免疫学实验
抗血清的制备及其效价测定
班级：生物技术1401
小组：11
姓名：
2016年11
月
抗血清的制备及免疫小鼠效价检测
摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价
前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：
实验主线：中程免疫
3次间隔一周
抗血清的采集与分离
多克隆抗体
实验材料：间接法ELISA 测定抗血清的效
包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠
酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱
实验内容与方法：
一．动物的免疫：
1.1实验动物的选择
选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；
常用青壮年期的雄性动物。
小鼠：Balb/C品系，6~8周龄，体重18~25g。
家兔：要求健康，大耳白品系，6月龄以上，体重2~2.5kg；
选用小白鼠（每小组一只），家兔（每班一只）。分为对照组、实验组。免疫前用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记（3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸酒精饱和液）。
1.2免疫
注射抗原为可溶性抗原牛血清白蛋白，家兔每次免疫剂量100~1000μg每次不超过2mL，小鼠每次免疫剂量1~10μg每次不超过0.5mL。
本次试验采用中程免疫的方法，间隔一周：
10.10——首次免疫
10.18——二免与等体积的福氏完全佐剂混合
10.24——二免与等体积的福氏完全佐剂混合
小鼠采取腹腔注射方法，家兔采取肌肉注射或耳静脉注射方法。
二．抗血清的制备：
取6号家兔，6.1号小鼠。
2.1老鼠采用断尾取血
将实验小白鼠放入有孔离心管，并使其尾巴露出孔外之后，采用断尾的方法，用手术刀剪断小鼠尾巴末端，用手捋动整条尾巴，引导血液顺利进入离心管中，取完血液做好标记，将其放入离心机中离心20分钟，吸取上清液即为抗血清。
2.2家兔采用颈动脉放血
家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml 无菌空三角瓶。（注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！）
2.3抗血清的分离，保存
斜置装血液的三角瓶0.5-1h；用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为0.1%，注意防护！！），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。
三．抗体效价的检测：
酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA 过程包括抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原),再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，
再与该酶的底物反应
生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。
3.1实验材料
牛血清白蛋白（BSA)——抗原，10μg/ml溶液，包被液配制
鼠抗BSA——待测抗体样品，用PBST 从1：1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度
HRP 标记羊抗小鼠IgG ——二抗（按说明书稀释使用，用PBST 稀释。每班8个板，480孔，总量48000μl，实际5.5μl 到55ml）
包被缓冲液：0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO31.59克，NaHCO32.93克，加水900ml，调pH，再定容至1L）
0.01M PBS 溶液（NaCl8.5g, Na2HPO4.12H2O 2.85g 或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g，KH2PO40.27g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4）
PBST 洗涤液：含0.05%Tween 20的0. 0001M 的PBS（pH 7.4）底物溶液：TMB（3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺）
2M H2SO4（市售浓硫酸为18.4M，根据要配制的2M 硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）
酶标板，酶标仪，保鲜膜，排枪
3.2实验步骤
1). 加抗原：取酶标板，加入100μl/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加）
2) .包被抗原：保鲜膜包好，37℃1h 或4℃过夜；抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上
3) .封闭：甩干后以PBST （200μl/孔）洗涤3次，3min/次；每孔加入100μl（W/V)脱脂奶粉溶液（用PBS 溶液配制）；保鲜膜包好，37℃，
2h 5%
4) .加待测血清：取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体；以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次；标记各孔，加入相应稀释度的抗体100μl/孔（用PBST 稀释，按示意图用单枪加）；37℃，保鲜膜包好，60min
5) .加二抗：甩干孔内液体；以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次；各孔加入酶标二抗100μl/孔（用PBST 稀释10000X,全班每8板需48ml，实配55ml）37℃，保鲜膜包好，45min
6).显色：甩干孔内液体；以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次；加入TMB 底物溶液50μL/孔；避光显色10min(抽屉中），然后每孔加入50μl的2M 硫酸终止反应。
结果与分析：
阴性——目测无色，在酶标仪上读数OD450nm 值小于0.1（第10列）；
阳性——目测黄色，OD450nm值3个重复的平均值大于0.2，且为阴性对照OD 值的2.0倍。
对照成立，以呈阳性反应孔的抗体的最高稀释倍数作为抗体的效价：
6.1号小鼠——待测鼠抗BSA 抗体的效价是1：400；
6号家兔——待测兔抗BSA 抗体的效价是1：64000。
讨论：
用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，引起
免疫应答，形成浆细胞，并分泌抗体。经三次免疫，血清中的抗体量达到要求浓
度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。得出待测抗体效价：待测6号鼠抗BSA 抗体的效价是1：400；待测6号兔抗BSA 抗体的效价是1：64000。另外通过对比得出，抗体效价可能与保存时间有关。参考文献
免疫学实验
抗血清的制备及其效价测定
班级：生物技术1401
小组：11
姓名：
2016年11
月
抗血清的制备及免疫小鼠效价检测
摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价
前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：
实验主线：中程免疫
3次间隔一周
抗血清的采集与分离
多克隆抗体
实验材料：间接法ELISA 测定抗血清的效
包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠
酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱
实验内容与方法：
一．动物的免疫：
1.1实验动物的选择
选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；
常用青壮年期的雄性动物。
小鼠：Balb/C品系，6~8周龄，体重18~25g。
家兔：要求健康，大耳白品系，6月龄以上，体重2~2.5kg；
选用小白鼠（每小组一只），家兔（每班一只）。分为对照组、实验组。免疫前用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记（3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸酒精饱和液）。
1.2免疫
注射抗原为可溶性抗原牛血清白蛋白，家兔每次免疫剂量100~1000μg每次不超过2mL，小鼠每次免疫剂量1~10μg每次不超过0.5mL。
本次试验采用中程免疫的方法，间隔一周：
10.10——首次免疫
10.18——二免与等体积的福氏完全佐剂混合
10.24——二免与等体积的福氏完全佐剂混合
小鼠采取腹腔注射方法，家兔采取肌肉注射或耳静脉注射方法。
二．抗血清的制备：
取6号家兔，6.1号小鼠。
2.1老鼠采用断尾取血
将实验小白鼠放入有孔离心管，并使其尾巴露出孔外之后，采用断尾的方法，用手术刀剪断小鼠尾巴末端，用手捋动整条尾巴，引导血液顺利进入离心管中，取完血液做好标记，将其放入离心机中离心20分钟，吸取上清液即为抗血清。
2.2家兔采用颈动脉放血
家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml 无菌空三角瓶。（注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！）
2.3抗血清的分离，保存
斜置装血液的三角瓶0.5-1h；用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为0.1%，注意防护！！），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。
三．抗体效价的检测：
酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA 过程包括抗原(抗体)包被在固相载体上，加待测抗体(抗原),再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，
再与该酶的底物反应
生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。
3.1实验材料
牛血清白蛋白（BSA)——抗原，10μg/ml溶液，包被液配制
鼠抗BSA——待测抗体样品，用PBST 从1：1000开始倍比稀释，连续稀释8个稀释度
HRP 标记羊抗小鼠IgG ——二抗（按说明书稀释使用，用PBST 稀释。每班8个板，480孔，总量48000μl，实际5.5μl 到55ml）
包被缓冲液：0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO31.59克，NaHCO32.93克，加水900ml，调pH，再定容至1L）
0.01M PBS 溶液（NaCl8.5g, Na2HPO4.12H2O 2.85g 或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.2g，KH2PO40.27g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4）
PBST 洗涤液：含0.05%Tween 20的0. 0001M 的PBS（pH 7.4）底物溶液：TMB（3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺）
2M H2SO4（市售浓硫酸为18.4M，根据要配制的2M 硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）
酶标板，酶标仪，保鲜膜，排枪
3.2实验步骤
1). 加抗原：取酶标板，加入100μl/孔的抗原溶液（用包被缓冲液稀释，用排枪加）
2) .包被抗原：保鲜膜包好，37℃1h 或4℃过夜；抗原分子通过疏水作用力结合到96微孔板上
3) .封闭：甩干后以PBST （200μl/孔）洗涤3次，3min/次；每孔加入100μl（W/V)脱脂奶粉溶液（用PBS 溶液配制）；保鲜膜包好，37℃，
2h 5%
4) .加待测血清：取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内液体；以PBST（200μl/孔）洗涤3次，3min/次；标记各孔，加入相应稀释度的抗体100μl/孔（用PBST 稀释，按示意图用单枪加）；37℃，保鲜膜包好，60min
5) .加二抗：甩干孔内液体；以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次；各孔加入酶标二抗100μl/孔（用PBST 稀释10000X,全班每8板需48ml，实配55ml）37℃，保鲜膜包好，45min
6).显色：甩干孔内液体；以PBST（200μl/孔）洗涤4次，3min/次；加入TMB 底物溶液50μL/孔；避光显色10min(抽屉中），然后每孔加入50μl的2M 硫酸终止反应。
结果与分析：
阴性——目测无色，在酶标仪上读数OD450nm 值小于0.1（第10列）；
阳性——目测黄色，OD450nm值3个重复的平均值大于0.2，且为阴性对照OD 值的2.0倍。
对照成立，以呈阳性反应孔的抗体的最高稀释倍数作为抗体的效价：
6.1号小鼠——待测鼠抗BSA 抗体的效价是1：400；
6号家兔——待测兔抗BSA 抗体的效价是1：64000。
讨论：
用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，引起
免疫应答，形成浆细胞，并分泌抗体。经三次免疫，血清中的抗体量达到要求浓
度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。得出待测抗体效价：待测6号鼠抗BSA 抗体的效价是1：400；待测6号兔抗BSA 抗体的效价是1：64000。另外通过对比得出，抗体效价可能与保存时间有关。参考文献