0.5％氢氧化钠溶液。先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ，呈棕、紫、或绿色者为阳性反应。能偶合的芳香胺类有干扰。
3．黄酮类鉴定试剂
（1）盐酸－镁粉试剂
检查黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）类化合物。
取lml样品的乙醇溶液，加入数毫克镁粉，滴加数滴盐酸，必要时水浴上微热，显红－紫色为阳性反应。
（2）Shinoda试剂
采用含2％锌粉（W／W）－硅胶薄层板，展层后喷20％盐酸溶液，黄酮（醇）类呈红紫色。
（3）三氯化铝试剂
检查具有邻二酚羟基或3－羟基、4－酮基或5－羟基、4－酮基的黄酮类化合物。
1％三氯化铝乙醇溶液或5％三氯化铝乙醇溶液。喷洒前、后将薄层板置日光下和紫外光灯下观察，呈黄色或黄绿色荧光为阳性反应。也可在滤纸上和试管中进行。
（4）中性醋酸铅或碱式醋酸铅试剂
检查具邻二酚羟基或酚羟基的黄酮化合物。
饱和中性醋酸铅或碱式醋酸铅溶液。取1ml样品的乙醇溶液，加1～2滴试剂，产生黄色沉淀。
（5）锆－柠檬酸试剂
检查具3－羟基或5－羟基的黄酮类化合物。
溶液I：2％二氯氧锆甲醇溶液。溶液Ⅱ：2％柠檬酸甲醇溶液。取1mg样品，用甲醇溶解，加入溶液I lml，呈鲜黄色示有3－羟基或5－羟基；再加入溶液Ⅱ1m1，黄色不褪，示有3－羟基；黄色褪去，加水稀释后变为无色，示无3－羟基，但有5－羟基。也可在滤纸上进行，得到的锆盐络合物多呈黄绿色，并具荧光。
（6）氨性氯化锶试剂
检查具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物。
溶液I：1％氯化锶甲醇溶液。溶液Ⅱ：氨蒸气饱和的甲醇溶液。取1mg样品的甲醇溶液，加入3滴溶液I，再加3滴溶液Ⅱ，产生绿－棕－黑色沉淀为阳性反应。
（7）醋酸镁试剂
检查黄酮类、二氢黄酮类化合物，及羟基蒽醌类衍生物。
1％醋酸镁甲醇溶液。在滤纸或薄层板上，点1滴样品醇溶液，挥去醇后，点l滴试剂于样品斑点边缘，加热干燥，于紫外灯下观察，黄酮类显黄色荧光，二氢黄酮类呈天蓝色荧光。显橙红色为大黄素型蒽醌，显紫色为茜草型蒽醌。
（8）硼氢化钾试剂
检查二氢黄酮类化合物。
2％四氢硼钾的甲醇溶液。取样品1～2mg溶于甲醇中，加等量试剂lml后，加数滴盐酸，呈红-紫红色为阳性反应。薄层色谱上喷试剂，5min后放人盐酸蒸气槽内呈色。
4．醌类化合物鉴定试剂
（1）Borntrager试剂
检查羟基蒽醌衍生物。
2％氢氧化钠或2％碳酸钠溶液(或甲醇溶液)。取lml样品的乙醇溶液，加lml试剂，呈红色为阳性反应。在薄层色谱上喷洒试剂，显橙黄或红色斑点。黄酮类化合物遇碱也能反应生成黄、橙、红色等。
（2）菲格尔(Feigl)试剂
检查醌类衍生物。
溶液I：25％碳酸钠溶液。溶液Ⅱ：4％甲醛的苯溶液。溶液Ⅲ：5％邻二硝基苯的苯溶液，取1滴样品的苯溶液，加入上述3种试液各1滴，混匀，置水浴上加热l～4min，呈显著的紫色为阳性反应。
（3）硼氢化钠－二甲基甲酰胺试剂
检查蒽醌及其衍生物。
20g硼氢化钠溶于100ml二甲基甲酰胺中。作色谱显色剂用。喷洒试剂后，于紫外光灯下观察，显强的黄、绿或蓝色荧光为阳性反应。
（4）硼酸试剂
检查羟基蒽醌类化合物。
1％硼酸溶液。作色谱显色剂用，喷洒后，置紫外光灯下观察，呈黄、橙、红色荧光为阳性反应。
（5）对亚硝基二甲基苯胺试剂
检查蒽酮类衍生物。
0.1％对亚硝基二甲基苯胺的吡啶溶液。取1m1样品的乙醇溶液，置水浴上蒸干，残渣用吡啶溶解，再滴试剂数滴，显紫色或绿色为阳性反应。
（6）活性次甲基试剂
检查苯醌及萘醌类衍生物。
lg活性次甲基试剂(例如丙二酸酯、乙酰乙酸酯等)溶于30ml氨与乙醇的等体积混合溶液中。取5ml样品的乙醇溶液，加入3ml试剂，显蓝、紫或红色为阳性反应，萘醌分子中具羟基，可使反应减慢或不起反应。
5．内酯、香豆素类鉴定试剂
（1）开环－闭环试剂
检查内酯环。
溶液I：1％氢氧化钠溶液。溶液Ⅱ：2％盐酸溶液。取lml样品的乙醇溶液，加2ml溶液I，置沸水浴上加热3～4min，溶液比未加热时澄清。再加溶液Ⅱ酸化(pH2)，放置，溶液又变为混浊。酚性化合物和有机酸有干扰，但可用下法予以区别，取样品乙醇溶液数毫升，置水浴上蒸干溶剂，用乙酸乙酯溶解后置分液漏斗内，用5％氢氧化钠溶液萃取酚性及有机酸成分，乙酸乙酯溶液用水洗至中性后按上法检测。
（2）异羟肟酸铁试剂
检查内酯环。
溶液I：7％盐酸羟胺甲醇溶液(新鲜配制)。溶液Ⅱ：10％氢氧化钾甲醇溶液。溶液Ⅲ：1％三氯化铁甲醇溶液。取1m1样品的甲醇溶液，加入溶液I、Ⅱ各5滴，置沸水浴上加热3min～4min，冷却后，用稀盐酸调至pH3～4，再加入溶液Ⅲ1滴～2滴，显橙红或紫红色为阳性反应。作色谱显色用，将溶液I，Ⅱ等量混合，喷洒后空气中干燥10min，再喷溶于1％盐酸中的三氯化铁溶液，显橙红或紫红色斑点。
（3）稀氢氧化钠溶液 将检样点于滤纸片或薄层上，试样边缘点上碱液，晾干，置紫外灯光下观察，多数羟基香豆素有强的荧光。
配合酚类鉴定试剂的检查，以确定游离酚羟基的存在及取代位置。
6，强心甙鉴定试剂
（1）碱性3，5－二硝基苯甲酸(Kedde)试剂
检查强心甙的 、 －不饱和内酯环。
2％3，5－二硝基苯甲酸甲醇溶液与5％氢氧化钾溶液，用前按1︰l混合。取1m1样品的甲醇溶液，加入3～4滴试剂，显紫红色为阳性反应，几分钟后褪色。也适用于薄层色谱。
（2）碱性苦味酸(Baljet)试剂
检查强心甙的 、 －不饱和内酯环。
9ml 1％苦味酸乙醇溶液与1ml l0％氢氧化钠溶液用前配制混合。用1m1样品的乙醇溶液，加入1滴试剂，放置15min左右，显橙红色或红色为阳性反应。
（3）碱性亚硝酰铁氰化钠（Legal）试剂
检查不饱和内酯、甲基酮或活性亚甲基（常用于强心甙）。
溶液I：0.5％亚硝酰铁氰化钠乙醇溶液。溶液Ⅱ：10％氢氧化钠溶液。取1 m1样品的甲醇溶液，置水浴上蒸干，冷却后加lml吡啶溶解残渣，加入4～5滴溶液I和1～2滴溶液Ⅱ，溶液显红色并逐渐消失为阳性反应。用于薄层色谱检查，将1g亚硝酰铁氰化钠溶于10％氢氧化钠－乙醇（1︰1）的溶液中，喷洒后，显红色或紫色斑点。
（4）磷酸－溴试剂
检查强心甙。
溶液I：10％磷酸乙醇溶液。溶液Ⅱ：溴化钾饱和溶液－溴酸钾饱和溶液－25％盐酸溶液(1﹕l﹕1)。用于薄层色谱检查，取溶液I喷洒后，125℃加热12min，紫外光灯下观察。再将薄层板烤热，趁热喷溶液Ⅱ，不同的强心苷显示不同的颜色斑点。
（5）醋苷－硫酸（Liebermann-Burchard）试剂
检查甾体、甾体皂苷、三萜类及强心苷。
取0.1～0.2mg样品，置于白瓷反应板上，加入0.3ml醋酐，使样品溶解，沿边缘滴入硫酸，出现红－紫－蓝－绿色，最后褪色为甾体皂甙，三萜皂甙只能呈黄－红－紫等。
（6）三氯醋酸—氯胺T试剂
检查洋地黄毒甙元衍生物和2，6－去氧糖苷。
25％三氯醋酸乙醇（氯仿）溶液4ml与3％氯胺T溶液1ml混匀。喷洒后，100℃加热数分钟，于紫外光灯下观察。洋地黄毒甙元的苷类显黄色荧光，羟基洋地黄毒苷元的甙类显亮蓝色荧光，异羟基洋地黄毒苷元的苷类呈灰蓝色荧光。洋地黄毒糖的苷（2，6－去氧糖苷）在可见光下呈暗蓝色。
强心苷的鉴定应由苷元（甾体母核和不饱和五元内酯）和2－去氧糖两部分共同证实。
7、甾体、三萜及其苷的鉴定试剂
（1）三氯化锑试剂
检查甾体、萜类、皂苷。
25g三氯化锑溶于75ml氯仿中。喷后100℃加热5min，不同的皂苷元在可见光或紫外光灯下显不同颜色。
（2）三氯醋酸试剂
检查皂甙。
3.3g三氯醋酸溶于10ml氯仿，再加入1～2滴30％过氧化氢溶液。将样品的氯仿溶液滴在滤纸上，加试剂l滴，加热至60℃，生成红色－紫色为甾体皂甙；加热到100℃始见显色为三萜皂甙o
（3）硫酸：甲醇（1︰1）试剂 喷后加热，不同皂苷元可显红褐色、紫色、黄色或黑色。所显颜色与温度无关。
（4）氯磺酸：乙酸（1︰1）试剂 喷后130℃加热5min，各种皂苷元可显天蓝色、
紫色、粉红色、淡棕色等，在紫外光灯下也显不同的荧光。
（5）香草醛－硫酸试剂
检查高级醇类、酚类、甾体、萜类、芳香油。
1g香草醛溶于100ml硫酸中，或0.5g香草醛溶于100ml硫酸－乙醇(4﹕1)中。喷洒后，室温、120℃加热观察，显示红、蓝、紫等各种颜色斑点。
8．氰苷鉴定试剂
（1）苦味酸试纸 取适当大小的滤纸，浸入苦味酸饱和溶液中，浸透后取出，晾干。再浸入10％碳酸钠溶液内，迅速取出，晾干即得。取样品粉末0.5g置试管中，加水混合均匀，加入稀硫酸数滴。在试管口夹放一条苦味酸试纸（试纸不能接触到药液），塞紧。将试管在沸水浴中加热数分钟，试纸变成红色，表明含氰苷。
（2）普鲁士蓝试验
溶液I：10％硫酸亚铁溶液（用前配制）。溶液Ⅱ：5％三氯化铁溶液。取样品粉末0.5g置试管中，加水湿润，立即用经10％氢氧化钾溶液湿润的滤纸将试管口包紧，于热水浴上加热10min后，在滤纸上加溶液I、稀盐酸和溶液Ⅱ各1滴，滤纸显蓝色为阳性。
三、挥发油鉴定试剂
1、茴香醛－硫酸试剂
硫酸1m1加至50ml冰醋酸中，冷却后加入茴香醛0．5ml(必须临用时配制)。喷洒后,105℃加热，挥发油中各成分显不同颜色。
2、碘化钾－冰醋酸－淀粉试剂
检查过氧化物。
溶液I：4％碘化钾溶液10ml与冰醋酸40ml混和，再加锌粉一小勺过滤。溶液Ⅱ：新制的1%淀粉溶液。先喷溶液I，5min后大量喷溶液Ⅱ，直至薄层透明为止。显蓝色斑点为过氧化物。
3、2，4-二硝基苯肼试剂
lg 2，4-二硝基苯肼、36％盐酸l0ml溶于1000ml乙醇中。喷洒后，显黄红色斑点为阳性反应。
4、硝酸铈试剂
检查醇类化合物。
硝酸铈6g溶于2.5％100 ml硝酸溶液中，喷洒后，黄色背景上显棕色斑点为阳性反应。
5、钒酸铵（钠）－8－羟基喹啉试剂
检查醇类化合物
1％钒酸铵（钠）溶液1ml和8－羟基喹啉的6％乙醇溶液1ml混和，用30ml苯萃取，分取灰蓝色的苯溶液为试剂。喷洒后，微加热，灰蓝色背景上显淡红色斑点为阳性反应。
挥发油组成复杂，需依据结构特征如醇、醛、酮、酚、醚、酯、内酯等选择鉴定试剂。
四、生物碱鉴定试剂
1、改良碘化铋钾试剂
为生物碱通用显色剂。
溶液I：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。溶液Ⅱ：8g碘化钾溶于20ml水中。溶液I和溶液Ⅱ等量混和，于棕色瓶中可以保存较长时间。目前市场上有碘化铋钾试剂可供直接配置：7.3g碘化铋钾、10ml冰醋酸加水60ml。取
lml样品的稀酸溶液，加1滴～2滴试剂，产生桔红色浑浊或沉淀为阳性反应。作为薄层色谱显色剂，取混和液1ml、醋酸2ml、水10ml混和即得。喷洒后呈桔红色斑点为阳性反应。
2、碘化汞钾
为生物碱通用沉淀试剂。
1.36g氯化汞和5g碘化钾各溶于20 ml水中，将氯化汞溶液慢慢加入碘化钾溶液，混合后，加水至100ml。取lml样品的稀酸溶液，加1～2滴试剂，产生类白色沉淀为阳性反应。
3、硅钨酸试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
1g硅钨酸溶于20 ml水中，加10％盐酸使成pH2左右。取1 ml样品的稀酸溶液，加入1～2滴试剂，产生白色至褐色沉淀为阳性反应。
4、碘化铂钾（碘铂酸）试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
10％六氯铂酸3ml和97ml水混合，加6％碘化钾溶液100ml，混合均匀（临用前配制）。取1 ml样品稀酸溶液，加l～2滴试剂，不同生物碱显不同颜色沉淀。
5、碘—碘化钾试剂
为生物碱沉淀剂。
1g碘及10g碘化钾溶于50ml水中，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml。取1 ml样品稀酸溶液，加入试剂1～2滴，产生棕色或褐色沉淀为正反应。
6、苦味酸试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
苦味酸1g溶于100ml水中。取1 ml样品中性溶液，加入试剂1～2滴，产生黄色晶形沉淀。
7、鞣酸试剂
为生物碱通用沉淀试剂。
鞣酸1g用1ml乙醇溶解后，加水至10 ml 。取lml样品稀酸溶液，加入试剂1～2滴产生白色至棕黄色沉淀。
8、硫酸铈—硫酸试剂
检查生物碱及含碘化合物。
0.1g硫酸铈悬浮于4ml水中，加三氯醋酸1g，加热至沸，放冷，逐滴加入硫酸直到浑浊消失为止。喷洒试剂后，110℃加热数分钟，呈色（不同生物碱显不同的颜色）。
9、钒酸钠—硫酸试剂
检查生物碱。
1g钒酸钠溶于100ml硫酸中。喷洒试剂后，不同生物碱产生不同颜色，如莨菪碱显红色，马钱子碱显血红色，士的宁显蓝紫色，奎宁显淡橙色，吗啡显棕色等。
10、雷氏铵盐试剂
检查水溶性生物碱。
2％硫氰化铬铵溶液（临用时配制）。取1ml样品的弱酸性水溶液（pH5～6），加入1～2滴试剂，产生暗红色沉淀为阳性反应。
11、Ehrlich试剂
检查吡咯、吲哚类生物碱。
1g对二甲氨基苯甲醛溶于25ml 36％盐酸和75ml甲醇混合溶液中。取1ml样品的稀酸溶液，加人数滴试剂，加热，显紫红或青紫色为阳性反应。
五、鞣质类鉴定试剂
1、氯化钠—明胶试剂
检查鞣质。
1g明胶溶于50ml水中（60℃水浴中加热），加入10g氯化钠，使完全溶解后，用水稀释到100ml。取1m1样品的60℃水浸液，加入1～2滴试剂，产生白色浑浊或沉淀
2、对甲苯磺酸试剂。
检查鞣质、甾体、黄酮类。
20％对甲苯磺酸氯仿溶液。薄层色谱上喷洒试剂后，100℃加热5min显出不同颜色的斑点。
3、新鲜石灰水试剂
检查鞣质。
取1ml样品的热水提取溶液，加新鲜石灰水上清溶液数滴，产生青灰色沉淀为可水解鞣质，产生棕或棕红色沉淀为缩合鞣质。
六、氨基酸、多肽、蛋白质鉴定试剂
1、茚三酮试剂
检查2－氨基酸及含有2-氨基酸的肽类、氨基糖和蛋白质。
0.2g茚三酮溶于l00ml正丁醇中，加冰醋酸3ml。或者，0.2g茚三酮溶于l00ml乙醇或丙酮中。取1ml样品的冷水浸液，加入2～3滴试剂，沸水浴上加热5min放冷，显蓝色或蓝紫色。
2、吲哚醌试剂
检查氨基酸、多肽。
吲哚醌1g溶于100ml丙酮中，加入10ml醋酸。作薄层色谱显色剂，喷洒试剂后，100～110℃加热l0min，显蓝、红、桃红或棕色斑点。
3、1，2-萘醌－4－磺酸钠试剂
检查氨基酸。
0.02g l，2－萘醌－4－磺酸钠溶于l00ml5％碳酸钠溶液中，新鲜配制。喷洒试剂后，室温晾干，不同氨基酸出现不同的颜色。
4、双缩脲试剂
检查多肽、蛋白质。
七、有机酸鉴定试剂
1、溴酚蓝试剂
检查有机酸。
0.1％溴酚蓝的乙醇溶液。作薄层色谱显色剂，喷洒后，蓝色背景上呈黄色斑点。如不明显，可再喷氨水，然后暴露在盐酸气体中，则为黄色背景上呈蓝色斑点。
2、芳香胺—还原糖试剂
检查有机酸。
5g苯胺和5g木糖溶于100ml 50％乙醇中。作薄层色谱显色剂，喷洒试剂后，
125～130℃加热至出现棕色斑点。
3、吖啶试剂
检查有机酸。
0.005％的吖啶乙醇溶液。喷洒试剂后，于紫外光灯下观察，显黄色荧光。